静脉注射脂多糖和小剂量肾上腺素后血脑屏障的开放
静脉注射脂多糖和小剂量肾上腺素后血脑屏障的开放
邝芳 王百忍 鞠躬
摘 要：目的 为了解机体免疫系统受激发的状态下血脑屏障能否开放及血压升高对此过程的影响. 方法 以大肠杆菌来源的脂多糖LPS为免疫刺激物，或(和)给以单独给药时不能开放血脑屏障的小剂量(3μg.kg-1)肾上腺素，以伊文思蓝为血脑屏障开放的指示剂进行研究. 结果 大剂量(250μg.kg-1)LPS和3μg.kg-1肾上腺素分别单独注射不能使血脑屏障开放；而静脉注射LPS 3 h后再给予同样剂量的肾上腺素，则可开放血脑屏障. 结论 在LPS激发的免疫状态下，血脑屏障的开放阈降低，更易于受其他因素影响而开放.本研究为免疫信息分子通过血脑屏障开放传入脑内的假说提供了一个佐证.
关键词：血脑屏障；肾上腺素；脂多糖类
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0 引言
免疫系统与中枢神经系统(central nervous system, CNS)之间因血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的存在而使血液中的免疫分子肽类,难以直接进入脑内[1 ]，因而免疫信息如何传递到CNS仍是神经免疫调节学研究中悬而未决的问题之一.
革兰氏阴性细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可激发免疫细胞产生多种细胞因子. 近年的研究表明，外周给予LPS可引发复杂多样的脑内事件[2,3]. 已 有研究表明LPS对BBB的通透性有不同程度的影响，但目前研究仅见于脑膜炎模型、内毒素休克或体外研究[4-6]. 我们选用250 μg.kg-1的LPS一次性静脉注射，旨 在模拟常见的感染状态，又不致于导致内毒素休克，观察在这种状态下和累加小剂量肾上腺素(adrenaline, AD)注射引起一过性血压升高时BBB的开放状况，为搞清自然感染状态下细胞因子可否通过一过性开放的BBB入脑提供证据. 本研究中BBB开放情况用伊文思蓝(Evans blue, EB)作为指示剂来显示.
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1 材料和方法
1.1 动物和试剂 上海雄性SD大鼠，体质量200～300 g，本校实验动物中心 提供. LPS，E.coli 0127:B8，美国Sigma公司. 盐酸肾上腺素，西安制药厂出品. 伊文思蓝,西德S erva公司进口分装.
1.2 动物分组 将12只大鼠随机分为3组，每组4只. 第 1组，LPS组；第2组，LPS累加AD组；第3组，AD组.
1.3 方法 3组动物用4 g.L-1戊巴比妥钠i p麻醉(40 mg.kg-1)，切开左下肢内侧皮肤，行左股静脉穿刺，分别注射：第1组，LPS 250 μg.kg-1；第2组 ，LPS 250 μg.kg-1; 第3组，生理盐水 0.5 mL.kg-1， 5 min后各组均iv 20 g.L-1 EB生理盐水溶液4 mL.kg-1，并缝合伤口. 动物清醒后不限制饮食. 3 h后第2次麻醉,方法同 前. 切开另一侧下肢内侧皮肤，同右股静脉注射；第1组，生理盐水0.5 mL.kg-1；第2组，A D 3 μg.kg-1；第3组，AD 3 μg.kg-1. 轻压迫止血，20 min后，所有动物均以生理盐水500 m L/只灌流，取全脑，冻存于-20℃ 4～5 h，用恒冷箱作冠状连续切片，片厚30 μm，隔6片取1片，直接贴于载玻片上，于荧光显微镜下，B激发状态观察.
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2 结果
2.1 大体观察结果 注射LPS的第1, 2组动物清醒后活动较少，竖毛明 显，有的出现胸部、肢端轻度颤抖，但对震动、声音、触摸等刺激反应良好. 取材时肉眼可见3组动物的松果体、最后区等处均一蓝染，其余脑组织看不出蓝染现象.
2.2 荧光镜检结果 荧光显微镜下，3组均可见最后区、松 果体等无BBB的室周器官呈边界清晰、染色均匀的红色区域，但在其余脑区BBB的开放程度不同(Fig 1). 第 1组，(LPS+生理盐水)4例中仅有1例在丘脑前核平面上可见2个红色光斑，其余未见染色. 第2组(LPS+AD)光斑数量显著增加，脑干各平面均可见一些卵圆形红色光斑(Fig 2-A)，在下丘可见3～4个/切片，下丘脑、视前区更多，下丘脑每平面每张切片 有光斑10个左右，尾壳核1～2/个切片，皮层较少. 第3组(生理盐水+AD)各脑区未见光斑(Fig 2-B).
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图1 3组动物的处理和BBB的开放情况
Fig 1 Treatment on three groups of animals and the effect on BBB opening cond ition
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图2 BBB的开放情况(尾壳核平面)
Fig 2 States of BBB's opening on caudate-putamen level
(A) Group 2, BBB was opened moderately; (B) Group 3, BBB was not opened. ×100
3 讨论
大量研究结果显示，免疫信息传入CNS可能有几种途径，①免疫分子作用于外周神经末稍，将信号传入CNS[7]；②细胞因子通过缺乏BBB的室周器 官[8]；③细胞因子作用于脑膜小胶质细胞影响前列腺素合成，引起次级信号物质生成而触发一系列信号传递[9]；④经BBB的可饱和转运系统将细胞因子送入脑内[ 10]等等. 这些理论有一定的依据，也都存在各自的缺陷或矛盾的实验结果，尤其是免疫分子进入CNS的量相当少，使人们对这些途径的重要性发生怀疑[11].
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已知LPS在3 h内可激发免疫系统产生大量的多种细胞因子. 即注射LPS 3 h后机体免疫系统处于激发状态，并可引起脑内某些特异性核团的免疫组织化学改变，以及影响下丘脑-垂体-肾上腺轴(H-P-A轴)的活动[2,3,8]. 可见CNS对LP S激发外周免疫分子产生这一事件及有关系统的活动进行调控. 体外研究提示，LPS能够降低培养的牛内皮细胞通透性电阻[5]；嗜血流感杆菌来源的LPS可能通过血清和CD- 14依赖的途径破坏BBB[12]. 体内研究方面，有3.0 mg*kg-1大剂量LPS注射 后肿瘤坏死因子透过脑毛细血管内皮细胞紧密连接的证据[13],这些说明LPS对BBB有影响作用,但这些 都是在超常剂量LPS所致的感染状态下发生,而在体研究中LPS剂量降低后这种影响并不明显.
我们以前的研究发现，利用EB的荧光观察BBB的开放，可大大提高灵敏性[14] . EB入血后，几乎百分之百地立即与血浆白蛋白结合，并持续数小时存在于血液中[15 ],一旦BBB开放，即使非常短暂，染料-白蛋白复合物也能进入CNS使脑组织染色，在荧光显微镜B激发状态下呈红色.
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本研究显示，注射LPS和生理盐水的第1组及注射生理盐水与小剂量AD的第3组，均未见脑组织染色，表明在一般免疫激发状态或血压轻度一过性升高时BBB不能开放 ；但在第2组，在同样剂量的LPS注射3 h后再注射3 μg.kg-1 AD则使BBB开 放，表现为数量较多和分布较广的卵圆形红色光斑.
本研究结果提示，外周给于LPS使免疫系统受到刺激发生应答过程中，BBB开放阈是降低的，3 μg.kg-1 AD只能使动物血压在数秒内上升4 kPa (30 mmHg左 右),并不能开放BBB，相当于一个阈下刺激,在LPS降低BBB开放阈时，它就可以使BBB开放.
一方面是血液中存在高水平的细胞因子，一方面BBB更容易开放，那么就有可能使某些原来是“阈下”的刺激开放BBB，细胞因子或其他免疫信息分子则通过BBB的开放直接进入CNS. 继而与特异脑区、核团相应的受体结合，亦或引发其他方式的信号传 递.
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LPS使BBB更加容易开放其具体机制可能与NO生成或前列腺素合成受影响有关[16]. 另外，小剂量LPS静脉注射引起杏仁核，室旁核等核团神经元Fos蛋白 表达下降，其所需时间在2～3 h之间，因而本研究的实验设计选择LPS注射3 h后作为第2次注射的时间点. 对于这种BBB开放传递外周免疫信息的途径，还需要在超微结构、生理学、免疫学等方面更为深入细致地研究进行证实. 进一步研究在接近自然感染状态，如用绵羊红细胞免疫动物或二硝基甲苯引起迟发变态反应时免疫应答过程与BBB状态的关系等，可能在揭示神经免疫调节中信息传递的研究工作方面有重要意义.
基金项目：国家自然科学基金重点项目(39830130)；全军“九五”科研规划重点项目(96Z044)
作者简介：邝 芳(1972-)，女(汉族)，广东斗门人.助教，博士生(导师鞠 躬).Tel.(029)3374489 Email.wbrnim@fmmu.edu.cn
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邝芳(第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
王百忍(第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
鞠躬(第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
参考文献
[1]许金明, 郑惠民. 血脑屏障对大分子肽类药物的通透性[J]. 国外医 学脑血管疾病分册，1998; 6(1):24-27.
[2]袁祥鹏, 鞠 躬. 多克隆免疫激发剂LPS免疫激发大鼠引起下丘脑和及脑干 核团c-fos表达[J]. 解剖学报，1997: 28(2):137-141.
[3]Perlstein RS, Mark H. Whitnall MH, Abrams JS et al. Synergistic roles of interleukin-6, interleukin-1, and tumor necrosis facter in the adrenoconticotropin response to bacterial lipopolysaccharide in vivo [J]. Endocrinol ，1993;132(3):946-951.
, 百拇医药
[4]Brian W, Alan JL, Erinc JH et al. Haemophilus influenzae lipopolysaccharide-induced blood brain barrier permeability during experimental meningitis in the rat [J]. J Clin Invest, 1988;(82):1339-1346.
[5]de Vries HE, Blom Roosenialen MC, de Bore AG et al. Effect of endotoxin on permeability of bovine cerebral endothelial cell layers in vitro [J] . J Pharmacol Exp Ther, 1996;277(3):1418-1423.
[6]Wolfgang H, Claudio DZ, Dietrich K. Production of peptide leukotrienes in endotoxin shock [J]. FEBS, 1985;180(2): 309-313.
, 百拇医药
[7]Watkins LR, Goehler LE, Relton J et al. Mechanisms of tumor necrosis factor-x (TNF-X) hyperalgesia [J]. Brain Res, 1995;692:244-250.
[8]Hare AS, Clarke G, Tolchard S. Bacterial lipopolysaccharide-induced changes in Fos protein expression in the rat brain: Correlation with thermoregulatory changes and plasma conticosterone [J]. J Neuroendocrinol, 1995;(7):791-799.
[9]Watanabe T, Clark WG, Ceriani G et al. Elevation of plasma ACTH concentration in rabbits made febrile by systemic injecfion of bacterial endotox in [J]. Brain Res, 1994;652(2):201-206.
, 百拇医药
[10]Banks WA. Passage of cytokines across the blood-brain barrier [J]. Neuroimmunomodulation, 1995;2(4):241-248.
[11]Elmquist JK, Thomas ES, Clifford BS. Mechanisms of CNS response to systemic immune challenge: The febrile responce [J]. Trends Neurosci, 1997;(20): 565-570.
[12]Patrick D, Janice B, Elizabeth AF et al. Haemophilus influenzae lipopol ysaccharide disrupts confluent monolayers of bovine brain endothelial cells via serum-dependent cytotoxic pathway [J]. J Infect Dis, 1992;165:865-872.
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[13]Liu L, Kita T, Tanaka N et al. The expression of tumor necrosis factor in the hypothalamus after treatment with lipopolysacchonide [J]. Int J Exp Pathol, 1996;77(1):37-44.
[14]邝 芳, 王百忍, 王 凌et al. 利用伊文思蓝的荧光观察肾上腺素诱发的血脑屏障开放[J]. 神经解剖学杂志. 1997;13(4):417-420.
[15]Johansson BB, Strandgaard S, Niels A. On the pathogenesis of hypertensive encephalopathy, the hypertensive "breakthnough" of auto regulation of cerebral blood flow with forced vasodilatation,flow increase,and blood brain barrier damage [J]. Cric Res, 1974; 34(Suppl 1):167-171.
[16]Shukla A, Dikshit M, Srimal PL et al. Nitric oxide modulates blood brain barrier permeability during infection with an inactivated bacterium [J]. Neuroreport,1995;6(12):1629-1632., 百拇医药
邝芳 王百忍 鞠躬
摘 要：目的 为了解机体免疫系统受激发的状态下血脑屏障能否开放及血压升高对此过程的影响. 方法 以大肠杆菌来源的脂多糖LPS为免疫刺激物，或(和)给以单独给药时不能开放血脑屏障的小剂量(3μg.kg-1)肾上腺素，以伊文思蓝为血脑屏障开放的指示剂进行研究. 结果 大剂量(250μg.kg-1)LPS和3μg.kg-1肾上腺素分别单独注射不能使血脑屏障开放；而静脉注射LPS 3 h后再给予同样剂量的肾上腺素，则可开放血脑屏障. 结论 在LPS激发的免疫状态下，血脑屏障的开放阈降低，更易于受其他因素影响而开放.本研究为免疫信息分子通过血脑屏障开放传入脑内的假说提供了一个佐证.
关键词：血脑屏障；肾上腺素；脂多糖类
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0 引言
免疫系统与中枢神经系统(central nervous system, CNS)之间因血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的存在而使血液中的免疫分子肽类,难以直接进入脑内[1 ]，因而免疫信息如何传递到CNS仍是神经免疫调节学研究中悬而未决的问题之一.
革兰氏阴性细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可激发免疫细胞产生多种细胞因子. 近年的研究表明，外周给予LPS可引发复杂多样的脑内事件[2,3]. 已 有研究表明LPS对BBB的通透性有不同程度的影响，但目前研究仅见于脑膜炎模型、内毒素休克或体外研究[4-6]. 我们选用250 μg.kg-1的LPS一次性静脉注射，旨 在模拟常见的感染状态，又不致于导致内毒素休克，观察在这种状态下和累加小剂量肾上腺素(adrenaline, AD)注射引起一过性血压升高时BBB的开放状况，为搞清自然感染状态下细胞因子可否通过一过性开放的BBB入脑提供证据. 本研究中BBB开放情况用伊文思蓝(Evans blue, EB)作为指示剂来显示.
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1 材料和方法
1.1 动物和试剂 上海雄性SD大鼠，体质量200～300 g，本校实验动物中心 提供. LPS，E.coli 0127:B8，美国Sigma公司. 盐酸肾上腺素，西安制药厂出品. 伊文思蓝,西德S erva公司进口分装.
1.2 动物分组 将12只大鼠随机分为3组，每组4只. 第 1组，LPS组；第2组，LPS累加AD组；第3组，AD组.
1.3 方法 3组动物用4 g.L-1戊巴比妥钠i p麻醉(40 mg.kg-1)，切开左下肢内侧皮肤，行左股静脉穿刺，分别注射：第1组，LPS 250 μg.kg-1；第2组 ，LPS 250 μg.kg-1; 第3组，生理盐水 0.5 mL.kg-1， 5 min后各组均iv 20 g.L-1 EB生理盐水溶液4 mL.kg-1，并缝合伤口. 动物清醒后不限制饮食. 3 h后第2次麻醉,方法同 前. 切开另一侧下肢内侧皮肤，同右股静脉注射；第1组，生理盐水0.5 mL.kg-1；第2组，A D 3 μg.kg-1；第3组，AD 3 μg.kg-1. 轻压迫止血，20 min后，所有动物均以生理盐水500 m L/只灌流，取全脑，冻存于-20℃ 4～5 h，用恒冷箱作冠状连续切片，片厚30 μm，隔6片取1片，直接贴于载玻片上，于荧光显微镜下，B激发状态观察.
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2 结果
2.1 大体观察结果 注射LPS的第1, 2组动物清醒后活动较少，竖毛明 显，有的出现胸部、肢端轻度颤抖，但对震动、声音、触摸等刺激反应良好. 取材时肉眼可见3组动物的松果体、最后区等处均一蓝染，其余脑组织看不出蓝染现象.
2.2 荧光镜检结果 荧光显微镜下，3组均可见最后区、松 果体等无BBB的室周器官呈边界清晰、染色均匀的红色区域，但在其余脑区BBB的开放程度不同(Fig 1). 第 1组，(LPS+生理盐水)4例中仅有1例在丘脑前核平面上可见2个红色光斑，其余未见染色. 第2组(LPS+AD)光斑数量显著增加，脑干各平面均可见一些卵圆形红色光斑(Fig 2-A)，在下丘可见3～4个/切片，下丘脑、视前区更多，下丘脑每平面每张切片 有光斑10个左右，尾壳核1～2/个切片，皮层较少. 第3组(生理盐水+AD)各脑区未见光斑(Fig 2-B).
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图1 3组动物的处理和BBB的开放情况
Fig 1 Treatment on three groups of animals and the effect on BBB opening cond ition
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图2 BBB的开放情况(尾壳核平面)
Fig 2 States of BBB's opening on caudate-putamen level
(A) Group 2, BBB was opened moderately; (B) Group 3, BBB was not opened. ×100
3 讨论
大量研究结果显示，免疫信息传入CNS可能有几种途径，①免疫分子作用于外周神经末稍，将信号传入CNS[7]；②细胞因子通过缺乏BBB的室周器 官[8]；③细胞因子作用于脑膜小胶质细胞影响前列腺素合成，引起次级信号物质生成而触发一系列信号传递[9]；④经BBB的可饱和转运系统将细胞因子送入脑内[ 10]等等. 这些理论有一定的依据，也都存在各自的缺陷或矛盾的实验结果，尤其是免疫分子进入CNS的量相当少，使人们对这些途径的重要性发生怀疑[11].
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已知LPS在3 h内可激发免疫系统产生大量的多种细胞因子. 即注射LPS 3 h后机体免疫系统处于激发状态，并可引起脑内某些特异性核团的免疫组织化学改变，以及影响下丘脑-垂体-肾上腺轴(H-P-A轴)的活动[2,3,8]. 可见CNS对LP S激发外周免疫分子产生这一事件及有关系统的活动进行调控. 体外研究提示，LPS能够降低培养的牛内皮细胞通透性电阻[5]；嗜血流感杆菌来源的LPS可能通过血清和CD- 14依赖的途径破坏BBB[12]. 体内研究方面，有3.0 mg*kg-1大剂量LPS注射 后肿瘤坏死因子透过脑毛细血管内皮细胞紧密连接的证据[13],这些说明LPS对BBB有影响作用,但这些 都是在超常剂量LPS所致的感染状态下发生,而在体研究中LPS剂量降低后这种影响并不明显.
我们以前的研究发现，利用EB的荧光观察BBB的开放，可大大提高灵敏性[14] . EB入血后，几乎百分之百地立即与血浆白蛋白结合，并持续数小时存在于血液中[15 ],一旦BBB开放，即使非常短暂，染料-白蛋白复合物也能进入CNS使脑组织染色，在荧光显微镜B激发状态下呈红色.
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本研究显示，注射LPS和生理盐水的第1组及注射生理盐水与小剂量AD的第3组，均未见脑组织染色，表明在一般免疫激发状态或血压轻度一过性升高时BBB不能开放 ；但在第2组，在同样剂量的LPS注射3 h后再注射3 μg.kg-1 AD则使BBB开 放，表现为数量较多和分布较广的卵圆形红色光斑.
本研究结果提示，外周给于LPS使免疫系统受到刺激发生应答过程中，BBB开放阈是降低的，3 μg.kg-1 AD只能使动物血压在数秒内上升4 kPa (30 mmHg左 右),并不能开放BBB，相当于一个阈下刺激,在LPS降低BBB开放阈时，它就可以使BBB开放.
一方面是血液中存在高水平的细胞因子，一方面BBB更容易开放，那么就有可能使某些原来是“阈下”的刺激开放BBB，细胞因子或其他免疫信息分子则通过BBB的开放直接进入CNS. 继而与特异脑区、核团相应的受体结合，亦或引发其他方式的信号传 递.
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LPS使BBB更加容易开放其具体机制可能与NO生成或前列腺素合成受影响有关[16]. 另外，小剂量LPS静脉注射引起杏仁核，室旁核等核团神经元Fos蛋白 表达下降，其所需时间在2～3 h之间，因而本研究的实验设计选择LPS注射3 h后作为第2次注射的时间点. 对于这种BBB开放传递外周免疫信息的途径，还需要在超微结构、生理学、免疫学等方面更为深入细致地研究进行证实. 进一步研究在接近自然感染状态，如用绵羊红细胞免疫动物或二硝基甲苯引起迟发变态反应时免疫应答过程与BBB状态的关系等，可能在揭示神经免疫调节中信息传递的研究工作方面有重要意义.
基金项目：国家自然科学基金重点项目(39830130)；全军“九五”科研规划重点项目(96Z044)
作者简介：邝 芳(1972-)，女(汉族)，广东斗门人.助教，博士生(导师鞠 躬).Tel.(029)3374489 Email.wbrnim@fmmu.edu.cn
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邝芳(第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
王百忍(第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
鞠躬(第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033)
参考文献
[1]许金明, 郑惠民. 血脑屏障对大分子肽类药物的通透性[J]. 国外医 学脑血管疾病分册，1998; 6(1):24-27.
[2]袁祥鹏, 鞠 躬. 多克隆免疫激发剂LPS免疫激发大鼠引起下丘脑和及脑干 核团c-fos表达[J]. 解剖学报，1997: 28(2):137-141.
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[8]Hare AS, Clarke G, Tolchard S. Bacterial lipopolysaccharide-induced changes in Fos protein expression in the rat brain: Correlation with thermoregulatory changes and plasma conticosterone [J]. J Neuroendocrinol, 1995;(7):791-799.
[9]Watanabe T, Clark WG, Ceriani G et al. Elevation of plasma ACTH concentration in rabbits made febrile by systemic injecfion of bacterial endotox in [J]. Brain Res, 1994;652(2):201-206.
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[11]Elmquist JK, Thomas ES, Clifford BS. Mechanisms of CNS response to systemic immune challenge: The febrile responce [J]. Trends Neurosci, 1997;(20): 565-570.
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[16]Shukla A, Dikshit M, Srimal PL et al. Nitric oxide modulates blood brain barrier permeability during infection with an inactivated bacterium [J]. Neuroreport,1995;6(12):1629-1632., 百拇医药