t-PA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬时表达
王冬梅 邓继先 程萱 黄秀梨
摘 要 目的：探索建立乳腺瞬时性表达系统，用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性，为进行转基因动物实验奠定基础。方法：DNA常规操作；孕小鼠乳腺注射；纤维蛋白琼脂糖平板法检测Mut-PA。结果：构建了含有Mut-PA基因的乳腺表达载体pB3mt-PA，将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达，产仔后第4天采乳汁，用纤维蛋白琼脂糖平板法检测t-PA的活性，表达活性可达20～40 U/ml，其活性能被天然的t-PA多克隆抗体所中和，表达持续期8 d。结论：所克隆的牛BLG基因-705 bp的5′端调控序列包含了必需的调控元件，并具有调控外源基因的表达的功能，克隆的3′端序列是适合的。构建的表达载体可用于制备转基因动物。
关键词：β-乳球蛋白；突变型组织型纤溶酶原激活剂；暂时性表达系统；乳腺
, http://www.100md.com
组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是体内凝血纤溶系统的重要成分之一，在国外已作为一种溶栓剂用于治疗心肌梗塞及脑血管栓塞等血栓型疾病。本实验所用的突变型t-PA(Mut-PA)序列是在糖基化位点及纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)结合位点等处经过突变的突变体cDNA，具有半衰期长、活性高等特点。我们用牛β-乳球蛋白BLG基因的调控序列调控t-PA的表达，其最终目的是制备大型转基因动物——动物乳腺生物反应器。本实验构建了乳腺表达载体，并将构建的载体直接注入小鼠乳腺进行暂时性表达，旨在探索一种快速检测表达载体的方法，为以后进行转基因动物实验打下基础。
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒
E.coli DH5α, E.coli JM103和pUC19均为本室保存菌株和质粒,含Mut-PA序列的pF103质粒由本所刘士辉博士提供。
, 百拇医药
1.2 酶类、化学试剂及药品
限制性内切酶、T4DNA连接酶、4×dNTP和Taq DNA聚合酶均购自华美生物工程公司和Promega公司;化学试剂均为国产分析级产品;标准t-PA为进口产品; 纤维蛋白原(牛血)、凝血酶购自中国生物制品检定所; 846麻醉剂购自解放军军需大学兽医研究所;PCR引物由本所合成。
1.3 实验动物
昆明小白鼠，雌性5周龄以上， 雄性8～10周龄，均由本院实验动物中心提供。
1.4 DNA常规操作
质粒DNA采用碱裂解法提取，聚乙二醇法纯化；放射性同位素标记采用随机引物法标记；具体操作均按文献[1]进行。
1.5 注射小鼠乳腺
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1.5.1 动物分组 随机将雌性小鼠分为6组，每组2只，放于各单笼。随机将雄性小鼠放入各雌鼠笼中交配。质粒DNA的注射分为6组：A组：空白对照，不注射；B组：对照组，注射质粒pF103；C组：对照组，注射质粒pBLG；D、E、F组：实验组，注射表达载体pB3mt-PA。
1.5.2 注射时间、部位及剂量 将雄性小鼠放入雌性小鼠笼中，第2天检查交配情况，记录时间，取出雄鼠。交配后第14天开始注射。注射部位位于腹股沟两侧的乳腺。将针及针管用煮沸法消毒，注射时将针压于皮肤，注射深度为2 mm，左右各注射一针，在同一部位连续注射5 d。注射剂量为：A组：空白对照，不注射；B组：对照组，注射pF103质粒，50 μl(25～30 μg)/针；C组：对照组，注射pB3质粒，50 μl(25～30 μg)/针；D、E、F组：注射表达质粒pB3mt-PA，50 μl(25～30 μg)/针。1.6 乳汁的采集
小鼠分娩后于注射的乳腺收取乳样。
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1.7 乳汁中Mut-PA的检测
采用纤维蛋白琼脂糖平板法。取9 ml 1.2%的琼脂糖冷却至30℃。先加3 ml纤维蛋白原(10 mg)，再加1 ml凝血酶(1.68 BP单位)，混匀、铺板、打孔。把标准t-PA作一系列稀释，各取10 μl加入孔内，37℃，过夜。测量溶圈直径，绘制标准曲线，求回归方程。同样方法制板，打孔，加入乳汁样品，37℃，过夜。测量溶圈直径，代入方程，求活性。
2 结果
2.1 PCR方法扩增BLG 5′端调控序列和3′端序列
根据Harris等[2]的研究，绵羊BLG 5′端调控序列在转录起始点上游406 bp，具有调控基因表达的作用，由于已知牛和绵羊BLG cDNA序列有91%的同源性，推测其调控序列的同源性可能也很高，所以本实验拟扩增牛BLG基因转录起始点上游的705 bp的侧翼序列，应该也包括了必需的调控序列。我们还加入了酶切位点。根据Mackinglay 报道的牛BLG基因组基因的DNA序列，合成以下两个引物：
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MluⅠ KpnⅠ
↓ ↓
引物1：5′-AACGCGTGGTACCCCTCCCACG-
TGAC-3′
引物2：5′-GAAGCTTCAGGGCTGCAGCGGG-
ATC-3′ ↑
HindⅢ
以奶牛精子DNA为模板，经30轮循环，琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物的结果发现，有一条分子量与预期的相一致的带。将PCR扩增产物克隆至已去掉HindⅢ位点的pUC19 EcoRⅠ/XbaⅠ位点上。经序列分析，与报道的牛BLG基因序列相同。用菌落原位杂交方法筛选重组子，用保留平板对照杂交阳性斑挑取单菌落，培养、提取质粒，并经酶切鉴定。将此重组子命名为pBLG。
, 百拇医药
虽然BLG基因3′端调控序列的实际功能也不完全清楚，但本实验除了克隆牛BLG基因5′端调控序列外，还克隆了牛BLG基因3′端调控序列，以便将来对BLG基因的调控序列进行详细深入的研究。引物设计如下：
SalⅠ
↓
引物1：5′-GGTCGACAGCAGTGCTACATAA-
预计扩增产物长度为1.59 kb，包括第6个外显子、第6个内含子、第7个外显子、AATAAA及其下游约1 kb的侧翼序列。低熔点胶回收1.59 kb片段，经SphⅠ+SalⅠ双酶切后与pBLG连接，构建成pB3载体(图1)。
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图1 pB3载体构建示意图
2.2 目的基因Mut-PA的乳腺表达载体构建和鉴定
质粒pF103经HindⅢ+SalⅠ双酶切得2.0 kb的Mut-PA基因片段，与经同样双酶切的pB3进行粘端定向连接，质粒构建过程见图2。由于Mut-PA突变体序列中有2个EcoRⅠ位点，分别位于801及1273处，而pB3中无EcoRⅠ位点，所以，正确的重组子可被EcoRⅠ切成472 bp及4.9 kb两片段。酶切鉴定见图3。将此重组子命名为pBmt-PA。
2.3 Mut-PA在小鼠乳腺中的表达
采用碱裂解法大量提取质粒pB3，pF103及表达载体pB3mt-PA，经聚乙二醇纯化，70%乙醇沉淀，干燥，溶于TE中，以微量注射器注射孕鼠乳腺，50 μl(25～30 μg)/针，两侧乳腺各一针，连续注射5 d, 于母鼠产仔后第4天和第8天，在注射的乳腺采取乳样进行检测，结果如表1。
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表1 小鼠乳腺暂时性表达结果
质 粒
实验小鼠
(只)
产仔后表达
小鼠(只)
表达水平
(U/ml)
pB3mt-PA
6
3
20～40
pB3
, 百拇医药
2
0
0
pF103
2
0
0
空白
2
0
0
由表1可以看出，在空白对照、注射pB3和pF103(仅含Mut-PA cDNA序列)的3组中，均未能检测出t-PA的表达；在注射表达载体pB3mt-PA的6只小鼠中，有3只在产仔后能表达，其表达水平最高可达40 U/ml(ng/ml)，并能持续表达到第8天以后。溶圈结果见图4。
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图2 pB3mt-PA乳腺表达载体构建示意图
图3 pB3mt-PA酶切鉴定
1.DNA/HindⅢ标志物；2.HindⅢ酶切;
3. MluⅠ酶切;4.SalⅠ+SphⅠ酶切
以上结果表明，我们所构建的受控于牛BLG调控序列的Mut-PA突变体cDNA在小鼠乳腺细胞中表达并随乳汁分泌出来，表达时间超过8 d；同时也表明可用乳腺暂时性表达系统验证所构建载体的正确性。
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图4 溶纤维蛋白圈结果
1.标准t-PA;2.空白乳样;3～6.pB3mt-PA乳样;
7.pB3乳样;8.pF103乳样
3 讨论
动物乳腺反应器的制备较费时,如何判断所构建的乳腺表达载体的有效性极为重要。我们克隆了牛β-乳球蛋白(BLG)基因的调控序列5′端和3′端序列[3]，构建了pB3载体，并以此构建了Mut-PA的乳腺表达载体，将其直接注射入小鼠乳腺，获得了表达，并随乳汁分泌出来，其原理与DNA疫苗相同。Wolff等[4]以氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和β-半乳糖苷酶基因为报道基因，将其RNA或表达载体DNA直接注射小鼠骨骼肌，在肌肉中检测到了表达产物。
乳腺暂时性表达系统的建立，同样涉及到一系列环节和方面。 第一，注射时间。原则上是在乳腺细胞分裂最为旺盛时注射表达载体最有利于乳腺细胞对DNA的摄取。我们在实验中是在小鼠交配后第14天开始注射的。实验结果证明这个时间注射也得到了阳性结果。第二，注射剂量及浓度。一方面，剂量太小或浓度太低都不能使足够的细胞摄取到足够的量，而且会在体内被降解掉大部分，不利于测量其表达效果；另一方面，由于注射的是异源性物质，剂量太大或浓度太高，不仅对孕小鼠有伤害，对载体也是一种浪费。据文献报道，小鼠最适宜的注射剂量为25～50 μg。我们所用的50 μl(25～30 μg)/针，在其合适的范围内。第三，表达持续期及取样时间。目前的实验已证明，采用直接注射DNA方式，质粒DNA进入细胞后以非整合状态存在，故表达时间可能受到一定限制。我们在实验中已经证明，Mut-PA在乳腺中持续表达8 d以上。由于客观条件及时间的限制，如小鼠产仔1～2 d时乳汁少，无法取样；每取一次乳汁对母鼠伤害很大，须待其恢复几天再取样，连续测量其表达难度较大。
, 百拇医药
[基金项目] 国家“八六三”高技术基金资助项目(863-101-05-04)
[作者简介] 王冬梅(1971-)，女，河北保定人，硕士，工程师，王冬梅(中日友好医院临床医学研究所，北京 100029)
邓继先(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
程萱(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
黄秀梨(北京师范大学生命科学学院，北京 100875)
参考文献
[1] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京: 科学出版社, 1992. 16～19.
, 百拇医药
[2] Harris S, McClenaghan M, Simons JP，et al. Gene expression in the mammary gland[J]. J Reprod Fertil,1990, 88(2):707.
[3] Whitelaw CBA, Harris S, McClenaghan M，et al. Position-independent expression of the ovine β-lactoglobulin gene in transgenic mice[J]. Biochem J， 1992, 286(1):31.
[4] Wolff JA, Malone RW, Williams P，et al. Direct gene transfer in vitro[J]. Science，1990,247(4949):1465., http://www.100md.com
摘 要 目的：探索建立乳腺瞬时性表达系统，用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性，为进行转基因动物实验奠定基础。方法：DNA常规操作；孕小鼠乳腺注射；纤维蛋白琼脂糖平板法检测Mut-PA。结果：构建了含有Mut-PA基因的乳腺表达载体pB3mt-PA，将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达，产仔后第4天采乳汁，用纤维蛋白琼脂糖平板法检测t-PA的活性，表达活性可达20～40 U/ml，其活性能被天然的t-PA多克隆抗体所中和，表达持续期8 d。结论：所克隆的牛BLG基因-705 bp的5′端调控序列包含了必需的调控元件，并具有调控外源基因的表达的功能，克隆的3′端序列是适合的。构建的表达载体可用于制备转基因动物。
关键词：β-乳球蛋白；突变型组织型纤溶酶原激活剂；暂时性表达系统；乳腺
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组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是体内凝血纤溶系统的重要成分之一，在国外已作为一种溶栓剂用于治疗心肌梗塞及脑血管栓塞等血栓型疾病。本实验所用的突变型t-PA(Mut-PA)序列是在糖基化位点及纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)结合位点等处经过突变的突变体cDNA，具有半衰期长、活性高等特点。我们用牛β-乳球蛋白BLG基因的调控序列调控t-PA的表达，其最终目的是制备大型转基因动物——动物乳腺生物反应器。本实验构建了乳腺表达载体，并将构建的载体直接注入小鼠乳腺进行暂时性表达，旨在探索一种快速检测表达载体的方法，为以后进行转基因动物实验打下基础。
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒
E.coli DH5α, E.coli JM103和pUC19均为本室保存菌株和质粒,含Mut-PA序列的pF103质粒由本所刘士辉博士提供。
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1.2 酶类、化学试剂及药品
限制性内切酶、T4DNA连接酶、4×dNTP和Taq DNA聚合酶均购自华美生物工程公司和Promega公司;化学试剂均为国产分析级产品;标准t-PA为进口产品; 纤维蛋白原(牛血)、凝血酶购自中国生物制品检定所; 846麻醉剂购自解放军军需大学兽医研究所;PCR引物由本所合成。
1.3 实验动物
昆明小白鼠，雌性5周龄以上， 雄性8～10周龄，均由本院实验动物中心提供。
1.4 DNA常规操作
质粒DNA采用碱裂解法提取，聚乙二醇法纯化；放射性同位素标记采用随机引物法标记；具体操作均按文献[1]进行。
1.5 注射小鼠乳腺
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1.5.1 动物分组 随机将雌性小鼠分为6组，每组2只，放于各单笼。随机将雄性小鼠放入各雌鼠笼中交配。质粒DNA的注射分为6组：A组：空白对照，不注射；B组：对照组，注射质粒pF103；C组：对照组，注射质粒pBLG；D、E、F组：实验组，注射表达载体pB3mt-PA。
1.5.2 注射时间、部位及剂量 将雄性小鼠放入雌性小鼠笼中，第2天检查交配情况，记录时间，取出雄鼠。交配后第14天开始注射。注射部位位于腹股沟两侧的乳腺。将针及针管用煮沸法消毒，注射时将针压于皮肤，注射深度为2 mm，左右各注射一针，在同一部位连续注射5 d。注射剂量为：A组：空白对照，不注射；B组：对照组，注射pF103质粒，50 μl(25～30 μg)/针；C组：对照组，注射pB3质粒，50 μl(25～30 μg)/针；D、E、F组：注射表达质粒pB3mt-PA，50 μl(25～30 μg)/针。1.6 乳汁的采集
小鼠分娩后于注射的乳腺收取乳样。
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1.7 乳汁中Mut-PA的检测
采用纤维蛋白琼脂糖平板法。取9 ml 1.2%的琼脂糖冷却至30℃。先加3 ml纤维蛋白原(10 mg)，再加1 ml凝血酶(1.68 BP单位)，混匀、铺板、打孔。把标准t-PA作一系列稀释，各取10 μl加入孔内，37℃，过夜。测量溶圈直径，绘制标准曲线，求回归方程。同样方法制板，打孔，加入乳汁样品，37℃，过夜。测量溶圈直径，代入方程，求活性。
2 结果
2.1 PCR方法扩增BLG 5′端调控序列和3′端序列
根据Harris等[2]的研究，绵羊BLG 5′端调控序列在转录起始点上游406 bp，具有调控基因表达的作用，由于已知牛和绵羊BLG cDNA序列有91%的同源性，推测其调控序列的同源性可能也很高，所以本实验拟扩增牛BLG基因转录起始点上游的705 bp的侧翼序列，应该也包括了必需的调控序列。我们还加入了酶切位点。根据Mackinglay 报道的牛BLG基因组基因的DNA序列，合成以下两个引物：
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MluⅠ KpnⅠ
↓ ↓
引物1：5′-AACGCGTGGTACCCCTCCCACG-
TGAC-3′
引物2：5′-GAAGCTTCAGGGCTGCAGCGGG-
ATC-3′ ↑
HindⅢ
以奶牛精子DNA为模板，经30轮循环，琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物的结果发现，有一条分子量与预期的相一致的带。将PCR扩增产物克隆至已去掉HindⅢ位点的pUC19 EcoRⅠ/XbaⅠ位点上。经序列分析，与报道的牛BLG基因序列相同。用菌落原位杂交方法筛选重组子，用保留平板对照杂交阳性斑挑取单菌落，培养、提取质粒，并经酶切鉴定。将此重组子命名为pBLG。
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虽然BLG基因3′端调控序列的实际功能也不完全清楚，但本实验除了克隆牛BLG基因5′端调控序列外，还克隆了牛BLG基因3′端调控序列，以便将来对BLG基因的调控序列进行详细深入的研究。引物设计如下：
SalⅠ
↓
引物1：5′-GGTCGACAGCAGTGCTACATAA-
预计扩增产物长度为1.59 kb，包括第6个外显子、第6个内含子、第7个外显子、AATAAA及其下游约1 kb的侧翼序列。低熔点胶回收1.59 kb片段，经SphⅠ+SalⅠ双酶切后与pBLG连接，构建成pB3载体(图1)。
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图1 pB3载体构建示意图
2.2 目的基因Mut-PA的乳腺表达载体构建和鉴定
质粒pF103经HindⅢ+SalⅠ双酶切得2.0 kb的Mut-PA基因片段，与经同样双酶切的pB3进行粘端定向连接，质粒构建过程见图2。由于Mut-PA突变体序列中有2个EcoRⅠ位点，分别位于801及1273处，而pB3中无EcoRⅠ位点，所以，正确的重组子可被EcoRⅠ切成472 bp及4.9 kb两片段。酶切鉴定见图3。将此重组子命名为pBmt-PA。
2.3 Mut-PA在小鼠乳腺中的表达
采用碱裂解法大量提取质粒pB3，pF103及表达载体pB3mt-PA，经聚乙二醇纯化，70%乙醇沉淀，干燥，溶于TE中，以微量注射器注射孕鼠乳腺，50 μl(25～30 μg)/针，两侧乳腺各一针，连续注射5 d, 于母鼠产仔后第4天和第8天，在注射的乳腺采取乳样进行检测，结果如表1。
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表1 小鼠乳腺暂时性表达结果
质 粒
实验小鼠
(只)
产仔后表达
小鼠(只)
表达水平
(U/ml)
pB3mt-PA
6
3
20～40
pB3
, 百拇医药
2
0
0
pF103
2
0
0
空白
2
0
0
由表1可以看出，在空白对照、注射pB3和pF103(仅含Mut-PA cDNA序列)的3组中，均未能检测出t-PA的表达；在注射表达载体pB3mt-PA的6只小鼠中，有3只在产仔后能表达，其表达水平最高可达40 U/ml(ng/ml)，并能持续表达到第8天以后。溶圈结果见图4。
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图2 pB3mt-PA乳腺表达载体构建示意图
图3 pB3mt-PA酶切鉴定
1.DNA/HindⅢ标志物；2.HindⅢ酶切;
3. MluⅠ酶切;4.SalⅠ+SphⅠ酶切
以上结果表明，我们所构建的受控于牛BLG调控序列的Mut-PA突变体cDNA在小鼠乳腺细胞中表达并随乳汁分泌出来，表达时间超过8 d；同时也表明可用乳腺暂时性表达系统验证所构建载体的正确性。
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图4 溶纤维蛋白圈结果
1.标准t-PA;2.空白乳样;3～6.pB3mt-PA乳样;
7.pB3乳样;8.pF103乳样
3 讨论
动物乳腺反应器的制备较费时,如何判断所构建的乳腺表达载体的有效性极为重要。我们克隆了牛β-乳球蛋白(BLG)基因的调控序列5′端和3′端序列[3]，构建了pB3载体，并以此构建了Mut-PA的乳腺表达载体，将其直接注射入小鼠乳腺，获得了表达，并随乳汁分泌出来，其原理与DNA疫苗相同。Wolff等[4]以氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和β-半乳糖苷酶基因为报道基因，将其RNA或表达载体DNA直接注射小鼠骨骼肌，在肌肉中检测到了表达产物。
乳腺暂时性表达系统的建立，同样涉及到一系列环节和方面。 第一，注射时间。原则上是在乳腺细胞分裂最为旺盛时注射表达载体最有利于乳腺细胞对DNA的摄取。我们在实验中是在小鼠交配后第14天开始注射的。实验结果证明这个时间注射也得到了阳性结果。第二，注射剂量及浓度。一方面，剂量太小或浓度太低都不能使足够的细胞摄取到足够的量，而且会在体内被降解掉大部分，不利于测量其表达效果；另一方面，由于注射的是异源性物质，剂量太大或浓度太高，不仅对孕小鼠有伤害，对载体也是一种浪费。据文献报道，小鼠最适宜的注射剂量为25～50 μg。我们所用的50 μl(25～30 μg)/针，在其合适的范围内。第三，表达持续期及取样时间。目前的实验已证明，采用直接注射DNA方式，质粒DNA进入细胞后以非整合状态存在，故表达时间可能受到一定限制。我们在实验中已经证明，Mut-PA在乳腺中持续表达8 d以上。由于客观条件及时间的限制，如小鼠产仔1～2 d时乳汁少，无法取样；每取一次乳汁对母鼠伤害很大，须待其恢复几天再取样，连续测量其表达难度较大。
, 百拇医药
[基金项目] 国家“八六三”高技术基金资助项目(863-101-05-04)
[作者简介] 王冬梅(1971-)，女，河北保定人，硕士，工程师，王冬梅(中日友好医院临床医学研究所，北京 100029)
邓继先(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
程萱(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
黄秀梨(北京师范大学生命科学学院，北京 100875)
参考文献
[1] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京: 科学出版社, 1992. 16～19.
, 百拇医药
[2] Harris S, McClenaghan M, Simons JP，et al. Gene expression in the mammary gland[J]. J Reprod Fertil,1990, 88(2):707.
[3] Whitelaw CBA, Harris S, McClenaghan M，et al. Position-independent expression of the ovine β-lactoglobulin gene in transgenic mice[J]. Biochem J， 1992, 286(1):31.
[4] Wolff JA, Malone RW, Williams P，et al. Direct gene transfer in vitro[J]. Science，1990,247(4949):1465., http://www.100md.com