异种造血嵌合体形成过程中的病理观察
异种造血嵌合体形成过程中的病理观察
胡军 蔡振杰 王晓武 何显力 管德林 胡巧侠
摘 要： 目的 了解大鼠→兔异种造血嵌合体模型建立过程中受体兔体内的病理变化情况. 方法 Wister大鼠胸腺组织块及骨髓细胞移植给4～5月龄雄性新西兰兔，于移植后50，80，100，150 d，取受体兔的脏器标本，做HE染色，胶原纤维染色(VG)及常规刚果红染色. 结果 虽然受体兔一般情况良好，无移植物抗宿主病(GVHD)的表现，但自骨髓移植后GVHR一直在受体体内发生着，并于移植后50，80 d的炎症反应较重；100，150 d时炎症反应较轻. 结论 该模型建立过程中受体兔体内发生了自限性GVHR.
关键词：骨髓移植；移植物抗宿主反应；免疫病理
, http://www.100md.com
0 引言
以前我们介绍了通过胸腺、骨髓联合移植建立大鼠→兔异种造血嵌合体的方法[1]. 通过该方法建立的大鼠→兔异种造血嵌合体,受体兔一般情况良好,未观察到明显的移植物抗宿主病(GVHD)表现. 骨髓移植1 mo后连续观察受体兔的体质量,证明受体生长无明显异常. 但从我们对其动态病理的观察来看,受体兔体内仍有急性移植物抗宿主反应(GVHR)的表现.
1 材料和方法
1.1 动物 供体为Wistar大鼠,雌性,体质量200～250 g；受体为雄性新西兰兔,4～5月龄,均由本校实验动物中心提供.
1.2 方法 按我们先前报道的方法[1]，把大鼠胸腺、骨髓联合移植给经去脾、去胸腺及环磷酰胺处理的受体新西兰兔. 大鼠胸腺剪成3 mm×3 mm×3 mm组织块,每只兔约移植大鼠胸腺8～9块，分三处埋于受体兔颈背部皮下. 大鼠骨髓制成约2×1011个细胞.L-1的细胞悬液,按每公斤体质量1～2 mL经兔胫骨骨髓腔注入受体兔体内. 对照兔经同样预处理，但不移植大鼠的胸腺和骨髓. 移植前后饲养条件不变. 分别于移植后50,80,100及150 d各杀一只兔取前腿内侧皮、肝、十二指肠、肺、肾及移植15 mo后的兔肝，100 mL.L-1甲醛溶液固定，4℃保存备检. 常规脱水,透明,渗蜡,包埋,制片及HE染色. 刚果红染色：常规石蜡切片，脱蜡至水、苏木精染5 min, 盐酸乙醇分化30 s, 氨水返蓝30 s, 自来水洗5 min, 刚果红染色10～20 min, 700 mL.L-1乙醇分化30 s, 脱水、透明、封片. 胶原纤维染色法(VG染色)：石蜡切片、脱蜡至水、铁苏木精染色5 min，水洗、盐酸乙醇分化、VG液染色5 min (VG液：10 mL.L-1酸性复红1份，苦味酸9份)、950 mL.L-1乙醇分化、脱水，透明，封片.
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图1 50 d实验兔皮：皮下水肿，少量炎细胞浸润
Fig 1 50 d after transplantation, hypodermis edema, a few inflammatory cells infiltration HE ×100
图2 50 d实验兔肝：有灶性坏死，肝细胞嗜酸性变、核固缩，中性粒细胞浸润
Fig 2 50 d after transplantation, focal necrosis, hepatocyte acidophil degeneration, karyopyknosis, neutrophil infiltration in recipients' liver HE ×200
, http://www.100md.com
图3 80 d实验兔皮：皮下水肿，较多淋巴细胞浸润
Fig 3 80 d after transplantation, edema under skin, more lymphocytes infiltration HE ×100
图4 80 d实验兔肝：肝脏淀粉样变，有较多炎细胞浸润，嗜酸细胞可见
Fig 4 80 d after transplantation, more inflammatory cells including acidophil cells infiltration, amyloid degeneration in the recipients' liver HE ×200
, 百拇医药
图5 80 d实验兔十二指肠：肠粘膜有较多淋巴细胞浸润
Fig 5 80 d after transplantation, serious lymphocytes infiltration in the small intestine mucosa HE ×200
图6 150 d实验兔皮：皮肤过度角化
Fig 6 150 d after transplantation， hyperkeratinization in the skin HE ×200
, 百拇医药
图7 150 d实验兔肝：灶性坏死，肝细胞退行性变，汇管区少量淋巴细胞浸润
Fig 7 150 d after transplantation, focal liver necrosis, hepatocyte degeneration, few lymphocytes infiltration in portal track HE ×100
图8 15 mo实验兔肝：汇管区结缔组织轻度增生
Fig 8 15 mo after transplantation, slight fibrosis in portal track in rabbit liver VG ×200
, 百拇医药 2 结果
2.1 50 d兔的病理变化 HE染色片镜下可见,皮肤大致正常,皮下水肿(Fig 1),少量炎细胞浸润,肝脏中央静脉及肝窦扩张充血,少量炎细胞浸润,有较多的灶性坏死,不少肝细胞出现嗜酸性变,核固缩(Fig 2). 肾小管细胞轻度肿胀变性. 十二指肠除淋巴细胞浸润明显,轻度水肿外,小肠腺体结构基本正常,未见出血及其他严重病变. 心、肺未见明显异常.
2.2 80 d兔的病理变化 该兔皮肤明显过度角化,甚至附件内部出现角质栓,皮下明显水肿有较多淋巴细胞浸润,有些淋巴细胞在汗腺旁甚至集结成团(Fig 3). 肝脏有较多炎细胞浸润，其中可见嗜酸细胞(Fig 4)，肝中央静脉及肝血窦扩张充血明显,肝实质萎缩,经刚果红染色发现有淀粉样变. 该兔十二指肠粘膜有大量淋巴细胞浸润(Fig 5),小肠部分腺体结构消失,粘膜下有轻度水肿,但未见明显出血；肾脏可见肾小球基质增生，并有少许炎细胞浸润，肾小管细胞变性. 肺脏可见炎细胞浸润，肺泡壁轻度增厚；心脏未见明显异常.
, 百拇医药
2.3 100 d兔的病理变化 该兔皮肤及十二指肠除有轻度炎细胞浸润外未见明显异常. 肝脏明显充血；肾小管上皮细胞轻度混浊肿胀,颗粒样变性. 其他心、肺未见明显异常.
2.4 150 d兔的病理变化 皮肤过度角化明显,皮下有少量炎细胞浸润(Fig 6). 肝脏汇管区有少量淋巴细胞浸润,肝细胞出现退行性变,灶性坏死可见(Fig 7). 心、肺、肾、肠除可见少量炎细胞浸润外结构大致正常.
2.5 15 mo兔(1号兔)的肝脏病理 该兔肝脏除见汇管区结缔组织增生(Fig 8),肝小叶结构不清，中央静脉少见外，未见肝硬变及由于肝脏坏死导致肝重建形成的假小叶或结缔组织结节.
3 讨论
大鼠→兔异种造血嵌合体模型,是我们为适应临床应用而建立的一个异种骨髓移植模型. 在大鼠胸腺、骨髓移植前,我们通过去除受体兔的胸腺和脾脏及用环磷酰胺(50 mg.kg-1)处理代替致死量X线照射,在大鼠胸腺、骨髓移植给受体兔后，除第5日注射1次抗兔淋巴细胞γ球蛋白外不再使用任何免疫抑制剂；结果，移植后受体兔一般情况良好，无腹泻，脱毛等现象，体质量逐渐增加与对照组相比生长无明显异常,似乎无GVHD发生[1]. 但从对骨髓移植后不同时间兔的病理观察结果看,自骨髓移植后，GVHR一直在受者体内发生着，只是GVHR较轻，不影响实验兔存活而已.
, 百拇医药
从其动态观察结果看,50和80 d兔的病变较重,100和150 d兔的病变较轻,虽由于例数较少,不能作为一个规律,但结合整个实验中所有实验兔的一般情况看,该模型中GVHR的发生并非逐渐加重而导致死亡,它似乎是自限性的,推测其原因可能是:①在胸腺骨髓移植前,通过去脾和4次环磷酰胺处理受体，仅是对受体免疫活性细胞的一时性抑制,而不象用射线照射受体那样是对受体兔免疫活性细胞的彻底清除,骨髓移植后不使用免疫抑制剂,使受体的免疫活性细胞迅速恢复功能,可与外来的大鼠免疫活性细胞相互作用,抑制大鼠免疫活性细胞的功能,从而减轻了大鼠免疫细胞对受体兔的攻击. ②移植的大鼠骨髓是全骨髓细胞,里面包含了大鼠大量的免疫活性细胞;大量免疫活性细胞的存在可能是该方法造成大鼠→兔骨髓移植能够成功的一个重要因素. ③据报道,胸腺对免疫反应具有双向调节作用,移植胸腺对GVHR的调节作用可能也影响该模型中GVHD的发展. ④从我们在模型建立过程中的观察，结合许多异种骨髓移植模型建立的观察报告发现[2-4],在异种骨髓移植模型中,自身骨髓细胞总有一种生长优势,无论用什么方法，开始形成嵌合体时供体细胞占多大比例,以后或快或慢,其供体细胞比例均是逐渐减少,受体对异种供体细胞生长似乎有某种限制,这一点可能也是造成该模型中GVHR逐渐减轻的一个重要因素.
, 百拇医药
移植45 d后，1号兔体内大鼠细胞嵌合比例最高达60.9%,根据另4只兔的病理结果,我们认为兔1在接受移植后肯定发生过GVHD,且比我们已观察到的这4只兔的病理变化重,但15 mo后其肝脏结构基本正常,未见肝硬变及结缔组织节结形成,未留下灶性或片状坏死逐渐加重所致的病理证象. 由此我们认为,在该模型建立过程中,GVHD造成的肝脏改变可能是可逆的.
从本病理观察及已报告的异种造血嵌合体的长期嵌合结果看,通过胸腺、骨髓联合移植是建立异种造血嵌合体的较好方法.
致 谢 病理学教研室马福成高级实验师、 胡佩珍技师、 晏培松、 刘彦仿、 韩云龙、 黄高升教授等在制片、 组化染色、 阅片、 照相、 病理及组化结果分析等方面给予帮助和指导.
作者简介：胡 军(1962-)， 男(汉族)， 河南省确山县人. 博士, 讲师.
Tel.(029)3373662(H);3375314(O) Email. Hujun@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
胡军(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
蔡振杰(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
王晓武(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
何显力(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
管德林(首都医科大学朝阳医院泌尿科)
胡巧侠(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
参考文献：
[1] Hu J, Cai ZJ, Wang XW et al. Establishment of a disparate hematopoietic chimera model and its immunoloical features [J]. 第四军医大学报， 1999; 20(9):763-766.
, 百拇医药
[2] Sharabi Y, Aksentijevich I, Sundt TM et al. Specific tolerance indution across a xenogeneic barrier: Production of mixed rat/mouse lymphohematopoietic chimeras using a nonlethal preparative regimen [J]. J Exp Med， 1990;172(1):195-202.
[3] Ildstad ST, Wren SM, Boggs SS et al. Cross species bone marrow transplantation: Evidence for tolerance induction, stem cell engraftment, and maturation of T lymphocytes in a xenogeneic stromal environment (rat→mouse) [J]. J Exp Med， 1991;174(2):467-478.
[4] Kline GM, Shen Z, Mohiuddin M et al. Successful experimental heart transplantation without immunosuppressive drugs [J]. J Heart Lung Transplant， 1993;12(3):388-393., http://www.100md.com
胡军 蔡振杰 王晓武 何显力 管德林 胡巧侠
摘 要： 目的 了解大鼠→兔异种造血嵌合体模型建立过程中受体兔体内的病理变化情况. 方法 Wister大鼠胸腺组织块及骨髓细胞移植给4～5月龄雄性新西兰兔，于移植后50，80，100，150 d，取受体兔的脏器标本，做HE染色，胶原纤维染色(VG)及常规刚果红染色. 结果 虽然受体兔一般情况良好，无移植物抗宿主病(GVHD)的表现，但自骨髓移植后GVHR一直在受体体内发生着，并于移植后50，80 d的炎症反应较重；100，150 d时炎症反应较轻. 结论 该模型建立过程中受体兔体内发生了自限性GVHR.
关键词：骨髓移植；移植物抗宿主反应；免疫病理
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0 引言
以前我们介绍了通过胸腺、骨髓联合移植建立大鼠→兔异种造血嵌合体的方法[1]. 通过该方法建立的大鼠→兔异种造血嵌合体,受体兔一般情况良好,未观察到明显的移植物抗宿主病(GVHD)表现. 骨髓移植1 mo后连续观察受体兔的体质量,证明受体生长无明显异常. 但从我们对其动态病理的观察来看,受体兔体内仍有急性移植物抗宿主反应(GVHR)的表现.
1 材料和方法
1.1 动物 供体为Wistar大鼠,雌性,体质量200～250 g；受体为雄性新西兰兔,4～5月龄,均由本校实验动物中心提供.
1.2 方法 按我们先前报道的方法[1]，把大鼠胸腺、骨髓联合移植给经去脾、去胸腺及环磷酰胺处理的受体新西兰兔. 大鼠胸腺剪成3 mm×3 mm×3 mm组织块,每只兔约移植大鼠胸腺8～9块，分三处埋于受体兔颈背部皮下. 大鼠骨髓制成约2×1011个细胞.L-1的细胞悬液,按每公斤体质量1～2 mL经兔胫骨骨髓腔注入受体兔体内. 对照兔经同样预处理，但不移植大鼠的胸腺和骨髓. 移植前后饲养条件不变. 分别于移植后50,80,100及150 d各杀一只兔取前腿内侧皮、肝、十二指肠、肺、肾及移植15 mo后的兔肝，100 mL.L-1甲醛溶液固定，4℃保存备检. 常规脱水,透明,渗蜡,包埋,制片及HE染色. 刚果红染色：常规石蜡切片，脱蜡至水、苏木精染5 min, 盐酸乙醇分化30 s, 氨水返蓝30 s, 自来水洗5 min, 刚果红染色10～20 min, 700 mL.L-1乙醇分化30 s, 脱水、透明、封片. 胶原纤维染色法(VG染色)：石蜡切片、脱蜡至水、铁苏木精染色5 min，水洗、盐酸乙醇分化、VG液染色5 min (VG液：10 mL.L-1酸性复红1份，苦味酸9份)、950 mL.L-1乙醇分化、脱水，透明，封片.
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图1 50 d实验兔皮：皮下水肿，少量炎细胞浸润
Fig 1 50 d after transplantation, hypodermis edema, a few inflammatory cells infiltration HE ×100
图2 50 d实验兔肝：有灶性坏死，肝细胞嗜酸性变、核固缩，中性粒细胞浸润
Fig 2 50 d after transplantation, focal necrosis, hepatocyte acidophil degeneration, karyopyknosis, neutrophil infiltration in recipients' liver HE ×200
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图3 80 d实验兔皮：皮下水肿，较多淋巴细胞浸润
Fig 3 80 d after transplantation, edema under skin, more lymphocytes infiltration HE ×100
图4 80 d实验兔肝：肝脏淀粉样变，有较多炎细胞浸润，嗜酸细胞可见
Fig 4 80 d after transplantation, more inflammatory cells including acidophil cells infiltration, amyloid degeneration in the recipients' liver HE ×200
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图5 80 d实验兔十二指肠：肠粘膜有较多淋巴细胞浸润
Fig 5 80 d after transplantation, serious lymphocytes infiltration in the small intestine mucosa HE ×200
图6 150 d实验兔皮：皮肤过度角化
Fig 6 150 d after transplantation， hyperkeratinization in the skin HE ×200
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图7 150 d实验兔肝：灶性坏死，肝细胞退行性变，汇管区少量淋巴细胞浸润
Fig 7 150 d after transplantation, focal liver necrosis, hepatocyte degeneration, few lymphocytes infiltration in portal track HE ×100
图8 15 mo实验兔肝：汇管区结缔组织轻度增生
Fig 8 15 mo after transplantation, slight fibrosis in portal track in rabbit liver VG ×200
, 百拇医药 2 结果
2.1 50 d兔的病理变化 HE染色片镜下可见,皮肤大致正常,皮下水肿(Fig 1),少量炎细胞浸润,肝脏中央静脉及肝窦扩张充血,少量炎细胞浸润,有较多的灶性坏死,不少肝细胞出现嗜酸性变,核固缩(Fig 2). 肾小管细胞轻度肿胀变性. 十二指肠除淋巴细胞浸润明显,轻度水肿外,小肠腺体结构基本正常,未见出血及其他严重病变. 心、肺未见明显异常.
2.2 80 d兔的病理变化 该兔皮肤明显过度角化,甚至附件内部出现角质栓,皮下明显水肿有较多淋巴细胞浸润,有些淋巴细胞在汗腺旁甚至集结成团(Fig 3). 肝脏有较多炎细胞浸润，其中可见嗜酸细胞(Fig 4)，肝中央静脉及肝血窦扩张充血明显,肝实质萎缩,经刚果红染色发现有淀粉样变. 该兔十二指肠粘膜有大量淋巴细胞浸润(Fig 5),小肠部分腺体结构消失,粘膜下有轻度水肿,但未见明显出血；肾脏可见肾小球基质增生，并有少许炎细胞浸润，肾小管细胞变性. 肺脏可见炎细胞浸润，肺泡壁轻度增厚；心脏未见明显异常.
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2.3 100 d兔的病理变化 该兔皮肤及十二指肠除有轻度炎细胞浸润外未见明显异常. 肝脏明显充血；肾小管上皮细胞轻度混浊肿胀,颗粒样变性. 其他心、肺未见明显异常.
2.4 150 d兔的病理变化 皮肤过度角化明显,皮下有少量炎细胞浸润(Fig 6). 肝脏汇管区有少量淋巴细胞浸润,肝细胞出现退行性变,灶性坏死可见(Fig 7). 心、肺、肾、肠除可见少量炎细胞浸润外结构大致正常.
2.5 15 mo兔(1号兔)的肝脏病理 该兔肝脏除见汇管区结缔组织增生(Fig 8),肝小叶结构不清，中央静脉少见外，未见肝硬变及由于肝脏坏死导致肝重建形成的假小叶或结缔组织结节.
3 讨论
大鼠→兔异种造血嵌合体模型,是我们为适应临床应用而建立的一个异种骨髓移植模型. 在大鼠胸腺、骨髓移植前,我们通过去除受体兔的胸腺和脾脏及用环磷酰胺(50 mg.kg-1)处理代替致死量X线照射,在大鼠胸腺、骨髓移植给受体兔后，除第5日注射1次抗兔淋巴细胞γ球蛋白外不再使用任何免疫抑制剂；结果，移植后受体兔一般情况良好，无腹泻，脱毛等现象，体质量逐渐增加与对照组相比生长无明显异常,似乎无GVHD发生[1]. 但从对骨髓移植后不同时间兔的病理观察结果看,自骨髓移植后，GVHR一直在受者体内发生着，只是GVHR较轻，不影响实验兔存活而已.
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从其动态观察结果看,50和80 d兔的病变较重,100和150 d兔的病变较轻,虽由于例数较少,不能作为一个规律,但结合整个实验中所有实验兔的一般情况看,该模型中GVHR的发生并非逐渐加重而导致死亡,它似乎是自限性的,推测其原因可能是:①在胸腺骨髓移植前,通过去脾和4次环磷酰胺处理受体，仅是对受体免疫活性细胞的一时性抑制,而不象用射线照射受体那样是对受体兔免疫活性细胞的彻底清除,骨髓移植后不使用免疫抑制剂,使受体的免疫活性细胞迅速恢复功能,可与外来的大鼠免疫活性细胞相互作用,抑制大鼠免疫活性细胞的功能,从而减轻了大鼠免疫细胞对受体兔的攻击. ②移植的大鼠骨髓是全骨髓细胞,里面包含了大鼠大量的免疫活性细胞;大量免疫活性细胞的存在可能是该方法造成大鼠→兔骨髓移植能够成功的一个重要因素. ③据报道,胸腺对免疫反应具有双向调节作用,移植胸腺对GVHR的调节作用可能也影响该模型中GVHD的发展. ④从我们在模型建立过程中的观察，结合许多异种骨髓移植模型建立的观察报告发现[2-4],在异种骨髓移植模型中,自身骨髓细胞总有一种生长优势,无论用什么方法，开始形成嵌合体时供体细胞占多大比例,以后或快或慢,其供体细胞比例均是逐渐减少,受体对异种供体细胞生长似乎有某种限制,这一点可能也是造成该模型中GVHR逐渐减轻的一个重要因素.
, 百拇医药
移植45 d后，1号兔体内大鼠细胞嵌合比例最高达60.9%,根据另4只兔的病理结果,我们认为兔1在接受移植后肯定发生过GVHD,且比我们已观察到的这4只兔的病理变化重,但15 mo后其肝脏结构基本正常,未见肝硬变及结缔组织节结形成,未留下灶性或片状坏死逐渐加重所致的病理证象. 由此我们认为,在该模型建立过程中,GVHD造成的肝脏改变可能是可逆的.
从本病理观察及已报告的异种造血嵌合体的长期嵌合结果看,通过胸腺、骨髓联合移植是建立异种造血嵌合体的较好方法.
致 谢 病理学教研室马福成高级实验师、 胡佩珍技师、 晏培松、 刘彦仿、 韩云龙、 黄高升教授等在制片、 组化染色、 阅片、 照相、 病理及组化结果分析等方面给予帮助和指导.
作者简介：胡 军(1962-)， 男(汉族)， 河南省确山县人. 博士, 讲师.
Tel.(029)3373662(H);3375314(O) Email. Hujun@fmmu.edu.cn
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胡军(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
蔡振杰(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
王晓武(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
何显力(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
管德林(首都医科大学朝阳医院泌尿科)
胡巧侠(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
参考文献：
[1] Hu J, Cai ZJ, Wang XW et al. Establishment of a disparate hematopoietic chimera model and its immunoloical features [J]. 第四军医大学报， 1999; 20(9):763-766.
, 百拇医药
[2] Sharabi Y, Aksentijevich I, Sundt TM et al. Specific tolerance indution across a xenogeneic barrier: Production of mixed rat/mouse lymphohematopoietic chimeras using a nonlethal preparative regimen [J]. J Exp Med， 1990;172(1):195-202.
[3] Ildstad ST, Wren SM, Boggs SS et al. Cross species bone marrow transplantation: Evidence for tolerance induction, stem cell engraftment, and maturation of T lymphocytes in a xenogeneic stromal environment (rat→mouse) [J]. J Exp Med， 1991;174(2):467-478.
[4] Kline GM, Shen Z, Mohiuddin M et al. Successful experimental heart transplantation without immunosuppressive drugs [J]. J Heart Lung Transplant， 1993;12(3):388-393., http://www.100md.com