氩激光诱发兔视网膜下新生血管的组织病理及超微结构观察
氩激光诱发兔视网膜下新生血管的组织病理及超微结构观察
白建伟 惠延年 李学荣
摘 要: 目的 探讨视网膜下新生血管(SRNV)的发病机制及发生、发展特点. 方法 用高强度氩激光光凝兔视网膜，光、 电镜观察视网膜、脉络膜组织病理及超微结构改变. 结果 光凝后1～3 d，光镜下光斑区Bruch膜及视网膜色素上皮(RPE)层断裂，组织水肿、出血、毛细血管闭塞. 电镜下光感受器细胞内、外节溶解，白细胞浸润，巨噬细胞聚集. 光凝后1 wk，新生血管长入光斑. 结论 高强度激光所造成的视网膜外层及脉络膜的破坏、局部缺血、炎性反应、出血等，在SRNV的发病机制中具有重要作用.
关键词：新生血管；激光光凝术；病理组织学；超微结构
, http://www.100md.com
0 引言
视网膜下新生血管(subretinal neovascularization, SRNV)，又称脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)是很多后极部眼底病的显著特征[1,2]. 许多学者认为，光凝疗法是治疗眼底新生血管唯一有效的方法. 而光凝疗法本身又可引起SRNV[3,4]. 目前，国内仅限于部分临床研究，对SRNV的病因、病理所知有限，对其发生、发展的特点及光凝治疗的一些规律尚在认识中. 我们采用高能量氩激光光凝兔视网膜诱发SRNV，对其发生、发展过程进行了组织病理及超微结构观察，有关方面的研究国内尚未见报道.
1 材料和方法
1.1 材料 动物模型用健康灰色家兔10只，体质量2.5～3 kg，雌雄兼用. 用氯胺酮(50 mg.kg-1)，异丙嗪(25 mg.kg-1)im麻醉，5 mL.L-1托品酰胺及10 mL.L-1新福林散瞳，5 mL.L-1的卡因点眼后安放三面镜，用美国HGM公司产Compac型激光机的氩蓝绿激光(波长488.0～514.5 nm)作视网膜光凝. 部位在视乳头及髓线下方约8～10 PD，激光功率0.9 W及0.7 W(左右眼随机决定激光用量)，曝光时间0.1 s，光斑直径50 μm. 每眼共作20个光凝斑，每光斑间距300 μm.
, 百拇医药
1.2 方法 分别于光凝后1,3 d，1,2,3,4,6 wk及3,4 mo处死动物，摘除眼球，去除眼前节，将眼后节组织置入30 mL.L-1戊二醛中固定24 h，切取光凝部位的眼组织，分成1 mm×3 mm的条块，继续固定24 h，再放入0.1 mol.L-1磷酸缓冲液中浸洗30 min，10 mL.L-1锇酸后固定1 h，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂812浸透包埋、聚合、切片厚1 μm，经美蓝及碱性复红染色后作光学显微镜检查. 用同一定位好的标本块作超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色后作透射电镜检查并照像.
2 结果
2.1 光学显微镜观察 光凝后1 d，光斑区Bruch膜及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)层断裂，组织水肿、出血. 脉络膜毛细血管闭塞、大血管破裂(Fig 1). 3 d时，RPE细胞肿胀、破损.1 wk时，水肿消退，RPE细胞呈层状增殖. 1～6 wk，光斑区见CNV，大部分位于光斑边缘(Fig 2,3). 光凝后3～4 mo，胶原纤维增生长入光斑.
, 百拇医药
图 1 光凝后1 d,光斑区Bruch膜(B)及视网膜色素上皮层(R)断裂，视网膜、脉络膜组织严重破损、水肿、出血，毛细血管闭塞.
Fig 1 One day after photocoagulation, disruption of
the Bruch membrane and RPE, Severe damage to the retina
and choroid tissue, edema, hemorrhage, closing up of
choroidal capillaries under light microscope ×400
, 百拇医药
图 2 光凝后1 wk，光斑边缘视网膜下腔见新生血管 (NV)
Fig 2 One week after photocoagulation, neovascularization (NV)
in subretinal space at spots edge ×400
图 3 光凝后4 wk，光斑边缘视网膜下腔内见新生血管(NV)，周围有RPE增殖
Fig 3 Four weeks after of photocoagulation, neovascularization (NV)
, 百拇医药
in subretinal space at spots edge. surrouned by RPE eclls (R) of hyperplasia
2.2 透射电镜观察 光凝后1 d，光斑区光感受器细胞内、外节溶解，白细胞浸润、巨噬细胞聚集(Fig 4)，内、外核层及RPE细胞核凝固坏死. 3 d时，光斑边缘RPE细胞内线粒体大量空泡变性. 光凝后1 wk，光斑边缘脉络膜毛细血管增生，沿断裂的Bruch膜长入光斑(Fig 5). 光斑中心区仍见巨噬细胞. 光凝后2 wk，光斑中心基底部见新生血管. 3 wk时，视网膜下腔有内皮细胞增生. 周围有RPE细胞增殖包绕(Fig 6). 光凝后4 wk，光斑边缘视网膜下腔见大量新生血管. 在另一些标本中，视网膜下腔有新生血管，附近可见周细胞(Fig 7). 2 mo时，光斑边缘仍见脉络膜毛细血管增生长入光斑. 3～4 mo，光斑区见大量胶原纤维. (0.9 W及0.7 W激光功率,光凝后眼底改变及病理检查结果基本相同，无统计学差异[4]，以下不再分述).
, 百拇医药
图 4 光凝后1 d, 光斑区光感受器细胞内、外节溶解，周围有白细胞浸润(箭头)，巨噬细胞聚集 (M)
Fig 4 One day after photocoagulation, photoreceptor cells dissolved,with leukocytes (arrow) & macrophages infiltration (M) ×2500
图 5 光凝后1 wk, 光斑边缘脉络膜毛细血管增生，沿断裂的Bruch膜(B)
长入光斑. RPE细胞(R)增殖呈纺锤形. 箭头示脉络膜毛细血管基底膜
, 百拇医药 Fig 5 One week after photocoagulation, the hyperplasia of
choroidal capillaries at spots edge into spots along the
disrupted Bruch membrane. RPE cells hyperplasia in spindles shape.
Choroidal capillaries basilar membrane (arrow) ×7500
图 6 光凝后3 wk，光斑边缘视网膜下腔有内皮细胞(E)增生，部分管腔(L)形成，周围有RPE细胞(R)增殖. 箭头示基底膜
, 百拇医药
Fig 6 Three weeks after photocoagulation, endothelial cells (E)
hyperplasia in subretinal space at laser burns site, formed partly
vascular lacuna(L), neovascularization surrouned by RPE cells (R)
of hyperplasia. Basilar membrane (arrow) ×2500
图 7 光凝后4 wk, 光斑边缘视网膜下腔内见新生血管(NV)，附近可见周细胞(P) 箭头示Bruch膜
, http://www.100md.com
Fig 7 Four weeks after photocoagulation, neovascularization (NV)
in subretinal space at spots edge. Near by
the perithelial cells(P). Bruch membrane(B) ×2500
3 讨论
本结果显示，光凝后视网膜、脉络膜有严重破损，视网膜外层尤为显著. 脉络膜毛细血管几乎全部闭塞. 光凝后1 wk，光、电镜观察亦表明有脉络膜毛细血管增生，长入光斑边缘. 3～4 wk时，视网膜下腔已有大量新生血管形成. 以上观察结果提示,高强度激光所造成的Bruch膜破裂，视网膜外层、RPE损伤，出血、炎性反应，以及脉络膜缺血等改变，在SRNV的发病过程中具有重要作用. Itagaki等[5-7]报告猴眼CNV常于光凝后2～4 wk形成，本实验兔眼CNV的发生时间为1 wk. 猴眼虽有类似人眼的有利因素，但不易获得，且CNV形成时间长是一个缺点，有关氩激光诱发兔SRNV动物模型方面的文献国外尚少见报道, 国内未见报道.
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近年来的研究认为，高强度激光(0.6～0.9)W，小直径光斑(50～100)μm，短时间曝光(0.1 s)，是诱发SRNV的重要条件[5,6]，同时临床病理及实验研究也表明，SRNV的形成有二个条件，一是Bruch膜的裂隙，二是外层视网膜细胞结构和成分的改变[8]. 但对于缺血的作用仍有争论. Acher等[8]认为，缺氧似不是主要原因. 我们观察到，凡是有新生血管生长的光斑，都有严重的Bruch膜、RPE层的断裂，视网膜组织的破损、出血. RPE—Bruch膜—脉络膜毛细血管复合体，在视网膜代谢及维持视网膜各项功能中起重要作用. RPE与Bruch膜在脉络膜与视网膜之间共同起着重要的屏障作用. 一旦屏障破坏，脉络膜毛细血管闭塞，造成缺血，引起局部缺氧，就可能刺激新生血管自脉络膜生长，并进入RPE下间隙. 我们还注意到视网膜外层及脉络膜侧炎症反应明显，如炎细胞及巨噬细胞浸润，尤其光凝后1 wk在光斑中心区仍能见到巨噬细胞. 我们认为CNV的发生还可能与损伤的视网膜组织释放某种刺激因子及细胞炎性介质的释放尤其是巨噬细胞的作用有直接关系. 本实验电镜检查显示,RPE细胞破坏严重，增殖旺盛，尤其在新生血管周围表现明显. 此点提示,RPE细胞在SRNV发生过程中可能起着某种重要作用. 同时这些改变也可以看作是对邻近组织缺血、缺氧的一种血管反应，Bruch膜的破裂提供了一个可供新生血管长入的通道. 我们认为，SRNV是损伤修复过程在眼部的一种特殊类型的病理反应.
, 百拇医药
作者简介：白建伟(1952-)，女(汉族)，北京市通州区人. 副主任医师,副教授，硕士. 发表论文23篇. Tel.(029)3375668 Email. bjwei@fmmu.edu.cn
白建伟(第四军医大学 西京医院眼科)
惠延年(第四军医大学 西京医院眼科)
李学荣(电镜室， 陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] 白建伟， 惠延年，张 鹏. 老年黄斑变性视网膜下新生血管膜[J]. 第四军医大学学报， 1995；16(6)：478-479.
[2] 廖菊生. 中心性渗出性脉络膜视网膜病变[A]. 见：李凤鸣. 眼科全书[M]. 第7卷, 北京: 人民卫生出版社, 1996:2271-2273.
, 百拇医药
[3] Ryan SJ, Stout JT, Dugel PL. Subretinal neovascularization[A]. In: Ryan SJ ed. Retina[M]. 2nd ed St Louis: Mosby, 1994: 1027-1047.
[4] 白建伟，惠延年， 张 鹏. 氩激光诱发兔视网膜下新生血管的眼底荧光血管造影[J]. 第四军医大学学报， 1997；18(3)：278-280.
[5] Itagaki T, Ohkuma H, Katoh N et al. Studies on exprimental subretinal neovascularization. 1 Development of experimental subretinal neovascularization[J]. Acta Soc Ophthalmol Jpn, 1985; 85(4):600-610.
, 百拇医药
[6] Ryan SJ. Subretinal neovascularization: Natural history of an experimental model[J]. Arch Ophthalmol, 1982; 100(1): 1804-1809.
[7] Mizukawa A, Okisaka S, Jing LG. Histopathological study on the monkey retina and choroid by diode laser endophotocoagulation[J]. Acta Soc Ophthalmol Jpn, 1991; 5(2):114-122.
[8] Archer DB, Gardiner TA. Morphologic, fluorescein angiographic, and light microscopic features of experimental choroidal neovascularization[J]. Am J Ophthalmol. 1981; 91(3): 297-311., http://www.100md.com
白建伟 惠延年 李学荣
摘 要: 目的 探讨视网膜下新生血管(SRNV)的发病机制及发生、发展特点. 方法 用高强度氩激光光凝兔视网膜，光、 电镜观察视网膜、脉络膜组织病理及超微结构改变. 结果 光凝后1～3 d，光镜下光斑区Bruch膜及视网膜色素上皮(RPE)层断裂，组织水肿、出血、毛细血管闭塞. 电镜下光感受器细胞内、外节溶解，白细胞浸润，巨噬细胞聚集. 光凝后1 wk，新生血管长入光斑. 结论 高强度激光所造成的视网膜外层及脉络膜的破坏、局部缺血、炎性反应、出血等，在SRNV的发病机制中具有重要作用.
关键词：新生血管；激光光凝术；病理组织学；超微结构
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0 引言
视网膜下新生血管(subretinal neovascularization, SRNV)，又称脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)是很多后极部眼底病的显著特征[1,2]. 许多学者认为，光凝疗法是治疗眼底新生血管唯一有效的方法. 而光凝疗法本身又可引起SRNV[3,4]. 目前，国内仅限于部分临床研究，对SRNV的病因、病理所知有限，对其发生、发展的特点及光凝治疗的一些规律尚在认识中. 我们采用高能量氩激光光凝兔视网膜诱发SRNV，对其发生、发展过程进行了组织病理及超微结构观察，有关方面的研究国内尚未见报道.
1 材料和方法
1.1 材料 动物模型用健康灰色家兔10只，体质量2.5～3 kg，雌雄兼用. 用氯胺酮(50 mg.kg-1)，异丙嗪(25 mg.kg-1)im麻醉，5 mL.L-1托品酰胺及10 mL.L-1新福林散瞳，5 mL.L-1的卡因点眼后安放三面镜，用美国HGM公司产Compac型激光机的氩蓝绿激光(波长488.0～514.5 nm)作视网膜光凝. 部位在视乳头及髓线下方约8～10 PD，激光功率0.9 W及0.7 W(左右眼随机决定激光用量)，曝光时间0.1 s，光斑直径50 μm. 每眼共作20个光凝斑，每光斑间距300 μm.
, 百拇医药
1.2 方法 分别于光凝后1,3 d，1,2,3,4,6 wk及3,4 mo处死动物，摘除眼球，去除眼前节，将眼后节组织置入30 mL.L-1戊二醛中固定24 h，切取光凝部位的眼组织，分成1 mm×3 mm的条块，继续固定24 h，再放入0.1 mol.L-1磷酸缓冲液中浸洗30 min，10 mL.L-1锇酸后固定1 h，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂812浸透包埋、聚合、切片厚1 μm，经美蓝及碱性复红染色后作光学显微镜检查. 用同一定位好的标本块作超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色后作透射电镜检查并照像.
2 结果
2.1 光学显微镜观察 光凝后1 d，光斑区Bruch膜及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)层断裂，组织水肿、出血. 脉络膜毛细血管闭塞、大血管破裂(Fig 1). 3 d时，RPE细胞肿胀、破损.1 wk时，水肿消退，RPE细胞呈层状增殖. 1～6 wk，光斑区见CNV，大部分位于光斑边缘(Fig 2,3). 光凝后3～4 mo，胶原纤维增生长入光斑.
, 百拇医药
图 1 光凝后1 d,光斑区Bruch膜(B)及视网膜色素上皮层(R)断裂，视网膜、脉络膜组织严重破损、水肿、出血，毛细血管闭塞.
Fig 1 One day after photocoagulation, disruption of
the Bruch membrane and RPE, Severe damage to the retina
and choroid tissue, edema, hemorrhage, closing up of
choroidal capillaries under light microscope ×400
, 百拇医药
图 2 光凝后1 wk，光斑边缘视网膜下腔见新生血管 (NV)
Fig 2 One week after photocoagulation, neovascularization (NV)
in subretinal space at spots edge ×400
图 3 光凝后4 wk，光斑边缘视网膜下腔内见新生血管(NV)，周围有RPE增殖
Fig 3 Four weeks after of photocoagulation, neovascularization (NV)
, 百拇医药
in subretinal space at spots edge. surrouned by RPE eclls (R) of hyperplasia
2.2 透射电镜观察 光凝后1 d，光斑区光感受器细胞内、外节溶解，白细胞浸润、巨噬细胞聚集(Fig 4)，内、外核层及RPE细胞核凝固坏死. 3 d时，光斑边缘RPE细胞内线粒体大量空泡变性. 光凝后1 wk，光斑边缘脉络膜毛细血管增生，沿断裂的Bruch膜长入光斑(Fig 5). 光斑中心区仍见巨噬细胞. 光凝后2 wk，光斑中心基底部见新生血管. 3 wk时，视网膜下腔有内皮细胞增生. 周围有RPE细胞增殖包绕(Fig 6). 光凝后4 wk，光斑边缘视网膜下腔见大量新生血管. 在另一些标本中，视网膜下腔有新生血管，附近可见周细胞(Fig 7). 2 mo时，光斑边缘仍见脉络膜毛细血管增生长入光斑. 3～4 mo，光斑区见大量胶原纤维. (0.9 W及0.7 W激光功率,光凝后眼底改变及病理检查结果基本相同，无统计学差异[4]，以下不再分述).
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图 4 光凝后1 d, 光斑区光感受器细胞内、外节溶解，周围有白细胞浸润(箭头)，巨噬细胞聚集 (M)
Fig 4 One day after photocoagulation, photoreceptor cells dissolved,with leukocytes (arrow) & macrophages infiltration (M) ×2500
图 5 光凝后1 wk, 光斑边缘脉络膜毛细血管增生，沿断裂的Bruch膜(B)
长入光斑. RPE细胞(R)增殖呈纺锤形. 箭头示脉络膜毛细血管基底膜
, 百拇医药 Fig 5 One week after photocoagulation, the hyperplasia of
choroidal capillaries at spots edge into spots along the
disrupted Bruch membrane. RPE cells hyperplasia in spindles shape.
Choroidal capillaries basilar membrane (arrow) ×7500
图 6 光凝后3 wk，光斑边缘视网膜下腔有内皮细胞(E)增生，部分管腔(L)形成，周围有RPE细胞(R)增殖. 箭头示基底膜
, 百拇医药
Fig 6 Three weeks after photocoagulation, endothelial cells (E)
hyperplasia in subretinal space at laser burns site, formed partly
vascular lacuna(L), neovascularization surrouned by RPE cells (R)
of hyperplasia. Basilar membrane (arrow) ×2500
图 7 光凝后4 wk, 光斑边缘视网膜下腔内见新生血管(NV)，附近可见周细胞(P) 箭头示Bruch膜
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Fig 7 Four weeks after photocoagulation, neovascularization (NV)
in subretinal space at spots edge. Near by
the perithelial cells(P). Bruch membrane(B) ×2500
3 讨论
本结果显示，光凝后视网膜、脉络膜有严重破损，视网膜外层尤为显著. 脉络膜毛细血管几乎全部闭塞. 光凝后1 wk，光、电镜观察亦表明有脉络膜毛细血管增生，长入光斑边缘. 3～4 wk时，视网膜下腔已有大量新生血管形成. 以上观察结果提示,高强度激光所造成的Bruch膜破裂，视网膜外层、RPE损伤，出血、炎性反应，以及脉络膜缺血等改变，在SRNV的发病过程中具有重要作用. Itagaki等[5-7]报告猴眼CNV常于光凝后2～4 wk形成，本实验兔眼CNV的发生时间为1 wk. 猴眼虽有类似人眼的有利因素，但不易获得，且CNV形成时间长是一个缺点，有关氩激光诱发兔SRNV动物模型方面的文献国外尚少见报道, 国内未见报道.
, http://www.100md.com
近年来的研究认为，高强度激光(0.6～0.9)W，小直径光斑(50～100)μm，短时间曝光(0.1 s)，是诱发SRNV的重要条件[5,6]，同时临床病理及实验研究也表明，SRNV的形成有二个条件，一是Bruch膜的裂隙，二是外层视网膜细胞结构和成分的改变[8]. 但对于缺血的作用仍有争论. Acher等[8]认为，缺氧似不是主要原因. 我们观察到，凡是有新生血管生长的光斑，都有严重的Bruch膜、RPE层的断裂，视网膜组织的破损、出血. RPE—Bruch膜—脉络膜毛细血管复合体，在视网膜代谢及维持视网膜各项功能中起重要作用. RPE与Bruch膜在脉络膜与视网膜之间共同起着重要的屏障作用. 一旦屏障破坏，脉络膜毛细血管闭塞，造成缺血，引起局部缺氧，就可能刺激新生血管自脉络膜生长，并进入RPE下间隙. 我们还注意到视网膜外层及脉络膜侧炎症反应明显，如炎细胞及巨噬细胞浸润，尤其光凝后1 wk在光斑中心区仍能见到巨噬细胞. 我们认为CNV的发生还可能与损伤的视网膜组织释放某种刺激因子及细胞炎性介质的释放尤其是巨噬细胞的作用有直接关系. 本实验电镜检查显示,RPE细胞破坏严重，增殖旺盛，尤其在新生血管周围表现明显. 此点提示,RPE细胞在SRNV发生过程中可能起着某种重要作用. 同时这些改变也可以看作是对邻近组织缺血、缺氧的一种血管反应，Bruch膜的破裂提供了一个可供新生血管长入的通道. 我们认为，SRNV是损伤修复过程在眼部的一种特殊类型的病理反应.
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作者简介：白建伟(1952-)，女(汉族)，北京市通州区人. 副主任医师,副教授，硕士. 发表论文23篇. Tel.(029)3375668 Email. bjwei@fmmu.edu.cn
白建伟(第四军医大学 西京医院眼科)
惠延年(第四军医大学 西京医院眼科)
李学荣(电镜室， 陕西 西安 710033)
参考文献:
[1] 白建伟， 惠延年，张 鹏. 老年黄斑变性视网膜下新生血管膜[J]. 第四军医大学学报， 1995；16(6)：478-479.
[2] 廖菊生. 中心性渗出性脉络膜视网膜病变[A]. 见：李凤鸣. 眼科全书[M]. 第7卷, 北京: 人民卫生出版社, 1996:2271-2273.
, 百拇医药
[3] Ryan SJ, Stout JT, Dugel PL. Subretinal neovascularization[A]. In: Ryan SJ ed. Retina[M]. 2nd ed St Louis: Mosby, 1994: 1027-1047.
[4] 白建伟，惠延年， 张 鹏. 氩激光诱发兔视网膜下新生血管的眼底荧光血管造影[J]. 第四军医大学学报， 1997；18(3)：278-280.
[5] Itagaki T, Ohkuma H, Katoh N et al. Studies on exprimental subretinal neovascularization. 1 Development of experimental subretinal neovascularization[J]. Acta Soc Ophthalmol Jpn, 1985; 85(4):600-610.
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[6] Ryan SJ. Subretinal neovascularization: Natural history of an experimental model[J]. Arch Ophthalmol, 1982; 100(1): 1804-1809.
[7] Mizukawa A, Okisaka S, Jing LG. Histopathological study on the monkey retina and choroid by diode laser endophotocoagulation[J]. Acta Soc Ophthalmol Jpn, 1991; 5(2):114-122.
[8] Archer DB, Gardiner TA. Morphologic, fluorescein angiographic, and light microscopic features of experimental choroidal neovascularization[J]. Am J Ophthalmol. 1981; 91(3): 297-311., http://www.100md.com