兔半月板纤维软骨细胞的培养及生物学特性研究
潘险峰 林月秋 汤逊 周中英 赵稳兴
摘 要 目的：通过半月板纤维软骨细胞的分离、培养、鉴定，观察其生长特点，研究半月板生物学特性及其损伤修复的细胞学基础。方法：机械分离兔半月板软骨，胰蛋白酶、胶原酶联合消化，10%FBS的DMEM中原代和传代培养，倒置显微镜动态观察细胞形态及生长情况，GAG、Ⅱ型胶原免疫组化染色，电镜观察细胞超微结构。结果：培养细胞呈多角形，有突起，富含分泌颗粒，GAG、Ⅱ型胶原染色阳性，细胞线粒体和内质网发达。结论：培养的细胞保持了体内纤维软骨细胞的基本特性。
关键词：半月板；纤维软骨；细胞；培养的
半月板位于胫股关节之间，在分散应力、缓冲震荡、稳定关节和调节滑液等方面起重要作用。由于解剖结构和本身营养血供匮乏的特点，半月板游离缘损伤后很难自行愈合。如何最大限度保留半月板，以及如何加速半月板损伤后的原位修复，逐渐成为国内外研究的热点[1，2]。由于半月板主要成分为纤维软骨，其生物学特性有别于一般关节软骨(透明软骨)，对半月板纤维软骨细胞(fibrochondrocytes)的体外分离、培养，以及生物学特性的研究，已成为研究半月板损伤后的修复、纤维软骨组织工程和基因治疗的一种重要手段。目前对于半月板细胞的体外培养，国内还未见报道。我们通过兔半月板纤维软骨细胞的培养，观察细胞形态、超微结构，绘制生长曲线，并进行组化和免疫组化鉴定，为下一步的深入研究，奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1材料
DMEM培养液(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Sigma)公司，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)，D-Hank′s液，Ⅱ型胶原抗体及免疫组化试剂盒(晶美公司)，CO2培养箱(Hereaus)，超净工作台(国产)，倒置显微镜(Olympus)，电镜(日立Hitachi, H600)。
1.2 方法
1.2.1 半月板细胞的分离
无菌条件下取3月龄日本大耳白兔半月板纤维软骨，修去滑膜及周围组织，D-Hank′s液漂洗2次，将组织剪碎成1mm3小块，0.25%胰蛋白酶37℃水浴震荡消化30min，含血清的DMEM终止消化，1?000r/min离心5min，弃上清液，D-Hank′s液漂洗，0.2%胶原酶37℃水浴震荡消化4h，离心，漂洗2次，200目金属网过滤，并适当研磨，以利细胞通过滤网。滤液置1?000r/min,弃上清液，沉淀物用10%FBS的DMEM重悬，细胞计数板计数，台盼蓝染色计细胞活力。
, 百拇医药
1.2.2 半月板细胞的原代培养
细胞按2×104/ml接种于3cm×5cm×8cm培养瓶和24孔培养板，瓶内预先放置处理过的盖玻片，5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养，每3d换一次液，倒置显微镜下动态观察细胞形态和生长情况。培养板每天随机取孔，0.25%胰蛋白酶消化计数，取均数描记生长曲线(见图1)。
图1 原代培养半月板纤维软骨细胞的生长曲线
1.2.3 半月板细胞传代培养
细胞铺满单层后，弃上清液，D-Hank′s液冲洗一次，0.25%胰蛋白酶37℃消化5min(显微镜下控制消化)，细胞刚好离壁时，加含血清的DMEM终止消化，吹打，离心，漂洗2次，细胞悬液计数后，调节密度，按2×104/ml于24孔培养板传代培养。
, http://www.100md.com
1.2.4 GAG组织化学和Ⅱ型胶原免疫组化染色
原代培养的细胞作细胞爬片，将铺满细胞的盖玻片取出，10%中性福尔马林液固定20min，分别作SafraninO和甲苯胺蓝染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色按ABC法操作，与成纤维细胞对照，对培养细胞进行组化和免疫组化鉴定。
1.2.5 电镜观察
橡皮刀刮取不同时期的半月板细胞，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，脱水，包埋，超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构。
2 结 果
2.1刚分离的半月板纤维软骨细胞为球形，具折光性，台盼蓝拒染，实验活细胞率达95%。
2.2 细胞24h后开始贴壁，逐渐伸展为多角形，胞核大而圆，2～3个核仁，胞浆丰富，内含分泌颗粒。随着时间的推移(1周)，细胞间开始有突起相连结，周围有基质样物质沉积。细胞保持单层生长，约10d铺满培养瓶，开始传代(见图2)。
, 百拇医药
2.3 第二代细胞贴壁时间较原代细胞短，约12h，可能已经适应体外培养条件，其增殖速度也加快，7d铺满培养瓶。随着传代次数的增加，细胞增殖速度开始减慢，当传到第5代时，细胞分裂能力明显下降，看不清核仁，细胞变形明显，梭形为主，边沿模糊，折光性弱，表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。
2.4 半月板细胞贴壁不久即开始分裂，当细胞进入指数分裂期，其增殖速度明显加快，此时可见细胞周期的各个时相，为观察细胞形态的良好时机，也是利用细胞进行各种实验的最佳时段。倍增时间PDT=(t-t0)log?2/(logN-logN0)，为49.3h。
2.5 培养早期的半月板细胞，甲苯胺蓝和沙红-O(Safranin O)胞浆染色为阳性，显示细胞富含粘多糖基质(Glycosaminoglycans,GAG)，培养晚期细胞周围沉积物也呈GAG阳性，保持了软骨类细胞的表型特征(见图3，4)。
, http://www.100md.com
2.6 原代培养的半月板细胞，Ⅱ型胶原免疫组化染色，胞浆内呈阳性反应，而成纤维细胞为阴性，说明培养的细胞为纤维软骨细胞，而非成纤维细胞(见图5)。
2.7 透射电镜观察培养细胞的超微结构，细胞核仁明显，线粒体、内质网、高尔基体发达，表明培养的细胞具有旺盛的活力(见图6)。
图2 体外培养的半月板纤维软骨细 胞，呈单层生长，细胞内可见分泌颗粒。(倒置显微镜下，×200)
图3 半月板纤维软骨细胞。(甲苯胺蓝染色，×100)
, 百拇医药
图4 半月板纤维软骨细胞。(沙红-O染色，×200)
图5 原代培养半月板纤维软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色，胞浆阳性。(ABC，×200)
图6 第二代半月板纤维软骨细胞超微结构。(透射电镜，×8000)
3 讨 论
半月板属于纤维软骨，有别于一般的关节透明软骨，主要由纤维软骨细胞、基质和胶原构成，在生物学性质上有其特殊性[3]。半月板纤维软骨组织，结构紧密，细胞成份少，胶原和细胞外基质较多，细胞不易分离，要达到分离细胞、不损伤细胞并进行传代的目的，有一定难度[4]。
, 百拇医药
本实验参照纤维软骨细胞分离常用的做法[5]，并加以适当改进，采用机械分离、胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法，使半月板组织中的纤维软骨细胞能充分分离下来，而细胞受到的损伤最小。同时，培养条件也适宜纤维软骨细胞的生长和繁殖。所培养的细胞具备合成GAG和胶原的能力，保持了体内纤维软骨细胞的表型特征；Ⅱ型胶原免疫组化阳性，说明属于软骨细胞类型，因为只有软骨细胞和视网膜神经细胞具备合成Ⅱ型胶原的能力[6]，其它细胞和组织则不行，从而对所培养细胞的类型进行了鉴定。
在培养传代过程中，我们发现半月板纤维软骨细胞的平均贴壁时间、倍增时间(population doubling times, PDT)以及可传代数，均介于文献所报道的关节透明软骨细胞与成纤维细胞之间，其细胞形态、GAG和Ⅱ型胶原组化特点，更接近透明软骨细胞。但在连续培养过程中看不到细胞集簇现象(cell cluster)和类软骨样物质形成，这与一般关节透明软骨细胞有所不同，可能与细胞分离消化充分程度、接种密度以及合成细胞外基质的数量和种类有关[7]。我们还注意到，虽然培养过程中已经纯化并排除了成纤维细胞的存在，只有纤维软骨细胞，但还是能够区别得出有两种半月板细胞：一种较小一点。一种较大一点，可能是半月板组织的深部细胞和浅部细胞，它们都具备纤维软骨细胞的特点[5]，为半月板主要细胞。另外，体外培养传代到一定时间，如传至5代以后，细胞形态和生物学特点将发生变化，表现出通常所说的“反分化”(dedifferentiation)趋势[8]：原来所具备的软骨细胞的一些表型特点逐渐消失，类似成纤维细胞，如细胞细而长，胖梭形，呈旋涡状排列生长，不再合成GAG和Ⅱ型胶原等，所以，以原代培养细胞或第二代细胞进行各种实验比较合适。
, 百拇医药
通过实验，还证实了半月板纤维软骨细胞并非惰性细胞，在一定条件下同样能够完成细胞分裂增殖、基质合成、细胞迁移等。而以往我们认为半月板无血供区(白区)损伤后不能自行愈合[9]，只不过是由于半月板纤维软骨细胞与血液隔绝，没有暴露于参与损伤修复的细胞因子和足够的营养供应之下，而关节滑液仅能维持其正常的营养代谢，对损伤修复的能力有限。这为临床半月板损伤后的修复，提出新的思路，例如增加损伤区域细胞的营养供应、给予外源性细胞因子和刺激因素、提供细胞生物支架(biologic scaffold)等。半月板细胞培养的成功，也为研究纤维软骨组织工程和基因工程[10]，以及半月板损伤后原位修复(repair in situ, 提供了依据，奠定了基础。
作者简介：潘险峰(1968-)，男，云南昆明籍，主治医师，硕士学位。研究方向：骨关节损伤。电话：(0871)4074640
潘险峰(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
, 百拇医药
林月秋(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
汤逊(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
周中英(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
赵稳兴(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
参考文献：
[1] Messner K, Gao J.The menisci of the knee joint. Anatomical and functional characteristics, and a rationale for clinical treatment. J-Anat,1998, 193(2):161～78.
, 百拇医药
[2]Kollias-SL; Fox-JM. Meniscal repair. Where do we go from here? Clin-Sports-Med,1996,15(3):621～30.
[3] McDevitt CA, Webber RJ. The ultrastructure and biochemistry of Meniscal cartilage. Clin Orthop, 1990,252(3):8.
[4] Webber RJ, Harris MG, Hough AJ Jr. Cell culture of rabbit Meniscal fibrochondrocytes:proliferation and synthetic response to growth factors and ascorbate. J Othop Res,1985,3(1):36.
, 百拇医药
[5] Webber RJ. In vitro culture of Meniscal tissue. Clin Orthop, 1990 252(3):114.
[6] 顾天爵.生物化学[M].第3版.北京:人民卫生出版社，1989,20～23.
[7] Kuettner KE, Pauli BU, Gall G, et al. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. J. Cell Biol,1982,93:743.
[8] Von der-Mark K, Conrad G. Cartilage cell differentiation. Clin Orthop, 1979,139:185.
[9] Redman, D.S,and Haynes, D.W.: Meniscal repair: An experimental study in the rabbit.Orthop.Trans,1983,8:59.
[10] Gerich TG, Lobenhoffer P, FU-FH， et al. Possibilities of gene therapy in traumatic and degenerative articular lesions. Current status of experimental and initial clinical applications. Orthopade，1997，26(5):450～8., 百拇医药
摘 要 目的：通过半月板纤维软骨细胞的分离、培养、鉴定，观察其生长特点，研究半月板生物学特性及其损伤修复的细胞学基础。方法：机械分离兔半月板软骨，胰蛋白酶、胶原酶联合消化，10%FBS的DMEM中原代和传代培养，倒置显微镜动态观察细胞形态及生长情况，GAG、Ⅱ型胶原免疫组化染色，电镜观察细胞超微结构。结果：培养细胞呈多角形，有突起，富含分泌颗粒，GAG、Ⅱ型胶原染色阳性，细胞线粒体和内质网发达。结论：培养的细胞保持了体内纤维软骨细胞的基本特性。
关键词：半月板；纤维软骨；细胞；培养的
半月板位于胫股关节之间，在分散应力、缓冲震荡、稳定关节和调节滑液等方面起重要作用。由于解剖结构和本身营养血供匮乏的特点，半月板游离缘损伤后很难自行愈合。如何最大限度保留半月板，以及如何加速半月板损伤后的原位修复，逐渐成为国内外研究的热点[1，2]。由于半月板主要成分为纤维软骨，其生物学特性有别于一般关节软骨(透明软骨)，对半月板纤维软骨细胞(fibrochondrocytes)的体外分离、培养，以及生物学特性的研究，已成为研究半月板损伤后的修复、纤维软骨组织工程和基因治疗的一种重要手段。目前对于半月板细胞的体外培养，国内还未见报道。我们通过兔半月板纤维软骨细胞的培养，观察细胞形态、超微结构，绘制生长曲线，并进行组化和免疫组化鉴定，为下一步的深入研究，奠定基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1材料
DMEM培养液(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Sigma)公司，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)，D-Hank′s液，Ⅱ型胶原抗体及免疫组化试剂盒(晶美公司)，CO2培养箱(Hereaus)，超净工作台(国产)，倒置显微镜(Olympus)，电镜(日立Hitachi, H600)。
1.2 方法
1.2.1 半月板细胞的分离
无菌条件下取3月龄日本大耳白兔半月板纤维软骨，修去滑膜及周围组织，D-Hank′s液漂洗2次，将组织剪碎成1mm3小块，0.25%胰蛋白酶37℃水浴震荡消化30min，含血清的DMEM终止消化，1?000r/min离心5min，弃上清液，D-Hank′s液漂洗，0.2%胶原酶37℃水浴震荡消化4h，离心，漂洗2次，200目金属网过滤，并适当研磨，以利细胞通过滤网。滤液置1?000r/min,弃上清液，沉淀物用10%FBS的DMEM重悬，细胞计数板计数，台盼蓝染色计细胞活力。
, 百拇医药
1.2.2 半月板细胞的原代培养
细胞按2×104/ml接种于3cm×5cm×8cm培养瓶和24孔培养板，瓶内预先放置处理过的盖玻片，5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养，每3d换一次液，倒置显微镜下动态观察细胞形态和生长情况。培养板每天随机取孔，0.25%胰蛋白酶消化计数，取均数描记生长曲线(见图1)。
图1 原代培养半月板纤维软骨细胞的生长曲线
1.2.3 半月板细胞传代培养
细胞铺满单层后，弃上清液，D-Hank′s液冲洗一次，0.25%胰蛋白酶37℃消化5min(显微镜下控制消化)，细胞刚好离壁时，加含血清的DMEM终止消化，吹打，离心，漂洗2次，细胞悬液计数后，调节密度，按2×104/ml于24孔培养板传代培养。
, http://www.100md.com
1.2.4 GAG组织化学和Ⅱ型胶原免疫组化染色
原代培养的细胞作细胞爬片，将铺满细胞的盖玻片取出，10%中性福尔马林液固定20min，分别作SafraninO和甲苯胺蓝染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色按ABC法操作，与成纤维细胞对照，对培养细胞进行组化和免疫组化鉴定。
1.2.5 电镜观察
橡皮刀刮取不同时期的半月板细胞，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，脱水，包埋，超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构。
2 结 果
2.1刚分离的半月板纤维软骨细胞为球形，具折光性，台盼蓝拒染，实验活细胞率达95%。
2.2 细胞24h后开始贴壁，逐渐伸展为多角形，胞核大而圆，2～3个核仁，胞浆丰富，内含分泌颗粒。随着时间的推移(1周)，细胞间开始有突起相连结，周围有基质样物质沉积。细胞保持单层生长，约10d铺满培养瓶，开始传代(见图2)。
, 百拇医药
2.3 第二代细胞贴壁时间较原代细胞短，约12h，可能已经适应体外培养条件，其增殖速度也加快，7d铺满培养瓶。随着传代次数的增加，细胞增殖速度开始减慢，当传到第5代时，细胞分裂能力明显下降，看不清核仁，细胞变形明显，梭形为主，边沿模糊，折光性弱，表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。
2.4 半月板细胞贴壁不久即开始分裂，当细胞进入指数分裂期，其增殖速度明显加快，此时可见细胞周期的各个时相，为观察细胞形态的良好时机，也是利用细胞进行各种实验的最佳时段。倍增时间PDT=(t-t0)log?2/(logN-logN0)，为49.3h。
2.5 培养早期的半月板细胞，甲苯胺蓝和沙红-O(Safranin O)胞浆染色为阳性，显示细胞富含粘多糖基质(Glycosaminoglycans,GAG)，培养晚期细胞周围沉积物也呈GAG阳性，保持了软骨类细胞的表型特征(见图3，4)。
, http://www.100md.com
2.6 原代培养的半月板细胞，Ⅱ型胶原免疫组化染色，胞浆内呈阳性反应，而成纤维细胞为阴性，说明培养的细胞为纤维软骨细胞，而非成纤维细胞(见图5)。
2.7 透射电镜观察培养细胞的超微结构，细胞核仁明显，线粒体、内质网、高尔基体发达，表明培养的细胞具有旺盛的活力(见图6)。
图2 体外培养的半月板纤维软骨细 胞，呈单层生长，细胞内可见分泌颗粒。(倒置显微镜下，×200)
图3 半月板纤维软骨细胞。(甲苯胺蓝染色，×100)
, 百拇医药
图4 半月板纤维软骨细胞。(沙红-O染色，×200)
图5 原代培养半月板纤维软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色，胞浆阳性。(ABC，×200)
图6 第二代半月板纤维软骨细胞超微结构。(透射电镜，×8000)
3 讨 论
半月板属于纤维软骨，有别于一般的关节透明软骨，主要由纤维软骨细胞、基质和胶原构成，在生物学性质上有其特殊性[3]。半月板纤维软骨组织，结构紧密，细胞成份少，胶原和细胞外基质较多，细胞不易分离，要达到分离细胞、不损伤细胞并进行传代的目的，有一定难度[4]。
, 百拇医药
本实验参照纤维软骨细胞分离常用的做法[5]，并加以适当改进，采用机械分离、胰蛋白酶和胶原酶联合消化的方法，使半月板组织中的纤维软骨细胞能充分分离下来，而细胞受到的损伤最小。同时，培养条件也适宜纤维软骨细胞的生长和繁殖。所培养的细胞具备合成GAG和胶原的能力，保持了体内纤维软骨细胞的表型特征；Ⅱ型胶原免疫组化阳性，说明属于软骨细胞类型，因为只有软骨细胞和视网膜神经细胞具备合成Ⅱ型胶原的能力[6]，其它细胞和组织则不行，从而对所培养细胞的类型进行了鉴定。
在培养传代过程中，我们发现半月板纤维软骨细胞的平均贴壁时间、倍增时间(population doubling times, PDT)以及可传代数，均介于文献所报道的关节透明软骨细胞与成纤维细胞之间，其细胞形态、GAG和Ⅱ型胶原组化特点，更接近透明软骨细胞。但在连续培养过程中看不到细胞集簇现象(cell cluster)和类软骨样物质形成，这与一般关节透明软骨细胞有所不同，可能与细胞分离消化充分程度、接种密度以及合成细胞外基质的数量和种类有关[7]。我们还注意到，虽然培养过程中已经纯化并排除了成纤维细胞的存在，只有纤维软骨细胞，但还是能够区别得出有两种半月板细胞：一种较小一点。一种较大一点，可能是半月板组织的深部细胞和浅部细胞，它们都具备纤维软骨细胞的特点[5]，为半月板主要细胞。另外，体外培养传代到一定时间，如传至5代以后，细胞形态和生物学特点将发生变化，表现出通常所说的“反分化”(dedifferentiation)趋势[8]：原来所具备的软骨细胞的一些表型特点逐渐消失，类似成纤维细胞，如细胞细而长，胖梭形，呈旋涡状排列生长，不再合成GAG和Ⅱ型胶原等，所以，以原代培养细胞或第二代细胞进行各种实验比较合适。
, 百拇医药
通过实验，还证实了半月板纤维软骨细胞并非惰性细胞，在一定条件下同样能够完成细胞分裂增殖、基质合成、细胞迁移等。而以往我们认为半月板无血供区(白区)损伤后不能自行愈合[9]，只不过是由于半月板纤维软骨细胞与血液隔绝，没有暴露于参与损伤修复的细胞因子和足够的营养供应之下，而关节滑液仅能维持其正常的营养代谢，对损伤修复的能力有限。这为临床半月板损伤后的修复，提出新的思路，例如增加损伤区域细胞的营养供应、给予外源性细胞因子和刺激因素、提供细胞生物支架(biologic scaffold)等。半月板细胞培养的成功，也为研究纤维软骨组织工程和基因工程[10]，以及半月板损伤后原位修复(repair in situ, 提供了依据，奠定了基础。
作者简介：潘险峰(1968-)，男，云南昆明籍，主治医师，硕士学位。研究方向：骨关节损伤。电话：(0871)4074640
潘险峰(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
, 百拇医药
林月秋(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
汤逊(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
周中英(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
赵稳兴(成都军区昆明总医院全军骨科中心, 650032)
参考文献：
[1] Messner K, Gao J.The menisci of the knee joint. Anatomical and functional characteristics, and a rationale for clinical treatment. J-Anat,1998, 193(2):161～78.
, 百拇医药
[2]Kollias-SL; Fox-JM. Meniscal repair. Where do we go from here? Clin-Sports-Med,1996,15(3):621～30.
[3] McDevitt CA, Webber RJ. The ultrastructure and biochemistry of Meniscal cartilage. Clin Orthop, 1990,252(3):8.
[4] Webber RJ, Harris MG, Hough AJ Jr. Cell culture of rabbit Meniscal fibrochondrocytes:proliferation and synthetic response to growth factors and ascorbate. J Othop Res,1985,3(1):36.
, 百拇医药
[5] Webber RJ. In vitro culture of Meniscal tissue. Clin Orthop, 1990 252(3):114.
[6] 顾天爵.生物化学[M].第3版.北京:人民卫生出版社，1989,20～23.
[7] Kuettner KE, Pauli BU, Gall G, et al. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. J. Cell Biol,1982,93:743.
[8] Von der-Mark K, Conrad G. Cartilage cell differentiation. Clin Orthop, 1979,139:185.
[9] Redman, D.S,and Haynes, D.W.: Meniscal repair: An experimental study in the rabbit.Orthop.Trans,1983,8:59.
[10] Gerich TG, Lobenhoffer P, FU-FH， et al. Possibilities of gene therapy in traumatic and degenerative articular lesions. Current status of experimental and initial clinical applications. Orthopade，1997，26(5):450～8., 百拇医药