陕西人群Rb1.20位点的VNTR多态性与食管癌遗传易感性相关
陕西人群Rb1.20位点的VNTR多态性与食管癌遗传易感性相关
秦鸿雁 舒青 刘素英 马群风
摘 要：目的 探讨陕西人群Rb1.20位点VNTR多态性是否与食管癌遗传易感性有关. 方法 应用PCR方法对陕西正常个体外周血(50例)、食管癌组织(36例)、食管癌癌旁组织(27例)Rb基因20内含子VNTR区进行了检测. 结果 共检出5个等位基因片段：385 bp(A)，370 bp(B)，355 bp(C)，330 bp(D)和325 bp(E). 在正常人群中， 其等位基因频率分别为：A 0.31，B 0.15，C 0.07，D 0.05，E 0.42，杂合性为72%，PIC为0.70；在食管癌癌组织中，其等位基因频率分别为：A 0.15，B 0.17，C 0.17，D 0.36和E 0.15，PIC为0.77；在食管癌癌旁组织中，其等位基因频率分别为：A 0.11，B 0.30，C 0.11，D 0.43和E 0.06，杂合性为22%，PIC 为0.70. Rb1.20位点VNTR多态性在不同群体中有显著差异. 结论 推测 Rb1.20位点的VNTR多态性与食管癌遗传易感性有关.
, 百拇医药
关键词:重复序列,核酸；聚合酶链反应；食管癌；易感性
0 引言
数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR ) 是人类基因组中近年来常用的一 种多态标记, 其应用十分广泛[1]. Rb1.20位点位于13q14，为Rb基因 20 内含子VNTR区，重复单位4 bp～5 bp，重复次数10～26次，是一理想的遗传标记[2]. 食管癌是我国常见的恶性肿瘤，具高发区和家族聚集现象，陕西也是该疾病的高发区之一. 有关食管癌的Rb基因研究报道已有不少，但有关Rb基因的VNTR多态性与食管癌的遗传易感性的研究目前尚未见报道. 为此，我们应用PCR-VNTR技术对陕西人群Rb1.20位点VNTR多态性进行检测并探讨了Rb1.20位点VNTR多态性与食管癌遗传易感性之间的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 陕西地区正常人群外周血样50例，由西京医院血库提供. 食管癌(鳞癌)组织 36 例及癌旁组织27例，取自唐都医院胸外科手术标本，经病理组织切片确诊.
1.2 方法 常规酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA和癌组织及癌旁组织DNA. PCR反应总体积为30 μL，含基因组DNA 0.5 μg，dNTP100 μmol.L-1，1×PCR缓冲液(10 mmol.L-1 Tris-HCl, 50 mmol.L-1 KCl，pH 9.0，1 g.L-1 Triton-100，1.5 mmol.L-1 MgCl2，0.1 g.L-1 gelatin)，引物浓度各为100 μmol.L-1. 引物序列为5′-AATTAACAAGGTGTGGTGGT-3′及5′-AAGTAAGAAAATCAAGCACTT-3′(美联公司合成). 经 97℃变性10 min后，在94℃加入Taq DNA聚合酶2.5 U(上海Promega公司)，加30 μL石蜡油覆盖，然后进入循环. Rb1.20扩增的反应条件为：94℃变性30 s，52℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个周期循环后，72℃延伸10 min(PCR仪为PE公司480型). 扩增产物以Marker(上海复华公司)为对照，80 g.L-1普通聚丙烯酰胺凝胶电泳后，溴化乙锭染色，观察结果.
, 百拇医药
2 结果
陕西地区正常人群外周血50 例遗传上无关个体基因组DNA经PCR扩增后，检测出385，370，355，330和325 bp 5个等位基因片段(Fig 1)，其频率分别为： 0.31， 0.15，0.07，0.05及0.42，杂合子频率为72%(Tab 1). 根据检测结果计算得其多态信息量(polymorphism information contents，PIC)为0.70.
图 1 Rb1.20位点VNTR等位基因片段(5个)
Fig 1 Five allele fragments of Rb1.20 locus VNTR
表 1 陕西地区正常人群Rb1.20位点VNTR的多态分布
Tab 1 Polymorphism distribution of Rb1.20 VNTR
, 百拇医药
in normal population in Shaanxi area
Amplification
fragment length(bp)
Chromosome
number
Allele
frequence
385
31
0.31
370
, 百拇医药
15
0.15
355
7
0.07
330
5
0.05
325
42
0.42
食管癌患者36 例癌组织DNA经PCR扩增后，获得与正常人相同的5个等位基因片段；26例癌旁组织DNA经PCR扩增后，同样也得到与正常人相同的5个等位基因片段，其各自的等位基因频率(Tab 2). 其中癌旁组织的等位基因杂合子的频率为22%. PIC值为0.70，而癌组织的PIC值为0.770，将正常人群与食管癌患者的 Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较. 经χ2检验，发现它们除了 370 bp 处差异无显著性外，其余4个等位基因片段处差异都呈显著性.将正常人群与食管癌癌旁组织Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较，经χ2检验，除355 bp处差异无显著性外，其余各片段差异呈显著性. 同样将食管癌与癌旁正常组织Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较，经χ2检验，5个等位基因片段处无显著差异. 等位基因片段可纯合存在，也可杂合存在. 将正常人群与食管癌癌旁组织等位基因杂合子频率进行比较，经χ2检验，P<0.01.
, 百拇医药
表 2 食管癌与癌旁组织Rb1.20位点VNTR多态分布
Tab 2 Polymorphism distribution of Rb1.20 VNTR in esophageal cancer
and pericancerous non-tumor tissue
Amplification
fragment
length(bp)
Chromosome number
Allele frequence
E
, 百拇医药
E+
E
E+
385
11
6
0.15
0.11
370
12
16
0.17
0.30
, 百拇医药 355
12
6
0.17
0.11
330
26
23
0.36
0.43
325
11
3
0.15
, 百拇医药
0.06
E=esophageal cancer tissue; E+=pericancerous non-tumor tissue.3 讨论
Rb基因是目前研究较为广泛的抗癌基因，具生长负调节作用，位于13q14，其作用的丧失与多种肿瘤的形成和发展密切相关[3]. 李华川等[4]首次在食管癌及癌旁组织中发现有34.9%和33.3%的Rb基因异常，又首次证明了环境化学致癌物质如亚硝胺能使Rb基因丢失，从而推测Rb基因异常在食管癌发生发展中可能起重要作用. VNTR是人类基因组内一种有高度多态性的遗传标记，可供信息量高，Yandell等[2]于Rb基因外显子20附近的内含子中发现一VNTR位点，将其命名为Rb1.20. 我们从食管癌遗传易感性可否由VNTR多态性而改变这一角度出发，来探索食管癌的发生发展机制.
Rb1.20位点的VNTR具10～24个等位片段，核心序列为〔CTTT(T)〕n，n=14～26[2]. 我们对陕西地区人群Rb1.20位点VNTR的多态性进行检测，共检出5个等位基因片段, 表明该位点呈高度多态. 后根据等位基因频率计算得出该多态位点的PIC值在0.70以上，表明该位点可提供信息量较高. 陕西地区人群Rb1.20位点VNTR多态性是否与食管癌遗传易感性有关，我们将正常人群与食管癌患者两者的Rb1.20位点VNTR多态性进行比较，发现正常人群与食管癌组织及癌旁组织在该位点VNTR多态性有显著差异，但将食管癌与癌旁组织两者在该位点VNTR多态性进行比较后，却发现两者在各等位片段处无显著性差异，这说明该位点VNTR多态性可能与食管癌的发展关系不太密切. 据此， 我们推测正常 人群与食管癌患者在Rb1.20位点VNTR多态性的改变可能造成食管癌患者易感. 另外，为进一步验证此观点，我们又将正常人群和食管癌癌旁组织两者的Rb1.20位点等位基因杂合子频率进行了比较，同样发现它们差异显著. 结果表明：陕西地区人群Rb1.20位点VNTR多态性的改变可能与食管癌遗传易感性有关.
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Rb基因除了Rb1.20位点含VNTR多态位点外，还在P68RS2.0位点及内含子16等处含多态位点[5,6]. 我们仅从Rb基因的一个VNTR多态位点探讨了其与食管癌遗传易感性的关系，为了将来更好地探讨Rb基因多态性与食管癌遗传易感性关系，以期从Rb基因多态性角度探讨食管癌的发生发展机制，Rb基因其他多态位点的研究工作还有待进一步研究.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600126)
作者简介：秦鸿雁(1971-)，女(汉族)，河南省武陟人. 硕士， 讲师，发表论文6篇. Tel.(029)3374490 Email. swxayz@fmmu.edu.cn
秦鸿雁(第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)
舒青(第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)
, 百拇医药
刘素英(第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)
马群风(第四军医大学唐都医院胸外科)
参考文献：
[1]Nakamura Y，Leppert M，O′Connell P et al. Variable number of tandem repeat(VNTR) markers for human gene mapping[J]. Science, 1987; 235(4796):1616-1622.
[2]Yandell DW，Oryja TP. Detection of dna sequence polymorphism by enzymatic ampliication and direct genomic sequencing[J]. Am J Hum Genet, 1989; 45(4):547-555.
, 百拇医药
[3]Weinberg RA. Oncogenes,antioncogenes and the molecular bases of multistep carciogenesis[J]. Cancer Res, 1989; 49(14):3713-3721.
[4]李华川，陆士新，姜 伟 et al. 食管癌组织中抗癌基因Rb的研究[J]. 中华肿瘤杂志，1990;12(3)：161-164.
[5]Wiggs J，Nordenskjold M，Yandell DW et al. Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma，using DNA polymorphims with the retinoblastoma gene[J]. New Engl J Med,1988；318(1):151-157.
[6]袁丽芳，高永庆，罗 双 et al. 应用Rb基因内多态位点作家系连锁分析预测视网膜母细胞瘤[J]. 中国医学科学院学报，1995;17(5)：338-341., 百拇医药
秦鸿雁 舒青 刘素英 马群风
摘 要：目的 探讨陕西人群Rb1.20位点VNTR多态性是否与食管癌遗传易感性有关. 方法 应用PCR方法对陕西正常个体外周血(50例)、食管癌组织(36例)、食管癌癌旁组织(27例)Rb基因20内含子VNTR区进行了检测. 结果 共检出5个等位基因片段：385 bp(A)，370 bp(B)，355 bp(C)，330 bp(D)和325 bp(E). 在正常人群中， 其等位基因频率分别为：A 0.31，B 0.15，C 0.07，D 0.05，E 0.42，杂合性为72%，PIC为0.70；在食管癌癌组织中，其等位基因频率分别为：A 0.15，B 0.17，C 0.17，D 0.36和E 0.15，PIC为0.77；在食管癌癌旁组织中，其等位基因频率分别为：A 0.11，B 0.30，C 0.11，D 0.43和E 0.06，杂合性为22%，PIC 为0.70. Rb1.20位点VNTR多态性在不同群体中有显著差异. 结论 推测 Rb1.20位点的VNTR多态性与食管癌遗传易感性有关.
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关键词:重复序列,核酸；聚合酶链反应；食管癌；易感性
0 引言
数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR ) 是人类基因组中近年来常用的一 种多态标记, 其应用十分广泛[1]. Rb1.20位点位于13q14，为Rb基因 20 内含子VNTR区，重复单位4 bp～5 bp，重复次数10～26次，是一理想的遗传标记[2]. 食管癌是我国常见的恶性肿瘤，具高发区和家族聚集现象，陕西也是该疾病的高发区之一. 有关食管癌的Rb基因研究报道已有不少，但有关Rb基因的VNTR多态性与食管癌的遗传易感性的研究目前尚未见报道. 为此，我们应用PCR-VNTR技术对陕西人群Rb1.20位点VNTR多态性进行检测并探讨了Rb1.20位点VNTR多态性与食管癌遗传易感性之间的关系.
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1 材料和方法
1.1 材料 陕西地区正常人群外周血样50例，由西京医院血库提供. 食管癌(鳞癌)组织 36 例及癌旁组织27例，取自唐都医院胸外科手术标本，经病理组织切片确诊.
1.2 方法 常规酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA和癌组织及癌旁组织DNA. PCR反应总体积为30 μL，含基因组DNA 0.5 μg，dNTP100 μmol.L-1，1×PCR缓冲液(10 mmol.L-1 Tris-HCl, 50 mmol.L-1 KCl，pH 9.0，1 g.L-1 Triton-100，1.5 mmol.L-1 MgCl2，0.1 g.L-1 gelatin)，引物浓度各为100 μmol.L-1. 引物序列为5′-AATTAACAAGGTGTGGTGGT-3′及5′-AAGTAAGAAAATCAAGCACTT-3′(美联公司合成). 经 97℃变性10 min后，在94℃加入Taq DNA聚合酶2.5 U(上海Promega公司)，加30 μL石蜡油覆盖，然后进入循环. Rb1.20扩增的反应条件为：94℃变性30 s，52℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个周期循环后，72℃延伸10 min(PCR仪为PE公司480型). 扩增产物以Marker(上海复华公司)为对照，80 g.L-1普通聚丙烯酰胺凝胶电泳后，溴化乙锭染色，观察结果.
, 百拇医药
2 结果
陕西地区正常人群外周血50 例遗传上无关个体基因组DNA经PCR扩增后，检测出385，370，355，330和325 bp 5个等位基因片段(Fig 1)，其频率分别为： 0.31， 0.15，0.07，0.05及0.42，杂合子频率为72%(Tab 1). 根据检测结果计算得其多态信息量(polymorphism information contents，PIC)为0.70.
图 1 Rb1.20位点VNTR等位基因片段(5个)
Fig 1 Five allele fragments of Rb1.20 locus VNTR
表 1 陕西地区正常人群Rb1.20位点VNTR的多态分布
Tab 1 Polymorphism distribution of Rb1.20 VNTR
, 百拇医药
in normal population in Shaanxi area
Amplification
fragment length(bp)
Chromosome
number
Allele
frequence
385
31
0.31
370
, 百拇医药
15
0.15
355
7
0.07
330
5
0.05
325
42
0.42
食管癌患者36 例癌组织DNA经PCR扩增后，获得与正常人相同的5个等位基因片段；26例癌旁组织DNA经PCR扩增后，同样也得到与正常人相同的5个等位基因片段，其各自的等位基因频率(Tab 2). 其中癌旁组织的等位基因杂合子的频率为22%. PIC值为0.70，而癌组织的PIC值为0.770，将正常人群与食管癌患者的 Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较. 经χ2检验，发现它们除了 370 bp 处差异无显著性外，其余4个等位基因片段处差异都呈显著性.将正常人群与食管癌癌旁组织Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较，经χ2检验，除355 bp处差异无显著性外，其余各片段差异呈显著性. 同样将食管癌与癌旁正常组织Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较，经χ2检验，5个等位基因片段处无显著差异. 等位基因片段可纯合存在，也可杂合存在. 将正常人群与食管癌癌旁组织等位基因杂合子频率进行比较，经χ2检验，P<0.01.
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表 2 食管癌与癌旁组织Rb1.20位点VNTR多态分布
Tab 2 Polymorphism distribution of Rb1.20 VNTR in esophageal cancer
and pericancerous non-tumor tissue
Amplification
fragment
length(bp)
Chromosome number
Allele frequence
E
, 百拇医药
E+
E
E+
385
11
6
0.15
0.11
370
12
16
0.17
0.30
, 百拇医药 355
12
6
0.17
0.11
330
26
23
0.36
0.43
325
11
3
0.15
, 百拇医药
0.06
E=esophageal cancer tissue; E+=pericancerous non-tumor tissue.3 讨论
Rb基因是目前研究较为广泛的抗癌基因，具生长负调节作用，位于13q14，其作用的丧失与多种肿瘤的形成和发展密切相关[3]. 李华川等[4]首次在食管癌及癌旁组织中发现有34.9%和33.3%的Rb基因异常，又首次证明了环境化学致癌物质如亚硝胺能使Rb基因丢失，从而推测Rb基因异常在食管癌发生发展中可能起重要作用. VNTR是人类基因组内一种有高度多态性的遗传标记，可供信息量高，Yandell等[2]于Rb基因外显子20附近的内含子中发现一VNTR位点，将其命名为Rb1.20. 我们从食管癌遗传易感性可否由VNTR多态性而改变这一角度出发，来探索食管癌的发生发展机制.
Rb1.20位点的VNTR具10～24个等位片段，核心序列为〔CTTT(T)〕n，n=14～26[2]. 我们对陕西地区人群Rb1.20位点VNTR的多态性进行检测，共检出5个等位基因片段, 表明该位点呈高度多态. 后根据等位基因频率计算得出该多态位点的PIC值在0.70以上，表明该位点可提供信息量较高. 陕西地区人群Rb1.20位点VNTR多态性是否与食管癌遗传易感性有关，我们将正常人群与食管癌患者两者的Rb1.20位点VNTR多态性进行比较，发现正常人群与食管癌组织及癌旁组织在该位点VNTR多态性有显著差异，但将食管癌与癌旁组织两者在该位点VNTR多态性进行比较后，却发现两者在各等位片段处无显著性差异，这说明该位点VNTR多态性可能与食管癌的发展关系不太密切. 据此， 我们推测正常 人群与食管癌患者在Rb1.20位点VNTR多态性的改变可能造成食管癌患者易感. 另外，为进一步验证此观点，我们又将正常人群和食管癌癌旁组织两者的Rb1.20位点等位基因杂合子频率进行了比较，同样发现它们差异显著. 结果表明：陕西地区人群Rb1.20位点VNTR多态性的改变可能与食管癌遗传易感性有关.
, http://www.100md.com
Rb基因除了Rb1.20位点含VNTR多态位点外，还在P68RS2.0位点及内含子16等处含多态位点[5,6]. 我们仅从Rb基因的一个VNTR多态位点探讨了其与食管癌遗传易感性的关系，为了将来更好地探讨Rb基因多态性与食管癌遗传易感性关系，以期从Rb基因多态性角度探讨食管癌的发生发展机制，Rb基因其他多态位点的研究工作还有待进一步研究.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600126)
作者简介：秦鸿雁(1971-)，女(汉族)，河南省武陟人. 硕士， 讲师，发表论文6篇. Tel.(029)3374490 Email. swxayz@fmmu.edu.cn
秦鸿雁(第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)
舒青(第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)
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刘素英(第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)
马群风(第四军医大学唐都医院胸外科)
参考文献：
[1]Nakamura Y，Leppert M，O′Connell P et al. Variable number of tandem repeat(VNTR) markers for human gene mapping[J]. Science, 1987; 235(4796):1616-1622.
[2]Yandell DW，Oryja TP. Detection of dna sequence polymorphism by enzymatic ampliication and direct genomic sequencing[J]. Am J Hum Genet, 1989; 45(4):547-555.
, 百拇医药
[3]Weinberg RA. Oncogenes,antioncogenes and the molecular bases of multistep carciogenesis[J]. Cancer Res, 1989; 49(14):3713-3721.
[4]李华川，陆士新，姜 伟 et al. 食管癌组织中抗癌基因Rb的研究[J]. 中华肿瘤杂志，1990;12(3)：161-164.
[5]Wiggs J，Nordenskjold M，Yandell DW et al. Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma，using DNA polymorphims with the retinoblastoma gene[J]. New Engl J Med,1988；318(1):151-157.
[6]袁丽芳，高永庆，罗 双 et al. 应用Rb基因内多态位点作家系连锁分析预测视网膜母细胞瘤[J]. 中国医学科学院学报，1995;17(5)：338-341., 百拇医药