人hTRT正反义真核表达载体的构建及初步鉴定
作者:杨仕明 房殿春 杨金亮 罗元辉 鲁荣 刘为纹 梁光萍
单位:第三军医大学附属西南医院消化内科,重庆 400038
关键词:端粒酶;人端粒酶蛋白催化亚单位
第三军医大学学报001130
提 要:目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位(hTRT)正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将hTRT cDNA正向及反向克隆到真核表达载体pcl-neo中。结果 Not Ⅰ 酶切后,正义重组基因为8.8 kb一条带,反义重组基因为3.4 kb和5.4 kb二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了hTRT正反义真核表达载体。
中图法分类号:R394-33 文献标识码:B
文章编号:1000-5404(2000)11-1113-02
, 百拇医药
Construction and preliminary identification of hTRT sense and antisense eukaryotic expression vector
为探讨人端粒酶蛋白催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase,hTRT)在肿瘤基因治疗中的应用前景及正常细胞发育中的作用,我们构建了hTRT正反义真核表达载体,为进一步研究hTRT基因在延缓细胞衰老及肿瘤基因治疗中的作用创造条件。
1 材料和方法
1.1 材料1.1.1 菌种及质粒E.coli JM109由本室保存;pcl-neo真核表达载体购自Promega公司;pGRN-145质粒由美国Geron公司Okarma博士惠赠,全长14 kb,载有3.45 kb的hTRT cDNA。
, 百拇医药
1.1.2 工具酶及试剂EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶、无DNase的RNase、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)和T4 DNA连接酶购自Promega公司。
1.2 hTRT真核表达载体的构建
1.2.1质粒的提取和纯化 采用Boehringer Mannheim公司的试剂试剂盒,按说明书进行。
1.2.2 hTRT cDNA的制备 hTRT cDNA全长3.45 kb,位于pGRN-145质粒的EcoRⅠ酶切位点之间,用EcoRⅠ酶切该质粒,0.8%琼脂糖电泳,用琼脂糖DNA提取试剂盒(Boehringer Mannheim公司)回收DNA片段,去离子水溶解沉淀,-20 ℃冻存备用。
1.2.3 pcl-neo载体的酶切及5'端去磷酸化 用EcoRⅠ 酶切pcl-neo使其线性化,试剂盒回收片段,牛小肠碱性磷酸酶(CIP)对线性载体5'端去磷酸化:线性pcl-neo 17 μl,10×CIP缓冲液2 μl,CIP 1 μl,于37 ℃反应30 min,75 ℃ 15 min,0.8%琼脂糖电泳鉴定,试剂盒回收片段,去离子水溶解,-20 ℃保存备用。
, http://www.100md.com
1.2.4 连接反应 取4 μl去磷酸化的pcl-neo/EcoRⅠ片段与4 μl hTRT cDNA片段混合均匀,45 ℃反应5 min,迅速转至冰上,加T4 DNA连接酶1 μl,缓冲液1 μl混匀,16 ℃水浴过夜。
1.2.5 质粒转化和克隆挑选 用氯化钙法制备JM109感受态,并按常规方法将连接产物转化感受态,将200 μl转化后的菌液涂于含氨苄青霉素的LB培养板上,37 ℃过夜。挑取单个菌落置于含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振摇过夜,质粒提取试剂盒提取质粒,根据重组质粒图谱,用NotⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定。
2 结果
2.1 pGRN-145质粒的酶切及鉴定
hTRT cDNA全长3.45 kb,两端为EcoRⅠ酶切位点。用EcoRⅠ酶切质粒,经0.8%琼脂糖电泳后,所得到的酶切片段与预期长度相符。
, http://www.100md.com
2.2 pcl-neo线性载体的制备
pcl-neo载体以EcoRⅠ酶切后,成为5.4 kb的线性条带,酶切完全,大小正确。
2.3 pcl-hTRT正义及反义重组质粒的鉴定
在氨苄青霉素LB平板上挑选3个菌落,大量扩增后纯化质粒,经NotⅠ酶切后,正义重组质粒8.8 kb的片段,反义重组质粒为3.4 kb、5.4 kb两个片段,与理论计算长度相符,说明成功构建pcl-hTRT正反义重组质粒,见图1。
图1 重组正反义质粒NotⅠ酶切图谱
1:Marker(λDNA/HindⅢ),2、4:hTRT正义重组质粒,3:hTRT 反义重组质粒
3 讨论
, 百拇医药
端粒酶具有双重作用。端粒酶的过量表达是肿瘤细胞无限增殖的必要条件,另一方面端粒酶的适量表达可以减缓染色体端粒丢失速度,从而延长细胞的寿命[1~3]。由于hTRT基因是端粒酶组份中真正具有调控端粒酶活性的亚单位,为此,我们成功构建了hTRT正、反义真核表达载体,一方面为肿瘤细胞的hTRT反义基因治疗创造条件,另一方面亦可以将hTRT正义真核表达载体导入正常体细胞中,从而为建立来源于正常体细胞的永生化细胞株奠定基础。
基金项目:国家自然科学基金资助(39770302,30000072)
作者简介:杨仕明(1969-),男,湖南省双峰市人,主要从事肿瘤端粒酶方面的研究,发表论文22篇。
参考文献:
[1]Meyerson M,Counter C M,Eaton E N,et al.hEST2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is upregulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell,1997,90(4):785-795.
, http://www.100md.com
[2]Nakamura T M,Morin G B,Chapman K B,et al.Elomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human[J].Science,1997,277(5 328):955-959.
[3]Morales C P,Holt S E,Ouellette M,et al.Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase[J].Nat Genet,1999,21(1):115-118.
收稿日期:1999-11-03
修回日期:2000-08-30, http://www.100md.com
单位:第三军医大学附属西南医院消化内科,重庆 400038
关键词:端粒酶;人端粒酶蛋白催化亚单位
第三军医大学学报001130
提 要:目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位(hTRT)正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将hTRT cDNA正向及反向克隆到真核表达载体pcl-neo中。结果 Not Ⅰ 酶切后,正义重组基因为8.8 kb一条带,反义重组基因为3.4 kb和5.4 kb二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了hTRT正反义真核表达载体。
中图法分类号:R394-33 文献标识码:B
文章编号:1000-5404(2000)11-1113-02
, 百拇医药
Construction and preliminary identification of hTRT sense and antisense eukaryotic expression vector
为探讨人端粒酶蛋白催化亚单位(Human telomerase reverse transcriptase,hTRT)在肿瘤基因治疗中的应用前景及正常细胞发育中的作用,我们构建了hTRT正反义真核表达载体,为进一步研究hTRT基因在延缓细胞衰老及肿瘤基因治疗中的作用创造条件。
1 材料和方法
1.1 材料1.1.1 菌种及质粒E.coli JM109由本室保存;pcl-neo真核表达载体购自Promega公司;pGRN-145质粒由美国Geron公司Okarma博士惠赠,全长14 kb,载有3.45 kb的hTRT cDNA。
, 百拇医药
1.1.2 工具酶及试剂EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶、无DNase的RNase、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)和T4 DNA连接酶购自Promega公司。
1.2 hTRT真核表达载体的构建
1.2.1质粒的提取和纯化 采用Boehringer Mannheim公司的试剂试剂盒,按说明书进行。
1.2.2 hTRT cDNA的制备 hTRT cDNA全长3.45 kb,位于pGRN-145质粒的EcoRⅠ酶切位点之间,用EcoRⅠ酶切该质粒,0.8%琼脂糖电泳,用琼脂糖DNA提取试剂盒(Boehringer Mannheim公司)回收DNA片段,去离子水溶解沉淀,-20 ℃冻存备用。
1.2.3 pcl-neo载体的酶切及5'端去磷酸化 用EcoRⅠ 酶切pcl-neo使其线性化,试剂盒回收片段,牛小肠碱性磷酸酶(CIP)对线性载体5'端去磷酸化:线性pcl-neo 17 μl,10×CIP缓冲液2 μl,CIP 1 μl,于37 ℃反应30 min,75 ℃ 15 min,0.8%琼脂糖电泳鉴定,试剂盒回收片段,去离子水溶解,-20 ℃保存备用。
, http://www.100md.com
1.2.4 连接反应 取4 μl去磷酸化的pcl-neo/EcoRⅠ片段与4 μl hTRT cDNA片段混合均匀,45 ℃反应5 min,迅速转至冰上,加T4 DNA连接酶1 μl,缓冲液1 μl混匀,16 ℃水浴过夜。
1.2.5 质粒转化和克隆挑选 用氯化钙法制备JM109感受态,并按常规方法将连接产物转化感受态,将200 μl转化后的菌液涂于含氨苄青霉素的LB培养板上,37 ℃过夜。挑取单个菌落置于含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振摇过夜,质粒提取试剂盒提取质粒,根据重组质粒图谱,用NotⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定。
2 结果
2.1 pGRN-145质粒的酶切及鉴定
hTRT cDNA全长3.45 kb,两端为EcoRⅠ酶切位点。用EcoRⅠ酶切质粒,经0.8%琼脂糖电泳后,所得到的酶切片段与预期长度相符。
, http://www.100md.com
2.2 pcl-neo线性载体的制备
pcl-neo载体以EcoRⅠ酶切后,成为5.4 kb的线性条带,酶切完全,大小正确。
2.3 pcl-hTRT正义及反义重组质粒的鉴定
在氨苄青霉素LB平板上挑选3个菌落,大量扩增后纯化质粒,经NotⅠ酶切后,正义重组质粒8.8 kb的片段,反义重组质粒为3.4 kb、5.4 kb两个片段,与理论计算长度相符,说明成功构建pcl-hTRT正反义重组质粒,见图1。
图1 重组正反义质粒NotⅠ酶切图谱
1:Marker(λDNA/HindⅢ),2、4:hTRT正义重组质粒,3:hTRT 反义重组质粒
3 讨论
, 百拇医药
端粒酶具有双重作用。端粒酶的过量表达是肿瘤细胞无限增殖的必要条件,另一方面端粒酶的适量表达可以减缓染色体端粒丢失速度,从而延长细胞的寿命[1~3]。由于hTRT基因是端粒酶组份中真正具有调控端粒酶活性的亚单位,为此,我们成功构建了hTRT正、反义真核表达载体,一方面为肿瘤细胞的hTRT反义基因治疗创造条件,另一方面亦可以将hTRT正义真核表达载体导入正常体细胞中,从而为建立来源于正常体细胞的永生化细胞株奠定基础。
基金项目:国家自然科学基金资助(39770302,30000072)
作者简介:杨仕明(1969-),男,湖南省双峰市人,主要从事肿瘤端粒酶方面的研究,发表论文22篇。
参考文献:
[1]Meyerson M,Counter C M,Eaton E N,et al.hEST2,the putative human telomerase catalytic subunit gene,is upregulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell,1997,90(4):785-795.
, http://www.100md.com
[2]Nakamura T M,Morin G B,Chapman K B,et al.Elomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human[J].Science,1997,277(5 328):955-959.
[3]Morales C P,Holt S E,Ouellette M,et al.Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase[J].Nat Genet,1999,21(1):115-118.
收稿日期:1999-11-03
修回日期:2000-08-30, http://www.100md.com