显微切割技术鉴定病毒核内包涵体
显微切割技术鉴定病毒核内包涵体
闫庆国 黄高升 朱德生 王哲
摘 要：目的 建立应用显微切割技术鉴定病毒核内包涵体的新方法. 方法 通过光学显微镜直视下用显微操纵系统进行显微切割技术结合DNA提取和PCR方法，对在组织切片上获取病毒核内包涵体的来源进行分子生物学鉴定. 结果 在福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织切片上根据形态学特征疑为人巨细胞病毒(HCMV)感染的细胞，利用显微切割技术将核内包涵体病变与其周围染色质分离，从收集的包涵体得到用于PCR扩增的DNA模板，经双重PCR扩增出预期的149 bp片段，从而鉴定出该包涵体为HCMV包涵体. 结论 显微切割技术可用于病毒核内包涵体的鉴定，为病毒包涵体病变的分子病理学研究建立了一种新的方法.
关键词：显微切割；病毒；包涵体
0 引言
, 百拇医药
显微切割(microdissection)技术是通过利用显微操作系统切割局部组织、单个细胞、胞质或胞核甚至染色体的局部组分用于进一步研究，近年来在国外医学研究领域中倍受重视，已广泛应用于肿瘤异质性、细胞突变分析、染色体结构分析、新基因发现和某些疾病的病因及诊断研究等领域. Martin等[1]将显微切割技术用于神经系统变性性疾病神经元和神经元内包涵体的分离研究，开辟了显微切割技术用于包涵体研究的先河，但将显微切割技术用于病毒核内包涵体的鉴定尚未见研究文献.
病毒包涵体是细胞被某些病毒感染后，在胞质或胞核内出现的圆形或椭圆形斑块，其大小和数量不一，在HE染色普通光学显微镜下呈嗜酸性或嗜碱性. 虽然某些病毒感染引起包涵体病变具有一定的形态特征，据此可推测感染病毒的类型，如疱疹病毒感染可形成核内嗜酸性包涵体，但仅从形态特征尚不足以鉴定出其感染病毒的确切类型[2]. 我们从形态学特征疑为人巨细胞病毒(human cytomegalovirus HCMV)感染的福尔马林固定、石蜡包埋的腮腺组织切片上，利用显微切割技术分离收集核内包涵体，并经DNA提取和PCR扩增出预期的149 bp基因片段，从而鉴定该病毒包涵体为HCMV感染所致,建立起利用显微切割技术鉴定病毒核内包涵体的新方法.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 疑为HCMV感染的腮腺组织为本室尸检材料，经常规福尔马林固定，石 蜡包埋.
1.1.2 主要设备 日本Narishige液压显微操作系统(Narishige Co.,LTD )，日本Olympus普通光学显微镜，PE-2400扩增仪购自美国PE公司.
1.1.3 主要试剂 Taq DNA polymerase为加拿大Sangon公司产品，矿物 油及蛋白酶K为Sigma公司产品.
1.1.4 引物 PCR引物根据HCMV立即早期基因第四外显子基因设计，上游引 物：5＇-GTACT- GGGCAAAGACCTTCA-3＇；下游引物：5＇-TAAGTGAGTTCTGTCGGGTG-3＇. 扩增片段长度为14 9 bp.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 待切割组织片的制备 福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织块依病理学常规方 法制备7 μ m连续切片，贴于载玻片置烤片机上70℃烤2 h，依下列步骤[3]处理后不封片用于 显微切割： 二甲苯浸泡2次，5 min/次，1000, 950, 800及700 mL.L-1乙醇、去离子水 各2 min ，10滴苏木精染液1 min后置于去离子水洗，5滴返蓝液(2 g.L-1 Na2CO3, 0.4 g.L-1 Li2CO3) 5 min 后去离子水洗；10滴伊红染液1 min后去离子水洗；甘油缓冲液(25 mL.L-1 glycer ol; 0. 05 mol.L-1 Tris.HCl, pH 8.9; 2 mmol.L-1 EDTA; 1 mmol.L-1 N aCl) 2 min后冷风机吹干.
, 百拇医药
1.2.2 显微切割 根据Moskaluk等[3]介绍的方法并做部分改进， 将直径0.5 mm的空心玻璃微 管先用显微操纵系统中的拉针器制成用于切割细胞和吸取细胞两种类型尖端大小不同的玻璃 针，切割用针尖端约1 μm，吸取用针尖端约10 μm；将与显微操纵机械手通过液压相连的 持针 器固定于显微镜操作平台，再将玻璃针固定于持针器，玻璃针尾部与充满矿物油的摸针器相 连. 在显微镜下找到待切割细胞的视野后，滴加去离子水，在x轴、y轴和z轴3 个方向上精巧 控制显微操纵机械手，用切割针将切割的核内包涵体部分与周围结构分割开，使其游离，用 吸取针吸取游离的包涵体，吹打入EP管中.
1.2.3 DNA提取 将含切割的核内包涵体的EP管12 000 g离心，每10个 核内包涵体加入5 μL TK 消化液(5 mL.L-1 Tween 20, 0.2 g.L-1蛋白酶K)，振荡器混匀后短暂离 心，置55℃水浴过夜；再置100℃烤箱中烤10 min；Vortex混匀后短暂离心供PCR用.
, 百拇医药
1.2.4 PCR扩增及产物鉴定 PCR反应总体积为50 μL，循环参数为：95℃ 5 min; 94℃ 1 min; 52.5℃ 1.5 min; 72℃ 1.5 min; 35个循环；72℃延伸10 min. 在PCR反应中设立用去 离子水替代扩增模 板的阴性对照及用HCMV立即早期基因为扩增模板的阳性对照. 扩增产物以20 g.L-1 琼脂糖电泳检测.
2 结果
在1例福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织标本中，存在有病毒感染征象的核内包涵体病变， 在HE染色切片中，包涵体呈嗜酸性，与周围的染色质间有一空晕，似猫头鹰眼样(Fig 1) ，符合HCMV感染产生的包涵体特征；用显微切割技术获得20个包涵体用于PCR检测，Fig1, 2 分别显示一细胞核内包涵体显微切割前后的状况；经采用蛋白酶K消化，100℃ 10 min灭活 蛋 白酶K后获得的DNA模板行PCR扩增，20 g.L-1琼脂糖电泳检测，可见扩增出预期的14 9 bp片段，阳性对照和阴性对照结果明确(Fig 3).
, 百拇医药
图1 显微切割前细胞核内包涵体病变
Fig 1 Intranuclear inclusion before microdissection ×400
图2 显微切割后包涵体被去除
Fig 2 Intranuclear inclusion was removed after microdissection ×400
, 百拇医药 图3 显微切割的核内包涵体PCR鉴定
Fig 3 Determination of microdissected intranuclear inclusions by PCR
1: 123 bp ladders maker; 2: Positive control; 3: Negative control; 4: Exp ected 149 bp fragments of human cytomegalovirus.
3 讨论
显微切割技术在生物学研究中的应用经历了显微组织切割、细胞群切割、单个细胞切割、单 细胞内组分切割、染色体切割等阶段，随着技术方法的不断改进，显微切割的区域不断变小 ，而应用的领域则不断扩大[4]. 显微切割技术具有独特的优势，它一方面可在 细胞、亚 细胞层次上使研究定位清楚，排除周围因素的干扰，另一方面又可与分子克隆、PCR、免疫 组织化学等多种分子生物学和免疫学的研究方法相结合，而且研究取材广泛，培养细胞、常 规制备的染色体、石蜡切片、冰冻切片、细胞铺片等均可采用，因此其应用日益广泛. 目前 在新基因发现、基因突变研究、染色体畸变、细胞局部病变病因学研究等多种领域均有研 究文献[5,6].
, 百拇医药
部分病毒性疾病如DNA病毒感染，当病毒颗粒在核内聚集到一定程度时，可在光学显微镜下 检见特殊的核内包涵体病变，这为疾病的诊断和病因学研究提供了重要线索[2]. 然而由于 病毒包涵体病变在组织中多呈散在性分布于胞质或胞核，要结合形态学对包涵体进行特异性 鉴定较为困难，我们将显微切割技术与PCR技术相结合，鉴定1例核内包涵体病变为HCMV感染 所致，为病毒包涵体的鉴定提供了一种新的方法.
显微切割用于病毒包涵体鉴定分析时，切片的厚度、切割所获的包涵体数目、模板DNA的提 取方式、PCR扩增目的片段的长度及PCR方式都是影响结果的重要因素. 显微切割后获得的研 究材料数量上一般都较为有限，Dietmaier等[7]的研究表明显微切割用于DNA分析 所需的细 胞数，依研究目的、来源组织的固定方式而有差异，他们比较了用流式细胞仪分选细胞和 用显微切割从冰冻切片和石蜡切片上切割细胞用于细胞突变分析所需的最少细胞数，结果冰 冻切片与流式细胞仪相同，至少需要10个细胞，而石蜡切片至少需要30个细胞. 在不影响形 态观察的前提下，作为显微切割的组织切片越厚越好，本试验研究中作为对病毒包涵体的鉴 定，在7 μm的连续石蜡切片中获取20个包涵体即得到PCR阳性检测结果. 在显微切割后的PC R分析,双重PCR可提高其灵敏度和准确性[8]，此点在本试验研究中得到证实，在第 一轮PCR后 20 g*L-1琼脂糖电泳后尚难以检测出目的片段，而在第二轮PCR后结果则很明确. 同 时由于福尔 马林固定石蜡包埋组织过程中导致细胞内DNA的断裂，设计引物扩增的目的片段长度直接影 响PCR结果的阳性率[8]，因扩增片段越长，其模板处于DNA断裂点的可能性越大, 因此在扩 增从显微切割获得的小样本DNA时，设计扩增的目的片段长度在不影响PCR特异性的前提下应 该越短越好.
, 百拇医药
基金项目：全军医药卫生科研基金项目(98D046), 陕西省自然科学基金项目(98M38)
作者简介：闫庆国(1968-)，男(汉族)，安徽省霍山县人. 助教,硕士. 现为第四军医大学病理学专业1997级博士生(导师黄高升). Tel. (029)3374541
闫庆国(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
黄高升(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
朱德生(第四军医大学：实验动物中心，陕西 西安 710033)
王哲(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Martin JE, Swash M, Mather K et al. Microdissection: A nov el me thod for the study of intracellular inclusion bodies [J]. J Pathol,1990;16 0(1):77-79.
[2]戴华生. 新实验病毒学[M]. 北京：中国学术出版社，1983：23-24.
[3]Moskaluk CA, Kern SE. Microdissection and polymerase chain reaction amplificati on of genomic DNA from histological tissue sections [J]. Am J Pathol,1997; 150(5):1547-1552.
[4]Lee JY, Dong SM, Kim SY et al. A simple, precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue sections [J]. Vi rchows Arch,1998;433(4):305-309.
, 百拇医药
[5]Zhang M, Yu L, Hu PR et al. Isolation of 24 novel cDNA fragments from microdissected human chromosome band [J]. Cell Res,1998;8(2):135-142 .
[6]Fend F, Emmert-Buck MR, Chuaqui R et al. Immuno-LCM: Laser cap ture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis [J]. Am J Pathol,1999; 154(1):61-66.
[7]Dietmaier W, Hartmann A, Wallinger S et al. Multiple mutation an alysis in single tumor cells with improved whole genome amplification [J]. Am J Pathol,1999 ;154(1):83-95.
[8]Dieffenbach CW, Dveksler GS. PCR primer: A laboratory manual [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995:53-112., 百拇医药
闫庆国 黄高升 朱德生 王哲
摘 要：目的 建立应用显微切割技术鉴定病毒核内包涵体的新方法. 方法 通过光学显微镜直视下用显微操纵系统进行显微切割技术结合DNA提取和PCR方法，对在组织切片上获取病毒核内包涵体的来源进行分子生物学鉴定. 结果 在福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织切片上根据形态学特征疑为人巨细胞病毒(HCMV)感染的细胞，利用显微切割技术将核内包涵体病变与其周围染色质分离，从收集的包涵体得到用于PCR扩增的DNA模板，经双重PCR扩增出预期的149 bp片段，从而鉴定出该包涵体为HCMV包涵体. 结论 显微切割技术可用于病毒核内包涵体的鉴定，为病毒包涵体病变的分子病理学研究建立了一种新的方法.
关键词：显微切割；病毒；包涵体
0 引言
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显微切割(microdissection)技术是通过利用显微操作系统切割局部组织、单个细胞、胞质或胞核甚至染色体的局部组分用于进一步研究，近年来在国外医学研究领域中倍受重视，已广泛应用于肿瘤异质性、细胞突变分析、染色体结构分析、新基因发现和某些疾病的病因及诊断研究等领域. Martin等[1]将显微切割技术用于神经系统变性性疾病神经元和神经元内包涵体的分离研究，开辟了显微切割技术用于包涵体研究的先河，但将显微切割技术用于病毒核内包涵体的鉴定尚未见研究文献.
病毒包涵体是细胞被某些病毒感染后，在胞质或胞核内出现的圆形或椭圆形斑块，其大小和数量不一，在HE染色普通光学显微镜下呈嗜酸性或嗜碱性. 虽然某些病毒感染引起包涵体病变具有一定的形态特征，据此可推测感染病毒的类型，如疱疹病毒感染可形成核内嗜酸性包涵体，但仅从形态特征尚不足以鉴定出其感染病毒的确切类型[2]. 我们从形态学特征疑为人巨细胞病毒(human cytomegalovirus HCMV)感染的福尔马林固定、石蜡包埋的腮腺组织切片上，利用显微切割技术分离收集核内包涵体，并经DNA提取和PCR扩增出预期的149 bp基因片段，从而鉴定该病毒包涵体为HCMV感染所致,建立起利用显微切割技术鉴定病毒核内包涵体的新方法.
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 疑为HCMV感染的腮腺组织为本室尸检材料，经常规福尔马林固定，石 蜡包埋.
1.1.2 主要设备 日本Narishige液压显微操作系统(Narishige Co.,LTD )，日本Olympus普通光学显微镜，PE-2400扩增仪购自美国PE公司.
1.1.3 主要试剂 Taq DNA polymerase为加拿大Sangon公司产品，矿物 油及蛋白酶K为Sigma公司产品.
1.1.4 引物 PCR引物根据HCMV立即早期基因第四外显子基因设计，上游引 物：5＇-GTACT- GGGCAAAGACCTTCA-3＇；下游引物：5＇-TAAGTGAGTTCTGTCGGGTG-3＇. 扩增片段长度为14 9 bp.
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1.2 方法
1.2.1 待切割组织片的制备 福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织块依病理学常规方 法制备7 μ m连续切片，贴于载玻片置烤片机上70℃烤2 h，依下列步骤[3]处理后不封片用于 显微切割： 二甲苯浸泡2次，5 min/次，1000, 950, 800及700 mL.L-1乙醇、去离子水 各2 min ，10滴苏木精染液1 min后置于去离子水洗，5滴返蓝液(2 g.L-1 Na2CO3, 0.4 g.L-1 Li2CO3) 5 min 后去离子水洗；10滴伊红染液1 min后去离子水洗；甘油缓冲液(25 mL.L-1 glycer ol; 0. 05 mol.L-1 Tris.HCl, pH 8.9; 2 mmol.L-1 EDTA; 1 mmol.L-1 N aCl) 2 min后冷风机吹干.
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1.2.2 显微切割 根据Moskaluk等[3]介绍的方法并做部分改进， 将直径0.5 mm的空心玻璃微 管先用显微操纵系统中的拉针器制成用于切割细胞和吸取细胞两种类型尖端大小不同的玻璃 针，切割用针尖端约1 μm，吸取用针尖端约10 μm；将与显微操纵机械手通过液压相连的 持针 器固定于显微镜操作平台，再将玻璃针固定于持针器，玻璃针尾部与充满矿物油的摸针器相 连. 在显微镜下找到待切割细胞的视野后，滴加去离子水，在x轴、y轴和z轴3 个方向上精巧 控制显微操纵机械手，用切割针将切割的核内包涵体部分与周围结构分割开，使其游离，用 吸取针吸取游离的包涵体，吹打入EP管中.
1.2.3 DNA提取 将含切割的核内包涵体的EP管12 000 g离心，每10个 核内包涵体加入5 μL TK 消化液(5 mL.L-1 Tween 20, 0.2 g.L-1蛋白酶K)，振荡器混匀后短暂离 心，置55℃水浴过夜；再置100℃烤箱中烤10 min；Vortex混匀后短暂离心供PCR用.
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1.2.4 PCR扩增及产物鉴定 PCR反应总体积为50 μL，循环参数为：95℃ 5 min; 94℃ 1 min; 52.5℃ 1.5 min; 72℃ 1.5 min; 35个循环；72℃延伸10 min. 在PCR反应中设立用去 离子水替代扩增模 板的阴性对照及用HCMV立即早期基因为扩增模板的阳性对照. 扩增产物以20 g.L-1 琼脂糖电泳检测.
2 结果
在1例福尔马林固定石蜡包埋的腮腺组织标本中，存在有病毒感染征象的核内包涵体病变， 在HE染色切片中，包涵体呈嗜酸性，与周围的染色质间有一空晕，似猫头鹰眼样(Fig 1) ，符合HCMV感染产生的包涵体特征；用显微切割技术获得20个包涵体用于PCR检测，Fig1, 2 分别显示一细胞核内包涵体显微切割前后的状况；经采用蛋白酶K消化，100℃ 10 min灭活 蛋 白酶K后获得的DNA模板行PCR扩增，20 g.L-1琼脂糖电泳检测，可见扩增出预期的14 9 bp片段，阳性对照和阴性对照结果明确(Fig 3).
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图1 显微切割前细胞核内包涵体病变
Fig 1 Intranuclear inclusion before microdissection ×400
图2 显微切割后包涵体被去除
Fig 2 Intranuclear inclusion was removed after microdissection ×400
, 百拇医药 图3 显微切割的核内包涵体PCR鉴定
Fig 3 Determination of microdissected intranuclear inclusions by PCR
1: 123 bp ladders maker; 2: Positive control; 3: Negative control; 4: Exp ected 149 bp fragments of human cytomegalovirus.
3 讨论
显微切割技术在生物学研究中的应用经历了显微组织切割、细胞群切割、单个细胞切割、单 细胞内组分切割、染色体切割等阶段，随着技术方法的不断改进，显微切割的区域不断变小 ，而应用的领域则不断扩大[4]. 显微切割技术具有独特的优势，它一方面可在 细胞、亚 细胞层次上使研究定位清楚，排除周围因素的干扰，另一方面又可与分子克隆、PCR、免疫 组织化学等多种分子生物学和免疫学的研究方法相结合，而且研究取材广泛，培养细胞、常 规制备的染色体、石蜡切片、冰冻切片、细胞铺片等均可采用，因此其应用日益广泛. 目前 在新基因发现、基因突变研究、染色体畸变、细胞局部病变病因学研究等多种领域均有研 究文献[5,6].
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部分病毒性疾病如DNA病毒感染，当病毒颗粒在核内聚集到一定程度时，可在光学显微镜下 检见特殊的核内包涵体病变，这为疾病的诊断和病因学研究提供了重要线索[2]. 然而由于 病毒包涵体病变在组织中多呈散在性分布于胞质或胞核，要结合形态学对包涵体进行特异性 鉴定较为困难，我们将显微切割技术与PCR技术相结合，鉴定1例核内包涵体病变为HCMV感染 所致，为病毒包涵体的鉴定提供了一种新的方法.
显微切割用于病毒包涵体鉴定分析时，切片的厚度、切割所获的包涵体数目、模板DNA的提 取方式、PCR扩增目的片段的长度及PCR方式都是影响结果的重要因素. 显微切割后获得的研 究材料数量上一般都较为有限，Dietmaier等[7]的研究表明显微切割用于DNA分析 所需的细 胞数，依研究目的、来源组织的固定方式而有差异，他们比较了用流式细胞仪分选细胞和 用显微切割从冰冻切片和石蜡切片上切割细胞用于细胞突变分析所需的最少细胞数，结果冰 冻切片与流式细胞仪相同，至少需要10个细胞，而石蜡切片至少需要30个细胞. 在不影响形 态观察的前提下，作为显微切割的组织切片越厚越好，本试验研究中作为对病毒包涵体的鉴 定，在7 μm的连续石蜡切片中获取20个包涵体即得到PCR阳性检测结果. 在显微切割后的PC R分析,双重PCR可提高其灵敏度和准确性[8]，此点在本试验研究中得到证实，在第 一轮PCR后 20 g*L-1琼脂糖电泳后尚难以检测出目的片段，而在第二轮PCR后结果则很明确. 同 时由于福尔 马林固定石蜡包埋组织过程中导致细胞内DNA的断裂，设计引物扩增的目的片段长度直接影 响PCR结果的阳性率[8]，因扩增片段越长，其模板处于DNA断裂点的可能性越大, 因此在扩 增从显微切割获得的小样本DNA时，设计扩增的目的片段长度在不影响PCR特异性的前提下应 该越短越好.
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基金项目：全军医药卫生科研基金项目(98D046), 陕西省自然科学基金项目(98M38)
作者简介：闫庆国(1968-)，男(汉族)，安徽省霍山县人. 助教,硕士. 现为第四军医大学病理学专业1997级博士生(导师黄高升). Tel. (029)3374541
闫庆国(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
黄高升(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
朱德生(第四军医大学：实验动物中心，陕西 西安 710033)
王哲(第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Martin JE, Swash M, Mather K et al. Microdissection: A nov el me thod for the study of intracellular inclusion bodies [J]. J Pathol,1990;16 0(1):77-79.
[2]戴华生. 新实验病毒学[M]. 北京：中国学术出版社，1983：23-24.
[3]Moskaluk CA, Kern SE. Microdissection and polymerase chain reaction amplificati on of genomic DNA from histological tissue sections [J]. Am J Pathol,1997; 150(5):1547-1552.
[4]Lee JY, Dong SM, Kim SY et al. A simple, precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue sections [J]. Vi rchows Arch,1998;433(4):305-309.
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[5]Zhang M, Yu L, Hu PR et al. Isolation of 24 novel cDNA fragments from microdissected human chromosome band [J]. Cell Res,1998;8(2):135-142 .
[6]Fend F, Emmert-Buck MR, Chuaqui R et al. Immuno-LCM: Laser cap ture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis [J]. Am J Pathol,1999; 154(1):61-66.
[7]Dietmaier W, Hartmann A, Wallinger S et al. Multiple mutation an alysis in single tumor cells with improved whole genome amplification [J]. Am J Pathol,1999 ;154(1):83-95.
[8]Dieffenbach CW, Dveksler GS. PCR primer: A laboratory manual [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995:53-112., 百拇医药