核酸疫苗及其在疾病免疫防治中的应用

http://www.100md.com 《第二军医大学学报》 2000年第6期

     核酸疫苗及其在疾病免疫防治中的应用

    孙树汉

    摘 要 自从发现质粒载体携带的基因能在小鼠肌细胞中表达，核酸免疫技术已愈来愈受到人们重视，并被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。仅在短短的几年时间内，有关的实验报道已涉及包括细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病以及肿瘤等预防和治疗的研究。本文就核酸疫苗的免疫机制、优越性、安全性，以及目前的研究进展状况作一综述。

    关键词：核酸类；疫苗；免疫机制

    核酸疫苗技术作为一种新的免疫接种手段，在它问世后不久就在感染性疾病及肿瘤的防治中显示出巨大的潜力。所谓核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。在1994年5月的世界卫生组织会议上，与会专家充分肯定了核酸疫苗应用的潜在价值，并认为核酸疫苗的研究与未来实施的用一种疫苗预防多种儿童期传染病的计划相一致。至目前的大量的实验结果表明：核酸疫苗不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。因此，我们相信，在21世纪核酸疫苗将成为生物高技术产业中的重要组成部分，它必将给人类带来巨大的社会效益和经济效益。

    1 核酸疫苗的背景

    1.1 核酸疫苗的发现 1990年Wolff等^[1]注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数月，甚至持续终生。1991年Williams等^[2]发现输入的外源基因在体内的表达产物可诱导免疫应答。Tang等^[3]将生长激素的基因导入小鼠皮内，小鼠产生了特异性的抗体，从而提出了基因免疫的概念。1993年Ulmer等^[4]证实小鼠肌肉注射编码甲型流感病毒核蛋白(NP)的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。此后，核酸疫苗引起医学界高度重视，并被认为是继减毒灭活疫苗和亚单位疫苗后的第三次疫苗革命。

    1.2 核酸疫苗的免疫机制 核酸疫苗可以引发全面的免疫应答反应^[5～7]。一方面，核酸疫苗导入宿主体内后，被抗原提呈细胞(APC)摄取，表达的蛋白质被细胞内蛋白酶体复合物降解为8～10个氨基酸多肽，多肽被内质网腔上的抗原转运蛋白(TAP)运送进入内质网，在那里与MHC-Ⅰ类分子及β₂-微球蛋白形成三聚体，三聚体移出细胞并定位在细胞膜上，从而诱导MHC-Ⅰ限制的抗原特异性的CTL，产生细胞免疫；另一方面，胞内表达的蛋白质通过分泌或细胞裂解释放入血，并被专职APC内吞，在内体中被降解为12～18个氨基酸的多肽，与此同时，胞浆内质网合成的MHC-Ⅱ类分子(含α，β，γ三链)也被高尔基体运至内体，在内体中，γ链被降解，剩余的MHC-Ⅱ类分子的α，β链与抗原肽结合成抗原肽-Ⅱ类分子复合物而提呈于APC表面，成为CD4⁺ Th细胞免疫监视的靶位，Th细胞分泌淋巴因子，刺激B细胞转化为浆细胞，产生抗体，诱导了抗原特异性的体液免疫应答。

    核酸疫苗不仅能全面诱导机体体液及细胞免疫反应，而且能够诱发局部的免疫应答和免疫记忆^[8]。如果用基因枪将包裹有核酸疫苗的金颗粒导入粘膜下，即可能被粘膜下丰富的粘膜相关淋巴组织中的淋巴细胞或粘膜上皮细胞摄取并表达，产生的抗原蛋白分子也很容易被局部丰富的APC识别、摄取、加工并提呈给Th细胞，进一步激活局部淋巴滤泡中的B细胞转化为浆细胞和Bm细胞，后者产生免疫记忆，前者可合成IgA，且两个IgA单体由J链连接在一起，通过粘膜时，由粘膜上皮细胞产生的分泌片与双体IgA连接，组成稳定的分泌型IgA随粘膜分泌液一起排出细胞，分布于粘膜表面，在粘膜局部防御感染中起十分重要的作用。

    此外，与其他类型疫苗不同的是核酸疫苗载体中的非编码免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)具有免疫佐剂功能^[9]，可有效诱导Th1应答。ISS由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元(motif)组成，在DNA疫苗的质粒载体DNA骨架中，氨苄抗性基因中的两个5′-AACGTT-3′序列就是具有较强活性的ISS。此结构在细菌DNA中比例较高，而在脊椎动物DNA中比例较少，并且，脊椎动物中80%以上的CpG均被甲基化。脊椎动物DNA和细菌DNA的这种显著差别可能是使CpG序列成为免疫刺激信号的基础。ISS可作用于多种免疫活性细胞。1995年，Krieg等^[10]发现，经CpG刺激后95%的B细胞进入细胞增殖期，并分泌IgM和IL-6。在体外将ISS作用于人单核/巨噬细胞可显著增加细胞中IFN-α，IFN-β，IL-12以及IL-18的mRNA表达。这些细胞因子的分泌可促进NK细胞活化和IFN-γ的合成，并使Th前体细胞向Th1细胞分化。

    1.3 核酸疫苗的优缺点

    1.3.1 核酸疫苗的优点 核酸疫苗的优越性为：(1)激发机体全面的免疫应答，其保守抗原的保护性免疫应答对不同亚型的病原体有交叉抵御作用；(2)核酸疫苗表达的抗原接近天然构象，抗原性强；(3)制备简单，成本低廉，易进行规模化生产，且运输保存方便；(4)能联合免疫，即可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将不同抗原基因的多种质粒联合应用，制备多价DNA疫苗；(5)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用。

    1.3.2 核酸疫苗潜在的危险性 一种疫苗是否有应用前景，其安全性不容忽视。核酸疫苗安全性方面尚有许多需要探讨的问题^[11]。如染色体整合、免疫耐受、自身免疫和抗DNA抗体形成等诸多可能性。目前在动物实验中尚未出现这些现象，但是，其安全性还需通过长期大量的观察和实验加以证实。

    2 核酸疫苗已取得的进展

    自核酸疫苗被发明以来的短短几年时间，它已引起了许多研究人员的高度重视，并在病毒、细菌、寄生虫等感染性疾病以及肿瘤等疾病的预防和治疗等领域进行了广泛和深入的研究，有的已进入临床试验阶段。目前核酸疫苗的研究进展及其所用的抗原基因见表1。

    表 1 核酸疫苗所用的抗原基因及其研究进展

    病原体

    抗 原

    目前研究情况

    病毒

    乙肝病毒

    表面抗原和核心抗原

    已进入临床试验

    (HBsAg，HBcAg)

    丙肝病毒

    核蛋白、核蛋白-乙肝

    小鼠体内实验

    表面抗原融合蛋

    白和表面糖蛋白

    单纯疱疹病毒

    糖蛋白B、糖蛋白D、已进入临床试验

    gD2和ICP27

    人类免疫缺陷

    表面糖蛋白、调节蛋

    完成非人类灵长目

    病毒Ⅰ型

    白、核心蛋白和参

    动物体内实验，与病毒复制的一

    联合药物治疗该

    些酶

    病已进入临床试

    验

    流感病毒

    血凝素、基质蛋

    完成鸡、雪貂、小

    白、核蛋白

    鼠和非人类灵长

    目动物的体内实

    验，已进入临床

    试验

    牛疱疹病毒

    糖蛋白

    小鼠和牛体内实验

    牛腹泻病毒

    主要糖蛋白gp53(E₂)

    小鼠体内实验

    人类巨细胞病毒

    ppUL83

    小鼠体内实验

    圣路易斯脑炎

    prM/E

    小鼠体内实验

    病毒(SLE)

    感染性造血硬化

    核蛋白和糖蛋白

    虹鳟鱼动物模型

    病毒

    淋巴细胞性脉络

    核蛋白、糖蛋白

    小鼠体内实验

    丛脑膜炎病毒

    麻疹病毒

    核蛋白、血凝素

    小鼠体内实验

    新城疫病毒

    F蛋白

    鸡体内实验

    狂犬病毒

    糖蛋白

    小鼠体内实验

    其他^

    细菌

    结核杆菌

    hsp65、抗原85

    已进入临床试验

    破伤风杆菌

    片段C

    小鼠体内实验

    其他^

    寄生虫

    疟原虫

    环子孢子抗原、已进入临床试验

    PyHEP17

    日本血吸虫

    副肌球蛋白

    小鼠体内实验

    利什曼原虫

    主要表面糖蛋白gp63

    小鼠体内实验

    囊虫病

    cC1和IL-4-cC1

    完成小鼠和猪的

    融合蛋白

    体内实验，可

    以降低感染率

    弓形虫

    p30蛋白

    小鼠体内实验

    肿瘤

    乳腺和结肠腺瘤

    癌胚抗原(CEA)

    已进入临床试验

    B细胞淋巴瘤

    免疫球蛋白

    已进入临床试验

    皮肤T淋巴细胞

    T细胞受体

    已进入临床试验

    瘤

    其他

    支原体

    支原体DNA表达

    小鼠体内实验

    文库和抗原A7-1,A7-2

    钩端螺旋体

    OmpL1 , LipL41，豚鼠体内实验

    FlaB

    ^ 乳头状瘤病毒、轮状病毒、登革热病毒、猴免疫缺陷病毒；

    ^ 痢疾、布鲁病、幽门螺杆菌等

    3 核酸疫苗研究的意义

    首先，核酸疫苗的研究具有深远的理论意义。由于核酸疫苗作为第三代新型疫苗，其多价、长期、高效等优点已日益被广大科研工作者所接受，并引起了广泛的重视；然而，对于其诱发免疫应答反应的机制研究远远落后于应用性研究。因此以核酸疫苗为研究对象，探讨其诱导免疫反应发生的机制；机体细胞、体液反应激活的信号传导通路；免疫激活序列增强免疫应答的机制；研究DNA疫苗诱发自身免疫及免疫耐受的可能性机制等一系列基础研究，对逐步阐明核酸疫苗防治疾病的基本原理，提高疾病的防治水平，均有十分重要的作用。

    其次，核酸疫苗的应用具有广泛的社会意义。在人类疾病的防治中有广泛的应用前景。许多新型生物治疗剂(如基因治疗产品)将用于治疗少数健康已受到严重损害的个人。相反，核酸疫苗接种的目标人群可能很大，健康且年轻。以乙肝核酸疫苗为例来说明核酸疫苗的应用价值，目前应用的预防乙肝的疫苗是亚单位疫苗，接种的费用是30元/人，而乙肝核酸疫苗一旦规模化生产，每个人的接种费用仅需几元钱，那么全国人口接种核酸疫苗节省的费用是非常可观的。核酸疫苗可用于细菌、病毒感染等多种疾病的防治，其潜在的应用价值是不可估计的。

    1995年，美国FDA已批准乙肝疫苗等至少10种DNA疫苗进入临床试验，这预示核酸疫苗在21世纪将成为人类与疾病抗争的有利武器。当然，核酸疫苗应用到临床尚需多方面共同的努力。首先，核酸疫苗的安全性是人们最忧虑的问题，这需要在非人类灵长目动物中做大量的实验来证实它的安全性；其二，各国政府应制定有利于核酸疫苗发展的政策；其三，核酸疫苗的研究尚需大量的资金投入。只要这几方面的问题解决了，在不久的将来，核酸疫苗将用于临床各种疾病的防治。

    【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39670659)

    【作者简介】孙树汉(1953～),男(汉族),博士,教授，博士生导师

    【作者单位】孙树汉(第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海 200433)

    参考文献

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