介导RA538与反义c-myc腺病毒对肿瘤细胞的作用及其分子机理
陈洁平 林晨 徐采朴 张雪艳 付明 吴旻
摘 要 目的 比较全反式维甲酸诱导基因RA538及反义c-myc对人胃癌细胞的生物学特性，并探讨其作用的分子机理。方法 采用细胞生长曲线、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、逆转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹分析、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法，对RA538、反义c-myc重组腺病毒在人胃癌细胞系(SGC7901)中的生物学作用及其分子机理进行体内外研究。结果 RA538及反义c-myc重组体腺病毒(Ad-RA538及Ad-ASc-myc)对SGC7901细胞生长抑制率分别为76.3%和44.1%。DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc诱导SGC7901细胞凋亡。它们均能抑制SGC7901细胞c-myc、bcl-2、cyclinD1基因表达，并刺激bax基因表达，对p53、p16、TGase、ras基因的表达没有影响。经Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理的SGC7901细胞致瘤性消失。Ad-RA538及Ad-ASc-myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度，生长抑制率分别为60.7%和68.9%。结论 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用是c-myc、bcl-2、bax、cyclinD1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果，与p53、p16、TGase及ras基因的表达无明显关系。
, 百拇医药
关键词：腺病毒；基因治疗；胃癌；维甲酸；c-myc基因
RA538为用全反式维甲酸(retinoic acid, RA)诱导人食管癌细胞系，经消减杂交法得到的cDNA[1]。该基因能抑制恶性表型、诱导肿瘤细胞终末分化、凋亡及下调c-myc基因的表达[2]，其作用机理尚不清楚。计算机分析表明，RA538中部分核苷酸序列与c-myc基因的第2、3外显子有互补同源性。据此，我们设计用腺病毒介导，以人胃癌细胞(SGC7901)为靶细胞，比较研究RA538与反义c-myc对人胃癌细胞生物学作用，对细胞周期作用的差异，以及二者与肿瘤发生、发展、分化及凋亡相关基因的关系，进一步阐明RA538抑癌作用的分子机理，为胃癌的基因治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系 SGC7901细胞为人胃腺癌细胞系。293细胞为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。
, http://www.100md.com
1.2 重组体腺病毒的制备 RA538、反义c-myc及LacZ重组体腺病毒(Ad-RA538、Ad-ASc-myc、Ad-LacZ)为中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体构建而成。
1.3 细胞生长曲线(5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT) 采用96孔板，每孔接种细胞5000个，24 h内按不同感染强度(multiplicity of infection, MOI)感染腺病毒。于不同时间点加入MTT溶液(0.5 mg/ml)，4 h后加入DMSO，振摇数分钟后酶标仪检测每孔吸光度(A)(旧称光密度OD值)。
1.4 细胞DNA梯度降解(DNA ladder)的检测 收集细胞，加裂解液(1% NP40, 20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris HCl pH7.5)400 μl，离心取上清，加SDS至终浓度1%及RNA酶56℃作用2 h，乙醇沉淀DNA。以琼脂糖凝胶电泳观察。
, http://www.100md.com
1.5 细胞凋亡原位检测(TdT-mediated dUTP-biotin nic end labeling, TUNEL) 按试剂盒方法进行。
1.6 流式细胞仪(flew cytometry, FCM)检测 收集细胞，PBS清洗后，以70%乙醇固定18 h，离心后PBS洗1次，加RNA酶37℃作用2 h，加入PI(100 μg/ml)100 μl混匀，冰上作用30 min后在流式细胞仪上检测。
1.7 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)分析
1.7.1 细胞总RNA提取 按Promega公司的Total RNA Isolation System说明分别提取并纯化细胞系的RNA。
1.7.2 逆转录 采用Promega公司M-MLV逆转录试剂盒说明将细胞总RNA的mRNA逆转录(引物为Oligo dT)成cDNA。PCR条件：25 μl体系中cDNA2 μl，10×PCR buffer, 15 mmol/L MgCl2，4种dNTPs各25 μmol/L，每次加两对引物(目的基因及β-actin)各50 pmol/L, Taq酶1 U，反应在PCR仪中进行。95 ℃5 min。95 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃1 min，28～30个循环。PCR引物为腺病毒; RA538;c-myc;ASc-myc; bax; bcl-2; p53; p16; TGase; cyclin D1:C-Ki-ras; β-actin。
, 百拇医药
1.8 蛋白质印迹(Western blot)分析 RIPA裂解液(0.01 mol/L Tris.HCl pH7.5, 0.15 mol/L NaCl，1% Triton X-100、0.1%SDS pH7.4)裂解细胞，提取总蛋白。制备12%SDS聚丙烯酰胺凝胶。采用Bio-Rad公司的垂直电泳装置进行电泳，蛋白上样量为40 μg。按Bio-Rad公司的转膜装置将蛋白样本转移至硝酸纤维膜上。电泳及转膜条件见产品说明书。杂交按Amershan公司的ECL Western blotting kit说明进行。将膜置暗盒中，X光片曝光。
1.9 裸鼠致瘤性及皮下移植瘤模型治疗实验
1.9.1 裸鼠致瘤性 接种SGC7901细胞于60 mm培养皿中，贴壁后按MOI 100加入腺病毒，24 h内消化细胞，制成106/0.1 ml细胞悬液，100 μl/只接种于裸鼠右上肢背侧皮下。每组3只5周龄鼠。连续观察肿瘤出现时间和体积，时间为1个月。
, 百拇医药
1.9.2 裸鼠皮下移植瘤模型 收集对数生长期细胞，制成1×107 cell/ml细胞悬液，按100 μl/只量接种于裸鼠皮下(5周龄鼠)，待肿瘤长至5 mm左右时，随机分组，每组5只，肿瘤内注射重组病毒液(109 U病毒)或PBS 0.1 ml，隔日注射1次，共3次，连续观察肿瘤大小。
1.10 统计学分析 采用χ2检验及t检验。
2 结果
2.1 重组体腺病毒的制备 各种重组体腺病毒，经293细胞扩增、纯化及滴度测定，PCR鉴定为阳性。
2.2 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对SGC7901细胞形态学影响及生长的抑制作用 以Ad-RA538及Ad-ASc-myc MOI 100感染SGC7901细胞，均于1～3 d开始出现细胞聚集，变圆，胞浆中有空泡，4～5 d后细胞浮起。Ad-LacZ组细胞无明显形态变化。MTT法显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901细胞均具有明显的生长抑制作用，生长抑制率分别为76.3%和44.1%(MOI 200，8 d)，与Ad-LacZ相比P<0.01，结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901细胞生长的抑制作用(8 d)
Table 1 Anti-proliferative effect of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 cells(8 days)
MOI
(感染强度)
Ad-RA538
Ad-ASc-myc
Ad-LacZ
±s
, 百拇医药
(均数±标准差)
Survival(%)
(存活率)±s
(均数±标准差)
Survival(%)
(存活率)±s
(均数±标准差)
, 百拇医药 Survival(%)
(存活率)
25
1.062±0.050
94.0
±4.5
1.260±0.036
98.4
±2.8
1.281±0.090
100.0
±7.0
, 百拇医药 50
0.941±0.067
84.0
±6.0
1.244±0.064
97.1
±5.0
1.268±0.076
99.0
±5.9
100
0.534±0.091
, 百拇医药 47.4
±8.1*
1.045±0.073
81.6
±5.7*
1.250±0.035
97.6
±2.7
200
0.265±0.090
23.7
±8.0*
, 百拇医药
0.716±0.070
55.9
±5.5**
1.206±0.081
94.1
±6.3
MOI：multiplicity of infection;* vs Ad-Lac Z P<0.05；**：P<0.01(与Ad-LacZ比较 * P<0.05； ** P<0.01)
2.3 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对SGC7901细胞的凋亡诱导作用 Ad-RA538及Ad-AS c-myc作用第2 d、4 d、6 d后均出现明显的DNA ladder现象(图1)。细胞凋亡原位检测法显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理的SGC7901细胞出现明显的凋亡(图2)。FCM分析显示SGC7901细胞经Ad-RA538及Ad-ASc-myc作用后4 d、6 d均出现S期及G2M期阻滞。Ad-RA538处理的SGC7901细胞2 d、4 d、6 d的凋亡峰分别为34.2%、18.2%及22%。Ad-ASc-myc 2 d、4 d、6 d凋亡峰分别为1.6%、2.9%及50.7%。
, 百拇医药
2.4 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对SGC7901细胞基因表达的调控作用 分别提取经Ad-RA538和Ad-ASc-myc处理1 d、3 d、5 d、7 d后及对照组细胞总RNA，RT-PCR分析发现：在SGC7901细胞内未检测到内源性RA538的表达，经Ad-RA538处理后RA538表达显著增加。两个处理组中，c-myc基因表达均不同程度地降低，Bcl-2基因表达显著下降，Bax基因表达明显增加，cyclinD1表达逐渐下降，而p53、p16、TGase、c-ki-ras基因表达均无明显变化，见图3～6。分别提取Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理组1 d、3 d、5 d、7 d的细胞总蛋白。Western blot分析显示：两组c-myc基因表达均呈不同程度降低，bax基因表达显著增加(图7)。
2.5 Ad-RA538及Ad-ASc-myc的裸鼠体内抗瘤效应 裸鼠致瘤性：Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理组1 m时成瘤率均为零，而Ad-LacZ组及PBS组(Mock)成瘤率均为100%(P<0.01)(图8)。裸鼠皮下移植瘤模型：Ad-RA538及Ad-ASc-myc对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型治疗结果显示，1 m后肿瘤平均体积明显小于对照组(P<0.01)，对肿瘤的生长抑制率Ad-RA538为60.7%，Ad-ASc-myc为68.9%(1 m时)，结果见图9。
, http://www.100md.com
3 讨论
以往的研究显示，RA538具有抑制肿瘤细胞恶性表型，诱导肿瘤细胞凋亡及下调c-myc的作用[2]。计算机分析发现RA538 cDNA中部分核苷酸序列与c-myc基因的第2、3外显子具有互补同源性，提示其对c-myc的下调作用可能与封闭c-myc转录的mRNA有关。反义c-myc采用c-myc基因含有起始密码子的第2外显子及其两侧部分内含子序列共1.53 kb片段构建而成[3]。由于两者结构上存在的共同点，为比较研究它们的作用及其机理提供了条件。采用RA538及反义c-myc的重组腺病毒感染胃癌SGC7901细胞均显示明显的生长抑制，生长抑制率分别为76.3%及44.1%，经TUNEL及DNA Ladder证实两者均能诱导SGC7901细胞的凋亡。裸鼠实验显示经Ad-RA538或Ad-ASc-myc处理的细胞无体内致瘤性；二者对皮下移植瘤生长抑制率分别为60.7%及68.9%，提示RA538基因的表达可抑制胃癌细胞生长，诱导凋亡。与文献报道在其他肿瘤细胞系中的作用一致[1，2，4]。反义c-myc具有与RA538类似的作用，可能与两者结构上的相似有关。
, http://www.100md.com
目前的资料认为，RA对某些肿瘤细胞具有抑制生长、诱导分化及凋亡作用，可以调节许多癌基因及抑癌基因的表达。RA538为RA诱导基因，本实验结果已经证实其对胃癌细胞具有诱导凋亡及抑制生长的作用。Bouillet等[5]也报道了RA诱导基因Stra6可以诱导肿瘤细胞凋亡。然而关于RA538是通过何种机理实现其对胃癌细胞的生长抑制及凋亡诱导作用；RA538及反义c-myc在结构及功能上极为相似，在基因调控方面是否存在差别等有待探讨。我们发现RA538及反义c-myc除抑制胃癌细胞c-myc基因表达外，还能抑制bcl-2、cyclinD1基因表达并刺激bax基因的表达。胃癌中存在c-myc基因的扩增及高表达。通过RA538及反义c-myc基因的表达实现c-myc基因的下调，从而诱导胃癌细胞凋亡，与多数文献报道的在凋亡过程中c-myc基因表达增加不同[6]。也有资料显示抑制c-myc表达可以诱导肿瘤细胞凋亡[7]，这与我们的研究结果一致。出现这一矛盾结果可能的解释是，c-myc基因能诱导凋亡，但在c-myc高表达的肿瘤细胞，急剧的c-myc基因表达降低对其来说是致命的[3，7，8]。现有的研究发现bcl-2高表达可以引起肿瘤、延长细胞的生存期并抑制多种细胞的凋亡。Bax与bcl-2具有同源性，在细胞凋亡中其担负着与bcl-2相反的作用[9]。我们发现RA538及反义c-myc基因的表达均可促进bax基因的表达并抑制bcl-2基因的表达，而随着bax的表达增加和bcl-2表达的下降，胃癌细胞出现凋亡，说明bax的高表达及bcl-2表达的抑制可以诱导胃癌细胞的凋亡，与文献报道bax及bcl-2在其他细胞中的作用一致[9]。cyclinD1作为一种细胞周期调控蛋白，具有调节细胞周期及促进细胞增殖的作用。我们的研究显示，RA538及反义c-myc基因的高表达可以抑制cyclinD1基因的表达。因此RA538及反义c-myc的抑制胃癌细胞生长作用可能与cyclinD1表达的抑制有关。由于p53、p16、TGase、ras基因均与肿瘤生长抑制或凋亡有关。我们也对RA538及反义c-myc基因表达对它们的影响作了观察，结果显示p53、p16、TGaes、ras基因的表达无变化，表明在胃癌细胞中RA538及反义c-myc诱导的凋亡及生长抑制与p53、p16、TGaes及ras的表达无明显关系。在对细胞周期的作用方面，Ad-RA538及Ad-ASc-myc均表现为4、6 d S、G2M期阻滞，Ad-RA538凋亡高峰为2 d(34.2%)，Ad-ASc-myc凋亡高峰为6 d(50.7%)，两者相似。文献报道显示c-myc诱导的凋亡多发生在G1期阻滞的细胞[10]。而在c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞凋亡的作用中则显示对细胞周期无明显的影响[11]。本研究结果显示的细胞凋亡以S、G2M期阻滞为主，可能与c-myc、bcl-2、cyclinD1表达的抑制及bax表达的增加对细胞凋亡产生的综合作用有关。
, http://www.100md.com
图1 Ad-RA538及Ad-ASc-myc感染后7901细胞DNA梯度降解试验 1:Ad-lacZ(2d);2:Ad-RA538(2d);3:Ad-lacZ(4d);4:Ad-RA538(4d);5:Ad-lacZ(6d);6:Ad-RA538(6d)；7:Ad-lacZ(2d);8:Ad-ASc-myc(2d);9:Ad-lacZ(4d);10:Ad-ASc-myc(4d);11:Ad-lacZ(6d);12:Ad-ASc-myc(6d)图2 Ad-RA538及Ad-ASc-myc感染后SGC7901细胞TUNEL凋亡分析 图3 RT-PCR分析Ad-RA538感染后SGC7901细胞RA538基因的表达 图4 RT-PCR分析Ad-RA538感染后SGC7901细胞bax基因的表达 图5 RT-PCR分析Ad-ASc-myc感染后SGC7901细胞c-myc基因的表达 图6 RT-PCR分析Ad-ASc-myc感染后SGC7901细胞bcl-2基因的表达 图3～6中1:DNA marker; 2：细胞对照；3～6:1 d、3 d、5 d、7 d图7 Ad-RA538(a)和Ad-ASc-myc(b)感染后SGC7901细胞Western blot分析c-myc，bax基因蛋白表达(β-actin基因作为内对照) 1:细胞对照；2-5:感染后1 d、3 d、5 d、7d 图8 SGC7901细胞Ad-RA538及Ad-ASc-myc重组体腺病毒感染后裸鼠皮下致瘤实验 1：Ad-lacZ；2：PBS；3：Ad-RA538；4:Ad-ASc-myc
, 百拇医药
Fig 1 DNA ladder of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 cells Fig 2 TUNEL assay of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 cells Fig 3 RT-PCR analysis RA538 gene expression of SGC7901 cell infected Fig 4 RT-PCR analysis bax gene expression of SGC 7901 cells infected with Ad-RA538 Fig 5 RT-PCR analysis c-myc gene expression of SGC7901 cell infected with Ad-RA538 Fig 6 RT-PCR analysis bcl-2 gene expression of SGC 7901 cell infected with Ad-RA538 Fig 7 Western blot analysis c-myc and bax gene expression of SGC7901 cells infected with Ad-RA538 (a) and Ad-ASc-myc (b) Fig 8 Tumorigenicity assay in nude mice following Ad-RA538 and Ad-ASc-myc treatment
, 百拇医药
图9 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型治疗结果
Fig 9 In vivo therapy of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 tumors in nude mice
本实验的结果表明，Ad-RA538及Ad-ASc-myc对c-myc基因高表达的胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用，其作用是c-myc、bcl-2、bax、cyclinD1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果。文献也报道了c-myc、bcl 2、cyclin D1及bax基因之间存在相互作用[12，13]。我们的实验结果证实Ad-RA538及Ad-ASc-myc作用极为相似，在用于胃癌基因治疗方面均具有一定的应用价值。
基金项目：国家“863”计划资助项目(Z20-01-02)
, 百拇医药
通信作者：陈洁平(E-mail:jpchen@public.cta.cq.cn)
作者单位：陈洁平(400038重庆，第三军医大学西南医院消化科)
徐采朴(400038重庆，第三军医大学西南医院消化科)
林晨(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
张雪艳(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
付明(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
吴旻(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
参考文献
[1] Feng L, Wang XQ, Wu M, et al.A new method for isolating differentiation-including gene from human esophageal cell line. Sci China (Series B), 1991,20∶1059-1066.[冯骆，王秀琴，吴旻，等.从人食管癌细胞系分离分化基因的新方法.中国科学(B辑)，1991，20∶1059-1066.]
, http://www.100md.com
[2]Yang SZ, Wang XQ, Wu M, et al.Retinoic acid acting-gene cDNA RA538 induces terminal differentiation and apoptosis on human esophageal cell line. Sci China (Series C),1996,26∶560-566.[闫水忠，王秀琴，吴旻，等.维甲酸激活基因cDNA RA538诱发人食管癌细胞终末分化凋亡.中国科学(C辑)，1996，26∶560-566.]
[3]Zhao X, Wan X, Zhou C, et al. Abrupt reduction of c-myc expression by antisense RNA inducing terminal differentiation and apoptosis of a human esophageal cancer cell. Sci China (Series B), 1995, 38∶580-589.
, http://www.100md.com
[4]Yang XG, Reng LQ, Wu M, et al.Studies of the suppressive effect of cDNA RA538 on three human cancer cell line. Chung Kuo I Hsueh Ko Hsueh Yuna Hsueh Pao,1994,16(4)∶245-250.[杨晓光，任力强，吴旻，等.cDNA RA538对三种人癌细胞系抑制作用的研究.中国医学科学院学报.1994，16(4)：245-250.]
[5]Bouillet P, Sapin V, Chazaud C, et al. Development expression pattern of stra 6, a retinoic acid-responsive gene encoding a new type of membrane protein. Mech Dev, 1997, 2∶173-186.
, http://www.100md.com [6]Ryan KM, Birnie GD. Myc oncogens:the enigmatic family. Biochem J, 1996, 314(pt3)∶713-721.
[7]Leonetli C, D′Agnano I, Lozupone F, et al. Antitumor effect of c-myc antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides on human melanoma cells in vitro and in mice. J Natl Cancer Inst, 1996, 88∶419-429.
[8]Evan GI, Wyllie AH, Gilberg CA, et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell, 1992, 69∶119-128.
, 百拇医药
[9]Merio GR, Cella N, Hynes NE. Apoptosis is accompanied by changes in bcl-2 and bax expression induced by loss of attachment and inhibited by specific extracellular matrix proteins in mammary epithelial cells. Cell Grath Differ, 1997, 8∶251-260.
[10]Harrington EA, Bennett MR, Fanidi A, et al. c-myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines. EMBO J, 1994, 13∶3286-3295.
[11]Kimura S, Maekawa T, Hirakawa K, et al. Alterations of c-myc expression by antisense oligodexoynucleoties enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res, 1995, 55∶1379-1384.
[12]Chiarugi V, Ruggiero M. Role of three cancers"master genes"p53, bcl-2 and c-myc on the apoptotic process. Tumori, 1996, 82∶205-209.
[13]Lovschall H, Kassem M, Mosekilde L. Apoptosis:molecular aspects. Nord Med, 1997, 112∶271-275., http://www.100md.com
摘 要 目的 比较全反式维甲酸诱导基因RA538及反义c-myc对人胃癌细胞的生物学特性，并探讨其作用的分子机理。方法 采用细胞生长曲线、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、逆转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹分析、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法，对RA538、反义c-myc重组腺病毒在人胃癌细胞系(SGC7901)中的生物学作用及其分子机理进行体内外研究。结果 RA538及反义c-myc重组体腺病毒(Ad-RA538及Ad-ASc-myc)对SGC7901细胞生长抑制率分别为76.3%和44.1%。DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc诱导SGC7901细胞凋亡。它们均能抑制SGC7901细胞c-myc、bcl-2、cyclinD1基因表达，并刺激bax基因表达，对p53、p16、TGase、ras基因的表达没有影响。经Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理的SGC7901细胞致瘤性消失。Ad-RA538及Ad-ASc-myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度，生长抑制率分别为60.7%和68.9%。结论 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用是c-myc、bcl-2、bax、cyclinD1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果，与p53、p16、TGase及ras基因的表达无明显关系。
, 百拇医药
关键词：腺病毒；基因治疗；胃癌；维甲酸；c-myc基因
RA538为用全反式维甲酸(retinoic acid, RA)诱导人食管癌细胞系，经消减杂交法得到的cDNA[1]。该基因能抑制恶性表型、诱导肿瘤细胞终末分化、凋亡及下调c-myc基因的表达[2]，其作用机理尚不清楚。计算机分析表明，RA538中部分核苷酸序列与c-myc基因的第2、3外显子有互补同源性。据此，我们设计用腺病毒介导，以人胃癌细胞(SGC7901)为靶细胞，比较研究RA538与反义c-myc对人胃癌细胞生物学作用，对细胞周期作用的差异，以及二者与肿瘤发生、发展、分化及凋亡相关基因的关系，进一步阐明RA538抑癌作用的分子机理，为胃癌的基因治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系 SGC7901细胞为人胃腺癌细胞系。293细胞为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。
, http://www.100md.com
1.2 重组体腺病毒的制备 RA538、反义c-myc及LacZ重组体腺病毒(Ad-RA538、Ad-ASc-myc、Ad-LacZ)为中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体构建而成。
1.3 细胞生长曲线(5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT) 采用96孔板，每孔接种细胞5000个，24 h内按不同感染强度(multiplicity of infection, MOI)感染腺病毒。于不同时间点加入MTT溶液(0.5 mg/ml)，4 h后加入DMSO，振摇数分钟后酶标仪检测每孔吸光度(A)(旧称光密度OD值)。
1.4 细胞DNA梯度降解(DNA ladder)的检测 收集细胞，加裂解液(1% NP40, 20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris HCl pH7.5)400 μl，离心取上清，加SDS至终浓度1%及RNA酶56℃作用2 h，乙醇沉淀DNA。以琼脂糖凝胶电泳观察。
, http://www.100md.com
1.5 细胞凋亡原位检测(TdT-mediated dUTP-biotin nic end labeling, TUNEL) 按试剂盒方法进行。
1.6 流式细胞仪(flew cytometry, FCM)检测 收集细胞，PBS清洗后，以70%乙醇固定18 h，离心后PBS洗1次，加RNA酶37℃作用2 h，加入PI(100 μg/ml)100 μl混匀，冰上作用30 min后在流式细胞仪上检测。
1.7 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)分析
1.7.1 细胞总RNA提取 按Promega公司的Total RNA Isolation System说明分别提取并纯化细胞系的RNA。
1.7.2 逆转录 采用Promega公司M-MLV逆转录试剂盒说明将细胞总RNA的mRNA逆转录(引物为Oligo dT)成cDNA。PCR条件：25 μl体系中cDNA2 μl，10×PCR buffer, 15 mmol/L MgCl2，4种dNTPs各25 μmol/L，每次加两对引物(目的基因及β-actin)各50 pmol/L, Taq酶1 U，反应在PCR仪中进行。95 ℃5 min。95 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃1 min，28～30个循环。PCR引物为腺病毒; RA538;c-myc;ASc-myc; bax; bcl-2; p53; p16; TGase; cyclin D1:C-Ki-ras; β-actin。
, 百拇医药
1.8 蛋白质印迹(Western blot)分析 RIPA裂解液(0.01 mol/L Tris.HCl pH7.5, 0.15 mol/L NaCl，1% Triton X-100、0.1%SDS pH7.4)裂解细胞，提取总蛋白。制备12%SDS聚丙烯酰胺凝胶。采用Bio-Rad公司的垂直电泳装置进行电泳，蛋白上样量为40 μg。按Bio-Rad公司的转膜装置将蛋白样本转移至硝酸纤维膜上。电泳及转膜条件见产品说明书。杂交按Amershan公司的ECL Western blotting kit说明进行。将膜置暗盒中，X光片曝光。
1.9 裸鼠致瘤性及皮下移植瘤模型治疗实验
1.9.1 裸鼠致瘤性 接种SGC7901细胞于60 mm培养皿中，贴壁后按MOI 100加入腺病毒，24 h内消化细胞，制成106/0.1 ml细胞悬液，100 μl/只接种于裸鼠右上肢背侧皮下。每组3只5周龄鼠。连续观察肿瘤出现时间和体积，时间为1个月。
, 百拇医药
1.9.2 裸鼠皮下移植瘤模型 收集对数生长期细胞，制成1×107 cell/ml细胞悬液，按100 μl/只量接种于裸鼠皮下(5周龄鼠)，待肿瘤长至5 mm左右时，随机分组，每组5只，肿瘤内注射重组病毒液(109 U病毒)或PBS 0.1 ml，隔日注射1次，共3次，连续观察肿瘤大小。
1.10 统计学分析 采用χ2检验及t检验。
2 结果
2.1 重组体腺病毒的制备 各种重组体腺病毒，经293细胞扩增、纯化及滴度测定，PCR鉴定为阳性。
2.2 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对SGC7901细胞形态学影响及生长的抑制作用 以Ad-RA538及Ad-ASc-myc MOI 100感染SGC7901细胞，均于1～3 d开始出现细胞聚集，变圆，胞浆中有空泡，4～5 d后细胞浮起。Ad-LacZ组细胞无明显形态变化。MTT法显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901细胞均具有明显的生长抑制作用，生长抑制率分别为76.3%和44.1%(MOI 200，8 d)，与Ad-LacZ相比P<0.01，结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对SGC7901细胞生长的抑制作用(8 d)
Table 1 Anti-proliferative effect of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 cells(8 days)
MOI
(感染强度)
Ad-RA538
Ad-ASc-myc
Ad-LacZ
±s, 百拇医药
(均数±标准差)
Survival(%)
(存活率)
±s(均数±标准差)
Survival(%)
(存活率)
±s(均数±标准差)
, 百拇医药 Survival(%)
(存活率)
25
1.062±0.050
94.0
±4.5
1.260±0.036
98.4
±2.8
1.281±0.090
100.0
±7.0
, 百拇医药 50
0.941±0.067
84.0
±6.0
1.244±0.064
97.1
±5.0
1.268±0.076
99.0
±5.9
100
0.534±0.091
, 百拇医药 47.4
±8.1*
1.045±0.073
81.6
±5.7*
1.250±0.035
97.6
±2.7
200
0.265±0.090
23.7
±8.0*
, 百拇医药
0.716±0.070
55.9
±5.5**
1.206±0.081
94.1
±6.3
MOI：multiplicity of infection;* vs Ad-Lac Z P<0.05；**：P<0.01(与Ad-LacZ比较 * P<0.05； ** P<0.01)
2.3 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对SGC7901细胞的凋亡诱导作用 Ad-RA538及Ad-AS c-myc作用第2 d、4 d、6 d后均出现明显的DNA ladder现象(图1)。细胞凋亡原位检测法显示Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理的SGC7901细胞出现明显的凋亡(图2)。FCM分析显示SGC7901细胞经Ad-RA538及Ad-ASc-myc作用后4 d、6 d均出现S期及G2M期阻滞。Ad-RA538处理的SGC7901细胞2 d、4 d、6 d的凋亡峰分别为34.2%、18.2%及22%。Ad-ASc-myc 2 d、4 d、6 d凋亡峰分别为1.6%、2.9%及50.7%。
, 百拇医药
2.4 Ad-RA538、Ad-ASc-myc对SGC7901细胞基因表达的调控作用 分别提取经Ad-RA538和Ad-ASc-myc处理1 d、3 d、5 d、7 d后及对照组细胞总RNA，RT-PCR分析发现：在SGC7901细胞内未检测到内源性RA538的表达，经Ad-RA538处理后RA538表达显著增加。两个处理组中，c-myc基因表达均不同程度地降低，Bcl-2基因表达显著下降，Bax基因表达明显增加，cyclinD1表达逐渐下降，而p53、p16、TGase、c-ki-ras基因表达均无明显变化，见图3～6。分别提取Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理组1 d、3 d、5 d、7 d的细胞总蛋白。Western blot分析显示：两组c-myc基因表达均呈不同程度降低，bax基因表达显著增加(图7)。
2.5 Ad-RA538及Ad-ASc-myc的裸鼠体内抗瘤效应 裸鼠致瘤性：Ad-RA538及Ad-ASc-myc处理组1 m时成瘤率均为零，而Ad-LacZ组及PBS组(Mock)成瘤率均为100%(P<0.01)(图8)。裸鼠皮下移植瘤模型：Ad-RA538及Ad-ASc-myc对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型治疗结果显示，1 m后肿瘤平均体积明显小于对照组(P<0.01)，对肿瘤的生长抑制率Ad-RA538为60.7%，Ad-ASc-myc为68.9%(1 m时)，结果见图9。
, http://www.100md.com
3 讨论
以往的研究显示，RA538具有抑制肿瘤细胞恶性表型，诱导肿瘤细胞凋亡及下调c-myc的作用[2]。计算机分析发现RA538 cDNA中部分核苷酸序列与c-myc基因的第2、3外显子具有互补同源性，提示其对c-myc的下调作用可能与封闭c-myc转录的mRNA有关。反义c-myc采用c-myc基因含有起始密码子的第2外显子及其两侧部分内含子序列共1.53 kb片段构建而成[3]。由于两者结构上存在的共同点，为比较研究它们的作用及其机理提供了条件。采用RA538及反义c-myc的重组腺病毒感染胃癌SGC7901细胞均显示明显的生长抑制，生长抑制率分别为76.3%及44.1%，经TUNEL及DNA Ladder证实两者均能诱导SGC7901细胞的凋亡。裸鼠实验显示经Ad-RA538或Ad-ASc-myc处理的细胞无体内致瘤性；二者对皮下移植瘤生长抑制率分别为60.7%及68.9%，提示RA538基因的表达可抑制胃癌细胞生长，诱导凋亡。与文献报道在其他肿瘤细胞系中的作用一致[1，2，4]。反义c-myc具有与RA538类似的作用，可能与两者结构上的相似有关。
, http://www.100md.com
目前的资料认为，RA对某些肿瘤细胞具有抑制生长、诱导分化及凋亡作用，可以调节许多癌基因及抑癌基因的表达。RA538为RA诱导基因，本实验结果已经证实其对胃癌细胞具有诱导凋亡及抑制生长的作用。Bouillet等[5]也报道了RA诱导基因Stra6可以诱导肿瘤细胞凋亡。然而关于RA538是通过何种机理实现其对胃癌细胞的生长抑制及凋亡诱导作用；RA538及反义c-myc在结构及功能上极为相似，在基因调控方面是否存在差别等有待探讨。我们发现RA538及反义c-myc除抑制胃癌细胞c-myc基因表达外，还能抑制bcl-2、cyclinD1基因表达并刺激bax基因的表达。胃癌中存在c-myc基因的扩增及高表达。通过RA538及反义c-myc基因的表达实现c-myc基因的下调，从而诱导胃癌细胞凋亡，与多数文献报道的在凋亡过程中c-myc基因表达增加不同[6]。也有资料显示抑制c-myc表达可以诱导肿瘤细胞凋亡[7]，这与我们的研究结果一致。出现这一矛盾结果可能的解释是，c-myc基因能诱导凋亡，但在c-myc高表达的肿瘤细胞，急剧的c-myc基因表达降低对其来说是致命的[3，7，8]。现有的研究发现bcl-2高表达可以引起肿瘤、延长细胞的生存期并抑制多种细胞的凋亡。Bax与bcl-2具有同源性，在细胞凋亡中其担负着与bcl-2相反的作用[9]。我们发现RA538及反义c-myc基因的表达均可促进bax基因的表达并抑制bcl-2基因的表达，而随着bax的表达增加和bcl-2表达的下降，胃癌细胞出现凋亡，说明bax的高表达及bcl-2表达的抑制可以诱导胃癌细胞的凋亡，与文献报道bax及bcl-2在其他细胞中的作用一致[9]。cyclinD1作为一种细胞周期调控蛋白，具有调节细胞周期及促进细胞增殖的作用。我们的研究显示，RA538及反义c-myc基因的高表达可以抑制cyclinD1基因的表达。因此RA538及反义c-myc的抑制胃癌细胞生长作用可能与cyclinD1表达的抑制有关。由于p53、p16、TGase、ras基因均与肿瘤生长抑制或凋亡有关。我们也对RA538及反义c-myc基因表达对它们的影响作了观察，结果显示p53、p16、TGaes、ras基因的表达无变化，表明在胃癌细胞中RA538及反义c-myc诱导的凋亡及生长抑制与p53、p16、TGaes及ras的表达无明显关系。在对细胞周期的作用方面，Ad-RA538及Ad-ASc-myc均表现为4、6 d S、G2M期阻滞，Ad-RA538凋亡高峰为2 d(34.2%)，Ad-ASc-myc凋亡高峰为6 d(50.7%)，两者相似。文献报道显示c-myc诱导的凋亡多发生在G1期阻滞的细胞[10]。而在c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞凋亡的作用中则显示对细胞周期无明显的影响[11]。本研究结果显示的细胞凋亡以S、G2M期阻滞为主，可能与c-myc、bcl-2、cyclinD1表达的抑制及bax表达的增加对细胞凋亡产生的综合作用有关。
, http://www.100md.com
图1 Ad-RA538及Ad-ASc-myc感染后7901细胞DNA梯度降解试验 1:Ad-lacZ(2d);2:Ad-RA538(2d);3:Ad-lacZ(4d);4:Ad-RA538(4d);5:Ad-lacZ(6d);6:Ad-RA538(6d)；7:Ad-lacZ(2d);8:Ad-ASc-myc(2d);9:Ad-lacZ(4d);10:Ad-ASc-myc(4d);11:Ad-lacZ(6d);12:Ad-ASc-myc(6d)图2 Ad-RA538及Ad-ASc-myc感染后SGC7901细胞TUNEL凋亡分析 图3 RT-PCR分析Ad-RA538感染后SGC7901细胞RA538基因的表达 图4 RT-PCR分析Ad-RA538感染后SGC7901细胞bax基因的表达 图5 RT-PCR分析Ad-ASc-myc感染后SGC7901细胞c-myc基因的表达 图6 RT-PCR分析Ad-ASc-myc感染后SGC7901细胞bcl-2基因的表达 图3～6中1:DNA marker; 2：细胞对照；3～6:1 d、3 d、5 d、7 d图7 Ad-RA538(a)和Ad-ASc-myc(b)感染后SGC7901细胞Western blot分析c-myc，bax基因蛋白表达(β-actin基因作为内对照) 1:细胞对照；2-5:感染后1 d、3 d、5 d、7d 图8 SGC7901细胞Ad-RA538及Ad-ASc-myc重组体腺病毒感染后裸鼠皮下致瘤实验 1：Ad-lacZ；2：PBS；3：Ad-RA538；4:Ad-ASc-myc
, 百拇医药
Fig 1 DNA ladder of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 cells Fig 2 TUNEL assay of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 cells Fig 3 RT-PCR analysis RA538 gene expression of SGC7901 cell infected Fig 4 RT-PCR analysis bax gene expression of SGC 7901 cells infected with Ad-RA538 Fig 5 RT-PCR analysis c-myc gene expression of SGC7901 cell infected with Ad-RA538 Fig 6 RT-PCR analysis bcl-2 gene expression of SGC 7901 cell infected with Ad-RA538 Fig 7 Western blot analysis c-myc and bax gene expression of SGC7901 cells infected with Ad-RA538 (a) and Ad-ASc-myc (b) Fig 8 Tumorigenicity assay in nude mice following Ad-RA538 and Ad-ASc-myc treatment
, 百拇医药
图9 Ad-RA538及Ad-ASc-myc对裸鼠胃癌皮下移植瘤模型治疗结果
Fig 9 In vivo therapy of Ad-RA538 and Ad-ASc-myc on SGC7901 tumors in nude mice
本实验的结果表明，Ad-RA538及Ad-ASc-myc对c-myc基因高表达的胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用，其作用是c-myc、bcl-2、bax、cyclinD1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果。文献也报道了c-myc、bcl 2、cyclin D1及bax基因之间存在相互作用[12，13]。我们的实验结果证实Ad-RA538及Ad-ASc-myc作用极为相似，在用于胃癌基因治疗方面均具有一定的应用价值。
基金项目：国家“863”计划资助项目(Z20-01-02)
, 百拇医药
通信作者：陈洁平(E-mail:jpchen@public.cta.cq.cn)
作者单位：陈洁平(400038重庆，第三军医大学西南医院消化科)
徐采朴(400038重庆，第三军医大学西南医院消化科)
林晨(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
张雪艳(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
付明(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
吴旻(中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室)
参考文献
[1] Feng L, Wang XQ, Wu M, et al.A new method for isolating differentiation-including gene from human esophageal cell line. Sci China (Series B), 1991,20∶1059-1066.[冯骆，王秀琴，吴旻，等.从人食管癌细胞系分离分化基因的新方法.中国科学(B辑)，1991，20∶1059-1066.]
, http://www.100md.com
[2]Yang SZ, Wang XQ, Wu M, et al.Retinoic acid acting-gene cDNA RA538 induces terminal differentiation and apoptosis on human esophageal cell line. Sci China (Series C),1996,26∶560-566.[闫水忠，王秀琴，吴旻，等.维甲酸激活基因cDNA RA538诱发人食管癌细胞终末分化凋亡.中国科学(C辑)，1996，26∶560-566.]
[3]Zhao X, Wan X, Zhou C, et al. Abrupt reduction of c-myc expression by antisense RNA inducing terminal differentiation and apoptosis of a human esophageal cancer cell. Sci China (Series B), 1995, 38∶580-589.
, http://www.100md.com
[4]Yang XG, Reng LQ, Wu M, et al.Studies of the suppressive effect of cDNA RA538 on three human cancer cell line. Chung Kuo I Hsueh Ko Hsueh Yuna Hsueh Pao,1994,16(4)∶245-250.[杨晓光，任力强，吴旻，等.cDNA RA538对三种人癌细胞系抑制作用的研究.中国医学科学院学报.1994，16(4)：245-250.]
[5]Bouillet P, Sapin V, Chazaud C, et al. Development expression pattern of stra 6, a retinoic acid-responsive gene encoding a new type of membrane protein. Mech Dev, 1997, 2∶173-186.
, http://www.100md.com [6]Ryan KM, Birnie GD. Myc oncogens:the enigmatic family. Biochem J, 1996, 314(pt3)∶713-721.
[7]Leonetli C, D′Agnano I, Lozupone F, et al. Antitumor effect of c-myc antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides on human melanoma cells in vitro and in mice. J Natl Cancer Inst, 1996, 88∶419-429.
[8]Evan GI, Wyllie AH, Gilberg CA, et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell, 1992, 69∶119-128.
, 百拇医药
[9]Merio GR, Cella N, Hynes NE. Apoptosis is accompanied by changes in bcl-2 and bax expression induced by loss of attachment and inhibited by specific extracellular matrix proteins in mammary epithelial cells. Cell Grath Differ, 1997, 8∶251-260.
[10]Harrington EA, Bennett MR, Fanidi A, et al. c-myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines. EMBO J, 1994, 13∶3286-3295.
[11]Kimura S, Maekawa T, Hirakawa K, et al. Alterations of c-myc expression by antisense oligodexoynucleoties enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res, 1995, 55∶1379-1384.
[12]Chiarugi V, Ruggiero M. Role of three cancers"master genes"p53, bcl-2 and c-myc on the apoptotic process. Tumori, 1996, 82∶205-209.
[13]Lovschall H, Kassem M, Mosekilde L. Apoptosis:molecular aspects. Nord Med, 1997, 112∶271-275., http://www.100md.com