不同种质板蓝根和大青叶的抗甲型流感病毒作用
不同种质板蓝根和大青叶的抗甲型流感病毒作用
刘盛 陈万生 乔传卓 郑水庆 曾明 张汉明 宋赵军
摘 要 目的：研究板蓝根和大青叶抗甲型流感病毒作用。方法：选用鸡胚法分别考察各15个种质的板蓝根和大青叶对甲型流感病毒(A1京防86-1)的抑制作用。结果：血凝滴度实验表明，在对甲型流感病毒的直接作用、治疗作用和预防作用3方面大多数板蓝根和大青叶有效，但各种质药材样品抗病毒活性的有无及强度有明显差异。结论：在保证药材来源可靠的前提下，证明了板蓝根和大青叶确具抗病毒作用，并为药材种质的优选提供了一定的依据。
关键词：板蓝根；大青叶；甲型流感病毒；种质
板蓝根(Radix Isatidis)和大青叶(Folium Isatidis)主要来源于十字花科的菘蓝(Isatis indigotica Fort.)，均为清热解毒的常用中药。目前在临床上它们主要用于防治流行性感冒、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎等病毒性感染引起的疾病。但是，近年来时有文献报道说其质量不稳定，疗效不确切[1～4]。为了较全面地揭示个中原因，我们对板蓝根和大青叶的道地性进行了系统的研究。在抗病毒作用考察方面，选择了较为常见的甲型流感病毒，采用鸡胚法，用血凝实验来进行检测。其目的，一是在保证药材来源正确可靠的前提下，澄清板蓝根和大青叶对流感病毒是否有效；二是观察不同种质的药材样品间可能存在的活性上的差异，从而优选出质量可靠的药材。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药材样品 从全国采集不同种质的板蓝根种子共15份，同时栽种于上海崇明岛同一田地，同时收获板蓝根和大青叶药材样品各15份[5](考虑到本研究课题优选出种质后可能具有的后期开发效应，在此特将抗病毒实验样品种质来源以数码符号表示)。药材样品经第二军医大学药学院生药学教研室乔传卓教授鉴定为菘蓝Isatis indigotica Fort.。
1.2 病毒毒株 甲型流感病毒(A1京防86-1 EC 4/2/70)，江苏省防疫站提供。
1.3 方法
1.3.1 板蓝根和大青叶注射液的配制 依次取750 ml蒸馏水，加热至沸，投入50 g板蓝根饮片(大青叶100 g),煎煮20 min，用纱布过滤。滤渣加500 ml蒸馏水，煎煮1 h，过滤。合并滤液，水浴上浓缩至约100 ml，加乙醇，使乙醇浓度为80%，冷藏24 h后用滤纸过滤。滤液蒸除乙醇至无醇味，加蒸馏水溶解，调节pH至 7.0～7.5，加入表面活性剂Tween-80 1 ml，定容至100 ml。压滤除菌，用2 ml安瓿分装，封口，高压煮沸消毒，备用。
, 百拇医药
1.3.2 抗病毒实验[6] 将鸡胚在实验室39℃下孵育至12 d胚龄，备用。共进行以下3项实验：(1)药物的直接灭活作用：将药材样品与病毒等量混合，37℃作用2 h，接种量为0.2 ml/胚。(2)药物的治疗作用：先将病毒以0.1 ml/胚接种至鸡胚内，4 h后再以0.1 ml/胚接种样品注射液。(3)药物的预防作用：每个鸡胚先接种0.1 ml样品注射液，1 d后再接种0.1 ml的病毒。每组实验均接种3个鸡胚，35℃孵育3 d，4℃过夜后收获尿囊液，进行血凝实验。在大孔塑料板内用生理盐水将尿囊液先按1∶10稀释，再进行倍比稀释1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，共得7个浓度梯度。每孔加入1%的鸡红细胞悬液，摇匀，静置45 min后观察。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以“++”为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度[6]。以上实验均设生理盐水对照(排除血细胞自身的非特异性凝集)和病毒对照。判断结果时如果药物实验组血凝滴度为病毒对照组的1/4以下，即说明药物对病毒增殖有抑制作用。
, 百拇医药
2 结 果
实验中测得病毒对照组的血凝滴度为1∶320，生理盐水对照组为“0”，所以，若实验组血凝滴度低于1∶80，则说明有效。由表1可见，在15个种质的板蓝根中，在对流感病毒的直接作用、治疗作用和预防作用上的有效率分别为100%(15/15)，60%(9/15)，67%(10/15)；其中3，7，8，13和15号5个种质的板蓝根在3种作用上对流感病毒均有效。由表2可见，大青叶对流感病毒直接作用、治疗作用和预防作用的有效率分别为87%(13/15)，87% (13/15)，40%(6/15)，其中3，4，5，8，10和11号6个种质的大青叶在3种作用上对流感病毒均有效。
3 讨 论
常用的中药抗病毒作用研究方法大致分为组织培养法、鸡胚法和整体动物保护实验三类。鸡胚法比动物实验更不易受外界因素的影响，比组织培养更接近机体，适宜于对能在鸡胚内增殖的病毒(如甲型流感病毒)进行抗病毒药效测定。
, 百拇医药
表1 不同种质的板蓝根药材抗流感病毒作用
Tab 1 The antiviral action against influenza A virus of
Radix Isatidis from different germplasm(n=3)
Sample
No.
Mean hemagglutination titer of allantoic liquid
Direct
action
Therapeutic
, 百拇医药
action
Preventive
action
Control of virus
1∶320
1∶320
1∶320
Control of NS
0
0
0
1
, 百拇医药 1∶ 20
1∶ 20
1∶320
2
1∶ 60
1∶ 50
1∶150
3
1∶ 40
1∶ 50
1∶ 40
4
1∶ 20
, 百拇医药
1∶ 90
1∶ 80
5
1∶ 80
1∶ 80
1∶ 90
6
1∶ 40
1∶ 90
1∶ 40
7
1∶ 50
1∶ 80
, http://www.100md.com
1∶ 50
8
1∶ 50
1∶ 80
1∶ 50
9
1∶ 30
1∶130
1∶ 50
10
1∶ 50
1∶240
1∶ 90
, 百拇医药
11
1∶ 20
1∶270
1∶ 50
12
1∶ 60
1∶180
1∶ 80
13
1∶ 45
1∶ 80
1∶ 80
14
, http://www.100md.com
1∶ 50
1∶ 80
1∶270
15
1∶ 50
1∶ 60
1∶ 50
表2 不同种质的大青叶药材抗流感病毒作用
Tab 2 The antiviral action to influenza A virus
of Folium Isatidis from different germplasm(n=3)
, 百拇医药
Sample
No.
Mean hemagglutination titer of allantoic liquid
Direct
action
Therapeutic
action
Preventive
action
Control of virus
1∶320
, http://www.100md.com
1∶320
1∶320
Control of NS
0
0
0
1
1∶ 20
1∶ 60
1∶110
2
1∶ 30
1∶ 90
, 百拇医药
1∶110
3
1∶ 20
1∶ 40
1∶ 50
4
1∶ 10
1∶ 40
1∶ 60
5
1∶ 15
1∶ 40
1∶ 40
, 百拇医药
6
1∶ 10
1∶ 30
1∶ 90
7
1∶ 20
1∶ 40
1∶ 90
8
1∶ 20
1∶ 40
1∶ 60
9
, 百拇医药
1∶ 15
1∶ 50
1∶ 90
10
1∶ 10
1∶ 50
1∶ 60
11
1∶ 25
1∶ 50
1∶ 60
12
1∶110
, 百拇医药
1∶ 90
1∶920
13
1∶ 35
1∶ 40
1∶210
14
1∶100
1∶ 30
1∶200
15
1∶ 50
1∶ 60
, http://www.100md.com
1∶400
大多数研究认为板蓝根和大青叶具有有效拮抗流感病毒的作用[7]，但也有人经实验证实为无效[8]。究其原因，从生药学的观点来看，药材来源及质量的可靠与否往往直接影响到药理实验的结果。本实验中，我们将15个不同种质板蓝根种子在相同的环境中栽培，尽可能多地排除影响药材品质的因素，使得结果较为可靠。本实验证实了以下两点：一是大多数板蓝根和大青叶样品对甲型流感病毒A1京防86-1株有明显的拮抗作用，无论是同病毒直接作用，还是治疗和预防作用均为有效，仅程度有所不同而已，直接作用普遍稍强于治疗和预防作用；二是不同种质的药材抗病毒活性的有无及强度存在差异，而且差异在几倍到十几倍之间，如此悬殊的差异无疑是造成药材品质不稳定、疗效不确切的重要原因。
中药现代化的根本出路在于中药材生产的规范化和标准化，而规范化生产的首要条件是中药材品种的规范化，一个稳定、各项药理指标及活性成分指标符合要求的品种是规范化生产的基础。只有品种的规范化，栽培措施、采收加工、贮藏、制剂等的规范化才有意义。本实验对不同种质菘蓝进行抗流感病毒活性的药效筛选，发现它们在抗病毒活性上存在明显差异，从中可以优化出抗病毒活性较强的种质，这些种质对进一步品种选育提供了良好的素材。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670878)
作者简介：刘盛(1971-)，男(汉族)，硕士，药师
刘盛(兰州军区总医院药剂科，兰州 730050)
陈万生(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
乔传卓(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
郑水庆(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
曾明(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
张汉明(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
, 百拇医药
宋赵军(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
参考文献
[1] 朱煜根，朱晓燕. 板蓝根冲剂的质量控制指标的商讨[J]. 中成药,1990,12(4):10-11.
[2] 叶爱莲，郑海岚，李水福. 板蓝根冲剂的质量及其标准亟待重视[J]. 中国中药杂志, 1995, 20(9):571-573.
[3] 许桢灿，林绍乐. 中药板蓝根抑菌作用的评价[J]. 中成药研究, 1987, (12):9-11.
[4] 刘云海，刘彦斌. 不同地产板蓝根抗内毒素作用比较[J]. 中国中药杂志, 1994, 19(2):88-89.
[5] 郑水庆，陈万生，曾 明，等. 二倍体的不同品系与四倍体板蓝根中多糖的含量测定[J]. 第二军医大学学报, 1999, 20(10):755-757.
[6] 中华人民共和国国家标准(GB 15994-1995)[M]. 北京：国家技术监督局、中华人民共和国卫生部,1996.
[7] 吴葆杰，主编. 中草药药理学[M]. 北京：人民卫生出版社，1983.253-256.
[8] 楼之岑，秦 波，主编. 常用中药材品种整理和质量研究(北方编 第1册)[M]. 北京：北京医科大学*协和医科大学联合出版社,1995.303-342., 百拇医药
刘盛 陈万生 乔传卓 郑水庆 曾明 张汉明 宋赵军
摘 要 目的：研究板蓝根和大青叶抗甲型流感病毒作用。方法：选用鸡胚法分别考察各15个种质的板蓝根和大青叶对甲型流感病毒(A1京防86-1)的抑制作用。结果：血凝滴度实验表明，在对甲型流感病毒的直接作用、治疗作用和预防作用3方面大多数板蓝根和大青叶有效，但各种质药材样品抗病毒活性的有无及强度有明显差异。结论：在保证药材来源可靠的前提下，证明了板蓝根和大青叶确具抗病毒作用，并为药材种质的优选提供了一定的依据。
关键词：板蓝根；大青叶；甲型流感病毒；种质
板蓝根(Radix Isatidis)和大青叶(Folium Isatidis)主要来源于十字花科的菘蓝(Isatis indigotica Fort.)，均为清热解毒的常用中药。目前在临床上它们主要用于防治流行性感冒、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎等病毒性感染引起的疾病。但是，近年来时有文献报道说其质量不稳定，疗效不确切[1～4]。为了较全面地揭示个中原因，我们对板蓝根和大青叶的道地性进行了系统的研究。在抗病毒作用考察方面，选择了较为常见的甲型流感病毒，采用鸡胚法，用血凝实验来进行检测。其目的，一是在保证药材来源正确可靠的前提下，澄清板蓝根和大青叶对流感病毒是否有效；二是观察不同种质的药材样品间可能存在的活性上的差异，从而优选出质量可靠的药材。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药材样品 从全国采集不同种质的板蓝根种子共15份，同时栽种于上海崇明岛同一田地，同时收获板蓝根和大青叶药材样品各15份[5](考虑到本研究课题优选出种质后可能具有的后期开发效应，在此特将抗病毒实验样品种质来源以数码符号表示)。药材样品经第二军医大学药学院生药学教研室乔传卓教授鉴定为菘蓝Isatis indigotica Fort.。
1.2 病毒毒株 甲型流感病毒(A1京防86-1 EC 4/2/70)，江苏省防疫站提供。
1.3 方法
1.3.1 板蓝根和大青叶注射液的配制 依次取750 ml蒸馏水，加热至沸，投入50 g板蓝根饮片(大青叶100 g),煎煮20 min，用纱布过滤。滤渣加500 ml蒸馏水，煎煮1 h，过滤。合并滤液，水浴上浓缩至约100 ml，加乙醇，使乙醇浓度为80%，冷藏24 h后用滤纸过滤。滤液蒸除乙醇至无醇味，加蒸馏水溶解，调节pH至 7.0～7.5，加入表面活性剂Tween-80 1 ml，定容至100 ml。压滤除菌，用2 ml安瓿分装，封口，高压煮沸消毒，备用。
, 百拇医药
1.3.2 抗病毒实验[6] 将鸡胚在实验室39℃下孵育至12 d胚龄，备用。共进行以下3项实验：(1)药物的直接灭活作用：将药材样品与病毒等量混合，37℃作用2 h，接种量为0.2 ml/胚。(2)药物的治疗作用：先将病毒以0.1 ml/胚接种至鸡胚内，4 h后再以0.1 ml/胚接种样品注射液。(3)药物的预防作用：每个鸡胚先接种0.1 ml样品注射液，1 d后再接种0.1 ml的病毒。每组实验均接种3个鸡胚，35℃孵育3 d，4℃过夜后收获尿囊液，进行血凝实验。在大孔塑料板内用生理盐水将尿囊液先按1∶10稀释，再进行倍比稀释1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，共得7个浓度梯度。每孔加入1%的鸡红细胞悬液，摇匀，静置45 min后观察。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以“++”为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度[6]。以上实验均设生理盐水对照(排除血细胞自身的非特异性凝集)和病毒对照。判断结果时如果药物实验组血凝滴度为病毒对照组的1/4以下，即说明药物对病毒增殖有抑制作用。
, 百拇医药
2 结 果
实验中测得病毒对照组的血凝滴度为1∶320，生理盐水对照组为“0”，所以，若实验组血凝滴度低于1∶80，则说明有效。由表1可见，在15个种质的板蓝根中，在对流感病毒的直接作用、治疗作用和预防作用上的有效率分别为100%(15/15)，60%(9/15)，67%(10/15)；其中3，7，8，13和15号5个种质的板蓝根在3种作用上对流感病毒均有效。由表2可见，大青叶对流感病毒直接作用、治疗作用和预防作用的有效率分别为87%(13/15)，87% (13/15)，40%(6/15)，其中3，4，5，8，10和11号6个种质的大青叶在3种作用上对流感病毒均有效。
3 讨 论
常用的中药抗病毒作用研究方法大致分为组织培养法、鸡胚法和整体动物保护实验三类。鸡胚法比动物实验更不易受外界因素的影响，比组织培养更接近机体，适宜于对能在鸡胚内增殖的病毒(如甲型流感病毒)进行抗病毒药效测定。
, 百拇医药
表1 不同种质的板蓝根药材抗流感病毒作用
Tab 1 The antiviral action against influenza A virus of
Radix Isatidis from different germplasm(n=3)
Sample
No.
Mean hemagglutination titer of allantoic liquid
Direct
action
Therapeutic
, 百拇医药
action
Preventive
action
Control of virus
1∶320
1∶320
1∶320
Control of NS
0
0
0
1
, 百拇医药 1∶ 20
1∶ 20
1∶320
2
1∶ 60
1∶ 50
1∶150
3
1∶ 40
1∶ 50
1∶ 40
4
1∶ 20
, 百拇医药
1∶ 90
1∶ 80
5
1∶ 80
1∶ 80
1∶ 90
6
1∶ 40
1∶ 90
1∶ 40
7
1∶ 50
1∶ 80
, http://www.100md.com
1∶ 50
8
1∶ 50
1∶ 80
1∶ 50
9
1∶ 30
1∶130
1∶ 50
10
1∶ 50
1∶240
1∶ 90
, 百拇医药
11
1∶ 20
1∶270
1∶ 50
12
1∶ 60
1∶180
1∶ 80
13
1∶ 45
1∶ 80
1∶ 80
14
, http://www.100md.com
1∶ 50
1∶ 80
1∶270
15
1∶ 50
1∶ 60
1∶ 50
表2 不同种质的大青叶药材抗流感病毒作用
Tab 2 The antiviral action to influenza A virus
of Folium Isatidis from different germplasm(n=3)
, 百拇医药
Sample
No.
Mean hemagglutination titer of allantoic liquid
Direct
action
Therapeutic
action
Preventive
action
Control of virus
1∶320
, http://www.100md.com
1∶320
1∶320
Control of NS
0
0
0
1
1∶ 20
1∶ 60
1∶110
2
1∶ 30
1∶ 90
, 百拇医药
1∶110
3
1∶ 20
1∶ 40
1∶ 50
4
1∶ 10
1∶ 40
1∶ 60
5
1∶ 15
1∶ 40
1∶ 40
, 百拇医药
6
1∶ 10
1∶ 30
1∶ 90
7
1∶ 20
1∶ 40
1∶ 90
8
1∶ 20
1∶ 40
1∶ 60
9
, 百拇医药
1∶ 15
1∶ 50
1∶ 90
10
1∶ 10
1∶ 50
1∶ 60
11
1∶ 25
1∶ 50
1∶ 60
12
1∶110
, 百拇医药
1∶ 90
1∶920
13
1∶ 35
1∶ 40
1∶210
14
1∶100
1∶ 30
1∶200
15
1∶ 50
1∶ 60
, http://www.100md.com
1∶400
大多数研究认为板蓝根和大青叶具有有效拮抗流感病毒的作用[7]，但也有人经实验证实为无效[8]。究其原因，从生药学的观点来看，药材来源及质量的可靠与否往往直接影响到药理实验的结果。本实验中，我们将15个不同种质板蓝根种子在相同的环境中栽培，尽可能多地排除影响药材品质的因素，使得结果较为可靠。本实验证实了以下两点：一是大多数板蓝根和大青叶样品对甲型流感病毒A1京防86-1株有明显的拮抗作用，无论是同病毒直接作用，还是治疗和预防作用均为有效，仅程度有所不同而已，直接作用普遍稍强于治疗和预防作用；二是不同种质的药材抗病毒活性的有无及强度存在差异，而且差异在几倍到十几倍之间，如此悬殊的差异无疑是造成药材品质不稳定、疗效不确切的重要原因。
中药现代化的根本出路在于中药材生产的规范化和标准化，而规范化生产的首要条件是中药材品种的规范化，一个稳定、各项药理指标及活性成分指标符合要求的品种是规范化生产的基础。只有品种的规范化，栽培措施、采收加工、贮藏、制剂等的规范化才有意义。本实验对不同种质菘蓝进行抗流感病毒活性的药效筛选，发现它们在抗病毒活性上存在明显差异，从中可以优化出抗病毒活性较强的种质，这些种质对进一步品种选育提供了良好的素材。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670878)
作者简介：刘盛(1971-)，男(汉族)，硕士，药师
刘盛(兰州军区总医院药剂科，兰州 730050)
陈万生(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
乔传卓(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
郑水庆(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
曾明(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
张汉明(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
, 百拇医药
宋赵军(第二军医大学花学院生药学教研室，上海200433)
参考文献
[1] 朱煜根，朱晓燕. 板蓝根冲剂的质量控制指标的商讨[J]. 中成药,1990,12(4):10-11.
[2] 叶爱莲，郑海岚，李水福. 板蓝根冲剂的质量及其标准亟待重视[J]. 中国中药杂志, 1995, 20(9):571-573.
[3] 许桢灿，林绍乐. 中药板蓝根抑菌作用的评价[J]. 中成药研究, 1987, (12):9-11.
[4] 刘云海，刘彦斌. 不同地产板蓝根抗内毒素作用比较[J]. 中国中药杂志, 1994, 19(2):88-89.
[5] 郑水庆，陈万生，曾 明，等. 二倍体的不同品系与四倍体板蓝根中多糖的含量测定[J]. 第二军医大学学报, 1999, 20(10):755-757.
[6] 中华人民共和国国家标准(GB 15994-1995)[M]. 北京：国家技术监督局、中华人民共和国卫生部,1996.
[7] 吴葆杰，主编. 中草药药理学[M]. 北京：人民卫生出版社，1983.253-256.
[8] 楼之岑，秦 波，主编. 常用中药材品种整理和质量研究(北方编 第1册)[M]. 北京：北京医科大学*协和医科大学联合出版社,1995.303-342., 百拇医药