高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸
高效液相色谱法测定血浆同型半胱氨酸
郭健 肖飞 唐志毅
摘要 目的：建立测定血浆同型半胱氨酸的高效液相色谱(HPLC)方法。方法：血浆同型半胱氨酸经巯基乙醇还原后用碘乙酸封闭巯基，再与邻苯二甲醛(OPA)反应完成衍生化；以磺基同型半胱氨酸为内标，经C18反相柱进行色谱分离，荧光检测器测定结果。结果：测定线性范围达150 μmol/L，最低检测限为1.0 μmol/L，日内不精密度3.7%～4.2%；日间不精密度3.8%～4.3%；方法回收率93%～102%。结论：本方法可用于临床实验室测定血浆同型半胱氨酸水平。
关键词：同型半胱氨酸；邻苯二甲醛；高效液相色谱
, http://www.100md.com
同型半胱氨酸(HCY)为含巯基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。自60年代初在尿中首次被发现以来，同型半胱氨酸被认为与多种先天性代谢缺限有关，如胱硫醚β合成酶(EC4.2.1.22)缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿症的原因。最近，人们又发现高同型半胱氨酸血症是发生外周血管、脑血管和冠状动脉血管疾病的危险因素之一，这是因为同型半胱氨酸不仅可影响脂类代谢，还可通过多种其他途径诱发心血管疾病[1]。据调查，相当大比例的人群面临高同型半胱氨酸血症的危险，尤其是当食物中叶酸和维生素B12摄入不足时更是如此。这些说明，遗传因素、环境因素、叶酸及VB12摄取量都与同型半胱氨酸血症有关。
测定同型半胱氨酸的常用方法是高效液相色谱(HPLC)，对还原型同型半胱氨酸的荧光衍生物或使用电化学检测器直接测量。目前，同型半胱氨酸的测定方法还有荧光偏振免疫分析(FPIA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)。这两种方法是通过特异性的S腺苷同型半胱氨酸水解酶催化同型半胱氨酸转变为S腺苷同型半胱氨酸，再利用单克隆抗体技术进行检测。本实验在参考国外有关文献的基础上[2，3]，对样本处理和色谱条件进行了适当的改进，筛选出适宜的内标物，建产立了血浆同型半胱氨酸测定的HPLC方法，并已试用于临床。
, 百拇医药
材料与方法
一、仪器
Waters 510液相色谱泵，Shimadzu RF551荧光检测器，Waters Nova-Pak ODS色谱柱(3.9 mm×150 mm)及保护柱，PC800色谱工作站；Millipore过滤器及0.45 μm滤膜。
二、试剂
β巯基乙醇、同型半胱氨酸、碘乙酸、邻苯二甲醛(OPA)为Sigma公司产品；磺基同型半胱氨酸(Homocysteic acid)为Aldrich公司产品；四硼酸钠、乙腈(色谱纯)、乙酸钠、冰乙酸为北京化学试剂公司产品。上述化学试剂均为分析纯。3.4%碘乙酸工作液：碘乙酸3.4 g溶于0.5 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 11.0)100 ml。OPA衍生化试剂：OPA 60 mg溶于1.0 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 11.0)8 ml，加甲醇1 ml，巯基乙醇1 ml。
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三、流动相
流动相A：0.05 mol/L乙酸盐缓冲液，pH 6.8，含8%乙腈；流动相B：100% 乙腈。流动相在使用前需经Millipore过滤器处理。
四、内标
1.0 mmol/L磺基同型半胱氨酸水溶液。
五、样本采集与处理
样本采用EDTA抗凝的静脉血，样本采集后10 min内离心分离血浆(4℃，2 500 g×10 min)；如在8 h内不能完成分析，样本应置-20℃保存。样本前处理：取血浆150 μl，加入10%巯基乙醇水溶液10 μl及内标液4 μl，混匀，2 min后加入100 g/L三氯乙酸溶液100 μl，混匀，离心(5 000 g×15 min)。取离心上清液50 μl，加碘乙酸工作液50 μl，混匀；2 min后，加1.55 mol/L氢氧化钠溶液10 μl和OPA衍生化试剂40 μl，混匀；1 min后取5 μl进样分析。
, 百拇医药
六、色谱条件
样本分析采用梯度洗脱程序，初始状态：A相为100%，B相为0；第6～8 min：A相由100%降至10%，B相由0升至90%；第12～13 min：A相由10%升至100%，B相由90%降至0，恢复初始状态。泵流速为1.3 ml/min，荧光检测器的激发波长为335 nm，检测波长为455 nm。
结果
1.色谱结果：在上述色谱条件下，样本中的内标和同型半胱氨酸的保留时间分别为2.8和4.9 min，能与其他峰有效地分离(图1，2)。
2.检测限和线性范围：当以信噪比(S/N)=2为最低检出限时，本方法检测同型半胱氨酸的最低浓度为1 μmol/L。配制同型半胱氨酸浓度分别为6、15、30、75和150 μmol/L的样本进行测定，结果表明，同型半胱氨酸浓度在6～150 μmol/L范围内有良好的线性结果，r2为0.998 8(图3)。
, 百拇医药
3.精密度：取3份不同浓度的血浆样本，分别测定日内和日间重复性，结果表明，本方法的日内不精密度为3.7%～4.2%，日间不精密度为3.8%～4.3%(表1)。
图1 内标及Hcy标准品图谱(峰1：内标；峰2：同型半胱氨酸)
图2 血浆标本的图谱(峰1：内标；峰2：同型半胱氨酸)
, 百拇医药
图3 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸标准曲线
表1 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸精密度试验
样本
编号
日内不精密度(n=12)
日间不精密度(n=10)
x±s(μmol/L)
CV(%)
x±s(μmol/L)
CV(%)
1
, 百拇医药 12.3±0.52
4.2
13.3±0.57
4.3
2
54.7±2.24
4.1
55.8±2.32
4.2
3
106.7±3.92
3.7
105.8±4.03
, 百拇医药
3.8
4.回收率：在同一份样本中分别加入不同量的同型半胱氨酸进行测定，结果表明方法的回收率为93%～102%(表2)。
5.参考值范围：随机选取健康男性40人，女性40人，平均年龄36岁(年龄范围15～73岁)，测定血浆同型半胱氨酸浓度水平。结果表明，健康人血浆同型半胱氨酸浓度参考值范围为4.5～14.0 μmol/L(x±2s)，均值为9.3 μmol/L。
表2 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸回收率
样本
号
Hcy浓度(μmol/L)
回收率
, 百拇医药
(%)
原浓度
加入量
理论值
实测值
1
13.6
—
—
—
—
2
13.6
10
, 百拇医药
23.6
21.9
93
3
13.6
20
33.6
31.9
95
4
13.6
50
63.6
, 百拇医药
64.9
102
5
13.6
100
113.6
112.1
98.7
讨论
1.血浆同型半胱氨酸浓度测定近年来受到广泛重视，临床上可作为硬化性心血管疾病的危险指标，同型半胱氨酸浓度升高的程度与疾病的危险性成正比。根据同型半胱氨酸的代谢特点，维生素B12和叶酸缺乏、以及遗传性N5甲基四氢叶酸转甲基酶、胱硫醚-β-合成酶基因缺陷等与同型半胱氨酸浓度密切相关，这些因素与心血管疾病的关系正在研究之中。
, 百拇医药
2.由于同型半胱氨酸在体内约有70%以二硫键形式与蛋白质结合，故需用β巯基乙醇为还原剂，打开二硫键，此步反应30 s即可完成，在2 h内进行去蛋白操作不影响结果。
3.由于OPA衍生化产物的荧光强度与pH值有密切关系，故采用pH=11.0的硼酸盐缓冲液，并调高浓度，以增强其缓冲能力。在实验条件下，OPA衍生化产物可稳定30 min。
4.OPA作为氨基酸的衍生化试剂已有多年，方法成熟，其对氨基的衍生化速度快，样品准备时间短，衍生化反应的温度要求不高，成本较低，适合在国内推广应用。
作者单位：郭健(100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心)
肖飞(100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心)
唐志毅(100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心检验科)
, 百拇医药
参考文献
1，David A. Homocysteine vs cholesterol competing views, or a unifying explanation of arteriosclerotic cardiovascular disease? Lab Med, 1998,29:410-417.
2，Khim Kuo, Rachel Still, Sara Cale. Standardization (External and Internal) of HPLC assay for plasma homocysteine. Clin Chem, 1997,43:1653-1655.
3，Hyland K, Bottiglieri T. Measurement of total plasma and cerebrospinal fluid homocysteine by fluorescence following high-performance liquid chromatography and precolumn derivatization with o-phthaldialdehyde. J Chromatogr, 1992,579:55-62., http://www.100md.com
郭健 肖飞 唐志毅
摘要 目的：建立测定血浆同型半胱氨酸的高效液相色谱(HPLC)方法。方法：血浆同型半胱氨酸经巯基乙醇还原后用碘乙酸封闭巯基，再与邻苯二甲醛(OPA)反应完成衍生化；以磺基同型半胱氨酸为内标，经C18反相柱进行色谱分离，荧光检测器测定结果。结果：测定线性范围达150 μmol/L，最低检测限为1.0 μmol/L，日内不精密度3.7%～4.2%；日间不精密度3.8%～4.3%；方法回收率93%～102%。结论：本方法可用于临床实验室测定血浆同型半胱氨酸水平。
关键词：同型半胱氨酸；邻苯二甲醛；高效液相色谱
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同型半胱氨酸(HCY)为含巯基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸转硫化和甲基化代谢旁路中形成的中间体。自60年代初在尿中首次被发现以来，同型半胱氨酸被认为与多种先天性代谢缺限有关，如胱硫醚β合成酶(EC4.2.1.22)缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿症的原因。最近，人们又发现高同型半胱氨酸血症是发生外周血管、脑血管和冠状动脉血管疾病的危险因素之一，这是因为同型半胱氨酸不仅可影响脂类代谢，还可通过多种其他途径诱发心血管疾病[1]。据调查，相当大比例的人群面临高同型半胱氨酸血症的危险，尤其是当食物中叶酸和维生素B12摄入不足时更是如此。这些说明，遗传因素、环境因素、叶酸及VB12摄取量都与同型半胱氨酸血症有关。
测定同型半胱氨酸的常用方法是高效液相色谱(HPLC)，对还原型同型半胱氨酸的荧光衍生物或使用电化学检测器直接测量。目前，同型半胱氨酸的测定方法还有荧光偏振免疫分析(FPIA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)。这两种方法是通过特异性的S腺苷同型半胱氨酸水解酶催化同型半胱氨酸转变为S腺苷同型半胱氨酸，再利用单克隆抗体技术进行检测。本实验在参考国外有关文献的基础上[2，3]，对样本处理和色谱条件进行了适当的改进，筛选出适宜的内标物，建产立了血浆同型半胱氨酸测定的HPLC方法，并已试用于临床。
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材料与方法
一、仪器
Waters 510液相色谱泵，Shimadzu RF551荧光检测器，Waters Nova-Pak ODS色谱柱(3.9 mm×150 mm)及保护柱，PC800色谱工作站；Millipore过滤器及0.45 μm滤膜。
二、试剂
β巯基乙醇、同型半胱氨酸、碘乙酸、邻苯二甲醛(OPA)为Sigma公司产品；磺基同型半胱氨酸(Homocysteic acid)为Aldrich公司产品；四硼酸钠、乙腈(色谱纯)、乙酸钠、冰乙酸为北京化学试剂公司产品。上述化学试剂均为分析纯。3.4%碘乙酸工作液：碘乙酸3.4 g溶于0.5 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 11.0)100 ml。OPA衍生化试剂：OPA 60 mg溶于1.0 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 11.0)8 ml，加甲醇1 ml，巯基乙醇1 ml。
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三、流动相
流动相A：0.05 mol/L乙酸盐缓冲液，pH 6.8，含8%乙腈；流动相B：100% 乙腈。流动相在使用前需经Millipore过滤器处理。
四、内标
1.0 mmol/L磺基同型半胱氨酸水溶液。
五、样本采集与处理
样本采用EDTA抗凝的静脉血，样本采集后10 min内离心分离血浆(4℃，2 500 g×10 min)；如在8 h内不能完成分析，样本应置-20℃保存。样本前处理：取血浆150 μl，加入10%巯基乙醇水溶液10 μl及内标液4 μl，混匀，2 min后加入100 g/L三氯乙酸溶液100 μl，混匀，离心(5 000 g×15 min)。取离心上清液50 μl，加碘乙酸工作液50 μl，混匀；2 min后，加1.55 mol/L氢氧化钠溶液10 μl和OPA衍生化试剂40 μl，混匀；1 min后取5 μl进样分析。
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六、色谱条件
样本分析采用梯度洗脱程序，初始状态：A相为100%，B相为0；第6～8 min：A相由100%降至10%，B相由0升至90%；第12～13 min：A相由10%升至100%，B相由90%降至0，恢复初始状态。泵流速为1.3 ml/min，荧光检测器的激发波长为335 nm，检测波长为455 nm。
结果
1.色谱结果：在上述色谱条件下，样本中的内标和同型半胱氨酸的保留时间分别为2.8和4.9 min，能与其他峰有效地分离(图1，2)。
2.检测限和线性范围：当以信噪比(S/N)=2为最低检出限时，本方法检测同型半胱氨酸的最低浓度为1 μmol/L。配制同型半胱氨酸浓度分别为6、15、30、75和150 μmol/L的样本进行测定，结果表明，同型半胱氨酸浓度在6～150 μmol/L范围内有良好的线性结果，r2为0.998 8(图3)。
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3.精密度：取3份不同浓度的血浆样本，分别测定日内和日间重复性，结果表明，本方法的日内不精密度为3.7%～4.2%，日间不精密度为3.8%～4.3%(表1)。
图1 内标及Hcy标准品图谱(峰1：内标；峰2：同型半胱氨酸)
图2 血浆标本的图谱(峰1：内标；峰2：同型半胱氨酸)
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图3 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸标准曲线
表1 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸精密度试验
样本
编号
日内不精密度(n=12)
日间不精密度(n=10)
x±s(μmol/L)
CV(%)
x±s(μmol/L)
CV(%)
1
, 百拇医药 12.3±0.52
4.2
13.3±0.57
4.3
2
54.7±2.24
4.1
55.8±2.32
4.2
3
106.7±3.92
3.7
105.8±4.03
, 百拇医药
3.8
4.回收率：在同一份样本中分别加入不同量的同型半胱氨酸进行测定，结果表明方法的回收率为93%～102%(表2)。
5.参考值范围：随机选取健康男性40人，女性40人，平均年龄36岁(年龄范围15～73岁)，测定血浆同型半胱氨酸浓度水平。结果表明，健康人血浆同型半胱氨酸浓度参考值范围为4.5～14.0 μmol/L(x±2s)，均值为9.3 μmol/L。
表2 HPLC法测定血浆同型半胱氨酸回收率
样本
号
Hcy浓度(μmol/L)
回收率
, 百拇医药
(%)
原浓度
加入量
理论值
实测值
1
13.6
—
—
—
—
2
13.6
10
, 百拇医药
23.6
21.9
93
3
13.6
20
33.6
31.9
95
4
13.6
50
63.6
, 百拇医药
64.9
102
5
13.6
100
113.6
112.1
98.7
讨论
1.血浆同型半胱氨酸浓度测定近年来受到广泛重视，临床上可作为硬化性心血管疾病的危险指标，同型半胱氨酸浓度升高的程度与疾病的危险性成正比。根据同型半胱氨酸的代谢特点，维生素B12和叶酸缺乏、以及遗传性N5甲基四氢叶酸转甲基酶、胱硫醚-β-合成酶基因缺陷等与同型半胱氨酸浓度密切相关，这些因素与心血管疾病的关系正在研究之中。
, 百拇医药
2.由于同型半胱氨酸在体内约有70%以二硫键形式与蛋白质结合，故需用β巯基乙醇为还原剂，打开二硫键，此步反应30 s即可完成，在2 h内进行去蛋白操作不影响结果。
3.由于OPA衍生化产物的荧光强度与pH值有密切关系，故采用pH=11.0的硼酸盐缓冲液，并调高浓度，以增强其缓冲能力。在实验条件下，OPA衍生化产物可稳定30 min。
4.OPA作为氨基酸的衍生化试剂已有多年，方法成熟，其对氨基的衍生化速度快，样品准备时间短，衍生化反应的温度要求不高，成本较低，适合在国内推广应用。
作者单位：郭健(100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心)
肖飞(100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心)
唐志毅(100730 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心检验科)
, 百拇医药
参考文献
1，David A. Homocysteine vs cholesterol competing views, or a unifying explanation of arteriosclerotic cardiovascular disease? Lab Med, 1998,29:410-417.
2，Khim Kuo, Rachel Still, Sara Cale. Standardization (External and Internal) of HPLC assay for plasma homocysteine. Clin Chem, 1997,43:1653-1655.
3，Hyland K, Bottiglieri T. Measurement of total plasma and cerebrospinal fluid homocysteine by fluorescence following high-performance liquid chromatography and precolumn derivatization with o-phthaldialdehyde. J Chromatogr, 1992,579:55-62., http://www.100md.com