慢性乙型肝炎患者血清中肝特异性自身抗体的检测
慢性乙型肝炎患者血清中肝特异性自身抗体的检测
范列英 仲人前 孔宪涛 薛菖 徐玲玲
摘 要 目的：阐明慢性乙型肝炎中是否也存在肝特异性自身抗体及其在病情转归中的作用。方法：以猴肝组织切片和可溶性肝抗原为抗原基质，用间接免疫荧光和蛋白质印迹法检测337例慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清中的自身抗体。结果：免疫荧光法显示乙型肝炎后肝硬化自身抗体总的阳性率(24.07%)高于慢性乙型肝炎组(14.29%)，且两组均显著高于正常对照组。蛋白质印迹的阳性率各为43.42%和42.59%，两者无显著差异。两组病例靶抗原相对分子质量多集中在3.0万～5.5万之间，但肝硬化患者在相对分子质量2.5万和9.0万左右处的阳性条带均多于慢性肝炎患者。结论：慢性肝炎、肝硬化患者血清中存在抗肝组织自身抗体，其相对应的靶抗原有多种。进一步分离、鉴定有意义的靶抗原，并对其进行抗原表位、细胞表面表达等分析，将有助于探讨自身免疫在慢性肝炎发病及转归中的作用。
, 百拇医药
关键词：肝炎，乙型，慢性；肝硬化；自身抗体
近年来的研究显示，慢性肝炎病毒感染患者(主要是乙型和丙型)血清中存在多种抗核抗体[1,2]，因此自身免疫在病毒性肝炎病情发展及癌变中的作用受到研究者的高度重视。目前在自身免疫性肝炎中已鉴定出多种组织特异性自身抗体，在慢性乙型肝炎中是否也存在肝特异性自身抗体以及其在病情转归中的作用尚未阐明。本研究以猴肝组织切片和可溶性肝抗原为抗原基质，用间接免疫荧光和蛋白质印迹法检测337例慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清中的自身抗体，为进一步研究自身免疫在病毒性肝炎转归中的作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 临床资料 慢性乙型肝炎175例，其中男性101例，年龄27～70岁；女性74例，年龄30～67岁。乙型肝炎后肝硬化162例，其中男性97例，年龄27～78岁；女性65例，年龄45～80岁。患者均为本院感染科和消化科住院或门诊、经血清学检查确诊的患者(其中167例经病理检查确诊)。随机收集200例献血员血清作为正常对照组同时测定，男女比例为115∶85，年龄为18～55岁。
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1.2 检测方法
1.2.1 间接免疫荧光法检测自身抗体 收集患者空腹血清，以猴肝组织切片为抗原基质检测自身抗体。检测试剂盒由德国Euroimmuno公司惠赠。取25 μl血清(1∶100稀释)加在猴肝切片上，室温孵育30 min，PBS(pH7.2)含0.2% Tween 20洗片，滴加FITC标记的抗人免疫球蛋白抗体，室温30 min，洗片，以甘油封片，荧光显微镜(德国Leica公司)镜下观察。
1.2.2 可溶性肝抗原制备 用含10%小牛血清的RPMI1 640培养基培养正常人肝细胞株(L-02)，待细胞长满瓶后0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS离心洗涤3次。改用40 mmol/L Tris(含4% CHAPS,100 mmol/L DTT)悬浮细胞，超声粉碎细胞，20000 r/min 离心20 min。取上清，蛋白定量。
1.2.3 蛋白质印迹法检测肝特异性自身抗体 取1.2.2制备的肝抗原(5 mg/ml)进行SDS-PAGE电泳，胶浓度10%。常规法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%BSA(含0.05% Tween 20)封闭过夜。将硝酸纤维素膜剪成细条，加入1∶50稀释的血清，室温振荡1 h，洗涤5 min×3次。加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG，室温反应1 h，洗膜。加入底物BCIP/NBT 10 min后终止反应。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 间接免疫荧光法检测结果 慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化自身抗体总的阳性率分别达14.29%和24.07%，均显著高于正常对照组，其中肝硬化组高于慢性肝炎组。两组病例自身抗体种类较多，但均以抗核抗体为主(表1)。
表 1 免疫荧光法检测337例慢性肝病肝特异性自身抗体
Tab 1 The anti-liver tissue autoantibodies in 337 patients with chronic hepatitis and cirrhosis by immunofluorescence
Group
, http://www.100md.com
n
Autoantibodies′s patterns
Total postive(%)
H
S
N
C-G
C-S
Chronic hepatitis
175
25(14.29)***
6
, 百拇医药
12
6
3
1
Cirrhosis
162
39(24.07)***△
4
18
17
8
3
Normal control
, http://www.100md.com
200
6(3%)
2
3
1
0
0
H:Homogeneous； S:Speckled； N:Nucleolar； C-G:Granular in cytoplasm； C-S:speckled in cytoplasm；***P<0.001 vs normal control；
△ P<0.05 vs chronic hepatitis
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2.2 蛋白质印迹法检测结果 以出现明显条带者为阳性。175例慢性乙型肝炎和162例肝硬化患者抗可溶性肝抗原蛋白质印迹的阳性率各为43.42%和42.59%，两者无显著差异，但两组均显著高于正常对照组(18.7%)。两组病例靶抗原相对分子质量多集中在3.0万～5.5万之间、条带分布相似，但肝硬化患者在2.5万和9.0万左右处的阳性条带均显著多于慢性肝炎患者(表2)。正常对照组在相对分子质量2.0万、2.5万、4.0万和9.0万左右处无阳性条带。
表 2 175例慢性肝炎和162例肝硬化患者
体内自身靶抗原的差异
Tab 2 The difference between autoantigens in 175
chronic hepatitis and 162 cirrhosis
, http://www.100md.com
Positive bands
(Molecular mass)
Chronic hepatitis
(n)
Cirrhosis
(n)
Normal control
(n)
2.0 万
2
4
0
, 百拇医药
2.5 万
6
15*
0
4.0 万
6
12
0
9.0 万
0
21**
0
* P<0.05,** P<0.01 vs chronic hepatitis3 讨 论
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我国是乙型肝炎的高发区，约有10%～20%的急性乙肝将转成慢性肝炎、肝硬化，甚至发展成肝癌，严重地威胁着人们健康，因而急性乙肝慢性化发展的机制一直是医学界研究的热点。虽然目前尚未肯定自身免疫在慢性肝病的发病中起作用，但是现有的文献报道及我们的检测结果已证实，慢性病毒性肝炎患者体内存在自身抗体[1～3]。以人喉癌细胞株Hep-2细胞为抗原基质检测的结果显示，在包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎在内的慢性炎症性肝病中最常见的是器官非特异性的抗核抗体[4,5]。此外，早在1979年Kakumus等[6]报道慢性活动性肝炎，特别是慢性乙型肝炎的组织病理变化和生化指标与针对肝细胞膜蛋白自身抗体的效价密切相关，而与器官非特异性抗体如抗核抗体、抗平滑肌抗体的效价无关。
器官特异性自身免疫引起器官特异性损害。在自身免疫性肝炎中已鉴定出肝肾微粒体抗体、抗特异性肝可溶性抗原抗体、抗特异性脂蛋白抗体等肝特异性或相对特异性自身抗体，并已作为诊断自身免疫性肝炎的实验室指标[7]。在病毒性肝炎的发病中是否也存在有诊断意义的肝特异性自身抗体以及其在肝脏炎症慢性化发展、癌变中的作用等均未明确。本研究以猴肝组织切片为抗原基质来检测慢性肝炎和肝硬化血清中的自身抗体，结果发现两组病例中针对肝抗原的自身抗体阳性率显著高于正常对照组。测得的自身抗体种类较多，均以抗肝细胞核内蛋白抗体为主,说明在慢性肝炎病毒感染引起的慢肝和肝硬化患者体内确实存在针对自身肝组织的自身抗体。采用蛋白质印迹分析自身靶抗原的相对分子质量，发现正常对照组自身抗体的阳性率高达18.7%，主要原因是正常人血清中也存在一定量的自身抗体，加上某些非特异性条带。两组病例自身靶抗原的分子质量分布大部分相似，仅针对2.5万和9.0万蛋白抗原的自身抗体数显著高于慢性肝炎，表明在部分肝硬化患者体内发生了与慢性肝炎不同的自身免疫改变，进一步分离、鉴定这些靶抗原，并对其进行抗原表位、细胞表面表达等分析，将有助于探讨自身免疫在慢性肝炎发病及转归中的作用。
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参考文献
[1]Imai H,Nakano Y,Kiyosawa K,et al.Increasing titer and changing specificities of antinuclear antibodies in patients with chronic liver disease who develop hepatocellular carcinoma[J].Cancer,1993,71(1):26-35.
[2]Covini G,Muhlen CA,Pacchetti S,et al.Diversity of antinuclear antibody responses in hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,1997,26(6):1255-1265.
[3]范列英、仲人前，赵文静，等.原发性慢性肝病及原发性肝癌患者血清抗核抗体检测及其临床意义[J].上海免疫学杂志,2000,20(1):48-49.
, 百拇医药
[4]Strassburg CP,Alex B,Zindy F,et al.Identification of cyclin A as a molecular target of antinuclear antibodies(ANA) in hepatic and non-hepatic autoimmune diseases[J].J Hepatol,1996,25(6):859-866.
[5]Numata T,Kato J,Kohgo Y,et al.Autoantibody against a 78 kDa membrane protein of HepG2 cell in the sera of patients with alcoholic liver diseases[J].J Gastroenterol,1995,30(6):751-757.
[6]Kakumus S,Arakawa Y,Goji H,et al.Occurence and significance of antibody to liver-specific membrane lipoprotein by double-antibody immunoprecipitation method in sera of patients with acute and chronic liver diseases[J].Gastroenterology,1979,76(4):665-672.
[7]仲人前,孔宪涛.肝病免疫学[M].上海：上海科学技术文献出版社，1997.84-98., 百拇医药
范列英 仲人前 孔宪涛 薛菖 徐玲玲
摘 要 目的：阐明慢性乙型肝炎中是否也存在肝特异性自身抗体及其在病情转归中的作用。方法：以猴肝组织切片和可溶性肝抗原为抗原基质，用间接免疫荧光和蛋白质印迹法检测337例慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清中的自身抗体。结果：免疫荧光法显示乙型肝炎后肝硬化自身抗体总的阳性率(24.07%)高于慢性乙型肝炎组(14.29%)，且两组均显著高于正常对照组。蛋白质印迹的阳性率各为43.42%和42.59%，两者无显著差异。两组病例靶抗原相对分子质量多集中在3.0万～5.5万之间，但肝硬化患者在相对分子质量2.5万和9.0万左右处的阳性条带均多于慢性肝炎患者。结论：慢性肝炎、肝硬化患者血清中存在抗肝组织自身抗体，其相对应的靶抗原有多种。进一步分离、鉴定有意义的靶抗原，并对其进行抗原表位、细胞表面表达等分析，将有助于探讨自身免疫在慢性肝炎发病及转归中的作用。
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关键词：肝炎，乙型，慢性；肝硬化；自身抗体
近年来的研究显示，慢性肝炎病毒感染患者(主要是乙型和丙型)血清中存在多种抗核抗体[1,2]，因此自身免疫在病毒性肝炎病情发展及癌变中的作用受到研究者的高度重视。目前在自身免疫性肝炎中已鉴定出多种组织特异性自身抗体，在慢性乙型肝炎中是否也存在肝特异性自身抗体以及其在病情转归中的作用尚未阐明。本研究以猴肝组织切片和可溶性肝抗原为抗原基质，用间接免疫荧光和蛋白质印迹法检测337例慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清中的自身抗体，为进一步研究自身免疫在病毒性肝炎转归中的作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 临床资料 慢性乙型肝炎175例，其中男性101例，年龄27～70岁；女性74例，年龄30～67岁。乙型肝炎后肝硬化162例，其中男性97例，年龄27～78岁；女性65例，年龄45～80岁。患者均为本院感染科和消化科住院或门诊、经血清学检查确诊的患者(其中167例经病理检查确诊)。随机收集200例献血员血清作为正常对照组同时测定，男女比例为115∶85，年龄为18～55岁。
, 百拇医药
1.2 检测方法
1.2.1 间接免疫荧光法检测自身抗体 收集患者空腹血清，以猴肝组织切片为抗原基质检测自身抗体。检测试剂盒由德国Euroimmuno公司惠赠。取25 μl血清(1∶100稀释)加在猴肝切片上，室温孵育30 min，PBS(pH7.2)含0.2% Tween 20洗片，滴加FITC标记的抗人免疫球蛋白抗体，室温30 min，洗片，以甘油封片，荧光显微镜(德国Leica公司)镜下观察。
1.2.2 可溶性肝抗原制备 用含10%小牛血清的RPMI1 640培养基培养正常人肝细胞株(L-02)，待细胞长满瓶后0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS离心洗涤3次。改用40 mmol/L Tris(含4% CHAPS,100 mmol/L DTT)悬浮细胞，超声粉碎细胞，20000 r/min 离心20 min。取上清，蛋白定量。
1.2.3 蛋白质印迹法检测肝特异性自身抗体 取1.2.2制备的肝抗原(5 mg/ml)进行SDS-PAGE电泳，胶浓度10%。常规法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%BSA(含0.05% Tween 20)封闭过夜。将硝酸纤维素膜剪成细条，加入1∶50稀释的血清，室温振荡1 h，洗涤5 min×3次。加入碱性磷酸酶标记的抗人IgG，室温反应1 h，洗膜。加入底物BCIP/NBT 10 min后终止反应。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 间接免疫荧光法检测结果 慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化自身抗体总的阳性率分别达14.29%和24.07%，均显著高于正常对照组，其中肝硬化组高于慢性肝炎组。两组病例自身抗体种类较多，但均以抗核抗体为主(表1)。
表 1 免疫荧光法检测337例慢性肝病肝特异性自身抗体
Tab 1 The anti-liver tissue autoantibodies in 337 patients with chronic hepatitis and cirrhosis by immunofluorescence
Group
, http://www.100md.com
n
Autoantibodies′s patterns
Total postive(%)
H
S
N
C-G
C-S
Chronic hepatitis
175
25(14.29)***
6
, 百拇医药
12
6
3
1
Cirrhosis
162
39(24.07)***△
4
18
17
8
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Normal control
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200
6(3%)
2
3
1
0
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H:Homogeneous； S:Speckled； N:Nucleolar； C-G:Granular in cytoplasm； C-S:speckled in cytoplasm；***P<0.001 vs normal control；
△ P<0.05 vs chronic hepatitis
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2.2 蛋白质印迹法检测结果 以出现明显条带者为阳性。175例慢性乙型肝炎和162例肝硬化患者抗可溶性肝抗原蛋白质印迹的阳性率各为43.42%和42.59%，两者无显著差异，但两组均显著高于正常对照组(18.7%)。两组病例靶抗原相对分子质量多集中在3.0万～5.5万之间、条带分布相似，但肝硬化患者在2.5万和9.0万左右处的阳性条带均显著多于慢性肝炎患者(表2)。正常对照组在相对分子质量2.0万、2.5万、4.0万和9.0万左右处无阳性条带。
表 2 175例慢性肝炎和162例肝硬化患者
体内自身靶抗原的差异
Tab 2 The difference between autoantigens in 175
chronic hepatitis and 162 cirrhosis
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Positive bands
(Molecular mass)
Chronic hepatitis
(n)
Cirrhosis
(n)
Normal control
(n)
2.0 万
2
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2.5 万
6
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4.0 万
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* P<0.05,** P<0.01 vs chronic hepatitis3 讨 论
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我国是乙型肝炎的高发区，约有10%～20%的急性乙肝将转成慢性肝炎、肝硬化，甚至发展成肝癌，严重地威胁着人们健康，因而急性乙肝慢性化发展的机制一直是医学界研究的热点。虽然目前尚未肯定自身免疫在慢性肝病的发病中起作用，但是现有的文献报道及我们的检测结果已证实，慢性病毒性肝炎患者体内存在自身抗体[1～3]。以人喉癌细胞株Hep-2细胞为抗原基质检测的结果显示，在包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎在内的慢性炎症性肝病中最常见的是器官非特异性的抗核抗体[4,5]。此外，早在1979年Kakumus等[6]报道慢性活动性肝炎，特别是慢性乙型肝炎的组织病理变化和生化指标与针对肝细胞膜蛋白自身抗体的效价密切相关，而与器官非特异性抗体如抗核抗体、抗平滑肌抗体的效价无关。
器官特异性自身免疫引起器官特异性损害。在自身免疫性肝炎中已鉴定出肝肾微粒体抗体、抗特异性肝可溶性抗原抗体、抗特异性脂蛋白抗体等肝特异性或相对特异性自身抗体，并已作为诊断自身免疫性肝炎的实验室指标[7]。在病毒性肝炎的发病中是否也存在有诊断意义的肝特异性自身抗体以及其在肝脏炎症慢性化发展、癌变中的作用等均未明确。本研究以猴肝组织切片为抗原基质来检测慢性肝炎和肝硬化血清中的自身抗体，结果发现两组病例中针对肝抗原的自身抗体阳性率显著高于正常对照组。测得的自身抗体种类较多，均以抗肝细胞核内蛋白抗体为主,说明在慢性肝炎病毒感染引起的慢肝和肝硬化患者体内确实存在针对自身肝组织的自身抗体。采用蛋白质印迹分析自身靶抗原的相对分子质量，发现正常对照组自身抗体的阳性率高达18.7%，主要原因是正常人血清中也存在一定量的自身抗体，加上某些非特异性条带。两组病例自身靶抗原的分子质量分布大部分相似，仅针对2.5万和9.0万蛋白抗原的自身抗体数显著高于慢性肝炎，表明在部分肝硬化患者体内发生了与慢性肝炎不同的自身免疫改变，进一步分离、鉴定这些靶抗原，并对其进行抗原表位、细胞表面表达等分析，将有助于探讨自身免疫在慢性肝炎发病及转归中的作用。
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参考文献
[1]Imai H,Nakano Y,Kiyosawa K,et al.Increasing titer and changing specificities of antinuclear antibodies in patients with chronic liver disease who develop hepatocellular carcinoma[J].Cancer,1993,71(1):26-35.
[2]Covini G,Muhlen CA,Pacchetti S,et al.Diversity of antinuclear antibody responses in hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,1997,26(6):1255-1265.
[3]范列英、仲人前，赵文静，等.原发性慢性肝病及原发性肝癌患者血清抗核抗体检测及其临床意义[J].上海免疫学杂志,2000,20(1):48-49.
, 百拇医药
[4]Strassburg CP,Alex B,Zindy F,et al.Identification of cyclin A as a molecular target of antinuclear antibodies(ANA) in hepatic and non-hepatic autoimmune diseases[J].J Hepatol,1996,25(6):859-866.
[5]Numata T,Kato J,Kohgo Y,et al.Autoantibody against a 78 kDa membrane protein of HepG2 cell in the sera of patients with alcoholic liver diseases[J].J Gastroenterol,1995,30(6):751-757.
[6]Kakumus S,Arakawa Y,Goji H,et al.Occurence and significance of antibody to liver-specific membrane lipoprotein by double-antibody immunoprecipitation method in sera of patients with acute and chronic liver diseases[J].Gastroenterology,1979,76(4):665-672.
[7]仲人前,孔宪涛.肝病免疫学[M].上海：上海科学技术文献出版社，1997.84-98., 百拇医药