可见光光谱法评价胶体金粒径及分布
彭剑淳 刘晓达 丁晓萍 付占江 王全立
摘 要 目的：利用可见光光谱法，建立便于实验室使用的评价胶体金粒径及分布的方法。方法：制备不同颗粒直径的胶体金。利用紫外分光光度计对胶体金进行扫描，得到最大吸收峰波长及峰宽；通过透射电镜观察其颗粒直径及分布，再将二者结果进行比较，求出回归方程。结果：在所研究范围内, 胶体金最大吸收峰波长与粒径(10～70 nm)呈线性相关；峰宽越小粒子分布越均匀。结论：使用可见光光谱法评价胶体金的粒径及分布, 操作简便快捷，便于实验室使用。
关键词：光谱分析；胶体金；显微镜检查，电子
目前，利用胶体金为标记物的免疫金染色方法已广泛应用于组织病理学和免疫学诊断等领域[1]。在胶体金制备过程中，影响颗粒大小及均一程度的因素很多，所以制备完毕后须经质量鉴定才能应用。通常选用透射电镜下观察，拍片放大后测量的方法。这种方法虽然直观准确，但电镜仪器昂贵，难以普及而且测定费时且费用较高，不便于实验室的日常使用。胶体金具有一般溶胶的特性，属于非均相分散体系。由于金胶粒表面等离激元共振，在可见光区域产生吸收谱带；溶胶粒子的大小在1～100 nm之间，有一定强度的散射现象。其消光度值是粒子吸收与散射作用的总和，所以胶体金颗粒吸收峰波长与颗粒大小有关。粒子越大则散射光的波长越大。根据胶体金的这一特性推测，胶体金粒径及分布可能与其吸收峰波长及峰宽有一定相关性。
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1 材料与方法
1.1 材料
HAuCl4*4H2O 为北京化工厂产品, 分析纯。SigmaCote(硅烷化试剂)购自Sigma 公司，Spectronic Genesys 5 紫外分光光度计购自Spectronic Instruments公司， Philips 400T透射电镜为荷兰 Philips 公司产品。
1.2 胶体金的制备
按照Frens[2]与Horisberger等[3]方法，即柠檬酸三钠(sodium citrate)还原法制备不同颗粒直径的胶体金。所用玻璃器皿均经硅烷化处理。胶体金透析过夜并经0.45 μm滤膜过滤。
1.3 透射电镜评价胶体金质量
, 百拇医药
透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。
1.4 可见光光谱法评价胶体金质量
用Spectronic Genesys 5型紫外分光光度计的扫描功能对胶体金在可见光范围内(400～600 nm)进行扫描，获得胶体金可见光区吸收光谱，记录最大吸收波长、最小吸收峰波长、峰宽。
2 结果
2.1 制备不同粒径的胶体金
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。还原剂柠檬酸三钠的量直接影响胶体金颗粒直径。选用不同柠檬酸三钠的量制备直径为10～90 nm的胶体金。
, 百拇医药
2.2 可见光光谱法评价胶体金粒径及分布与透射电镜观测法的比较
将同一胶体金通过透射电镜观察获得的数据与进行可见光区扫描获得的数据列表比较并进行统计分析(表1、图1)，得出在所研究范围内胶体金颗粒与最大吸收峰之间存在直线回归关系，回归方程：Y=0.4271X+514.56(n=6,r=0.974，P<0.01)。
表1 合成胶体金的还原剂用量、颗粒直径、吸收峰波长的数据
1%柠檬酸三钠(V/ml)
粒径(nm)
λmax/nm
λmin/nm
3.00
, 百拇医药
10
517
436
2.25
15
523
441
1.00
35
529
448
0.80
50
, http://www.100md.com
538
457
0.60
60
541
466
0.50
72
544
466
图1 胶体金粒径与最大吸收峰波长的回归直线
通过电镜照片中胶体金颗粒均匀程度与可见光区吸收峰宽的比较，可见主峰宽度越小，颗粒越均匀(图2A)；主峰宽度越大，颗粒越不均匀，出现椭圆形及多角形(图2B)。
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图2 胶体金颗粒的电镜照片与光谱扫描图
A.胶体金的颗粒直径约23 nm；B.颗粒直径50～70 nm
3 讨论
选用透射电镜观测是鉴定胶体金粒径及分布的金标准，但这种方法不便于日常工作使用。我们所建立的通过可见光光谱测定胶体金粒径及分布的方法将测量标准量化，并对实验数据作了统计分析，拟合出颗粒直径与其吸收峰波长的关系曲线。这样,根据吸收峰波长查表可直接得出颗粒直径的具体数值，通过其峰形又可直观地了解颗粒的均一程度。这一方法操作简便快捷，更适合实验室日常使用。
[作者简介] 彭剑淳(1976-)，女，河北定洲人，助理实验师。
彭剑淳(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
, 百拇医药
刘晓达(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
丁晓萍(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
付占江(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
王全立(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
参考文献
[1] Elghanian R, Storhoff JJ, Mucic RC, et al. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles[J]. Science, 1997, 277(5329):1078.
[2] Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J].Nat Phys Sci,1973,241(105):20.
[3] Horisberger M,Rosset J.Colloidal gold, a useful marker for transmission and scannng electron microscopy[J].J Histochem Cytochem,1997,25(4)：295., http://www.100md.com
摘 要 目的：利用可见光光谱法，建立便于实验室使用的评价胶体金粒径及分布的方法。方法：制备不同颗粒直径的胶体金。利用紫外分光光度计对胶体金进行扫描，得到最大吸收峰波长及峰宽；通过透射电镜观察其颗粒直径及分布，再将二者结果进行比较，求出回归方程。结果：在所研究范围内, 胶体金最大吸收峰波长与粒径(10～70 nm)呈线性相关；峰宽越小粒子分布越均匀。结论：使用可见光光谱法评价胶体金的粒径及分布, 操作简便快捷，便于实验室使用。
关键词：光谱分析；胶体金；显微镜检查，电子
目前，利用胶体金为标记物的免疫金染色方法已广泛应用于组织病理学和免疫学诊断等领域[1]。在胶体金制备过程中，影响颗粒大小及均一程度的因素很多，所以制备完毕后须经质量鉴定才能应用。通常选用透射电镜下观察，拍片放大后测量的方法。这种方法虽然直观准确，但电镜仪器昂贵，难以普及而且测定费时且费用较高，不便于实验室的日常使用。胶体金具有一般溶胶的特性，属于非均相分散体系。由于金胶粒表面等离激元共振，在可见光区域产生吸收谱带；溶胶粒子的大小在1～100 nm之间，有一定强度的散射现象。其消光度值是粒子吸收与散射作用的总和，所以胶体金颗粒吸收峰波长与颗粒大小有关。粒子越大则散射光的波长越大。根据胶体金的这一特性推测，胶体金粒径及分布可能与其吸收峰波长及峰宽有一定相关性。
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1 材料与方法
1.1 材料
HAuCl4*4H2O 为北京化工厂产品, 分析纯。SigmaCote(硅烷化试剂)购自Sigma 公司，Spectronic Genesys 5 紫外分光光度计购自Spectronic Instruments公司， Philips 400T透射电镜为荷兰 Philips 公司产品。
1.2 胶体金的制备
按照Frens[2]与Horisberger等[3]方法，即柠檬酸三钠(sodium citrate)还原法制备不同颗粒直径的胶体金。所用玻璃器皿均经硅烷化处理。胶体金透析过夜并经0.45 μm滤膜过滤。
1.3 透射电镜评价胶体金质量
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透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。
1.4 可见光光谱法评价胶体金质量
用Spectronic Genesys 5型紫外分光光度计的扫描功能对胶体金在可见光范围内(400～600 nm)进行扫描，获得胶体金可见光区吸收光谱，记录最大吸收波长、最小吸收峰波长、峰宽。
2 结果
2.1 制备不同粒径的胶体金
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。还原剂柠檬酸三钠的量直接影响胶体金颗粒直径。选用不同柠檬酸三钠的量制备直径为10～90 nm的胶体金。
, 百拇医药
2.2 可见光光谱法评价胶体金粒径及分布与透射电镜观测法的比较
将同一胶体金通过透射电镜观察获得的数据与进行可见光区扫描获得的数据列表比较并进行统计分析(表1、图1)，得出在所研究范围内胶体金颗粒与最大吸收峰之间存在直线回归关系，回归方程：Y=0.4271X+514.56(n=6,r=0.974，P<0.01)。
表1 合成胶体金的还原剂用量、颗粒直径、吸收峰波长的数据
1%柠檬酸三钠(V/ml)
粒径(nm)
λmax/nm
λmin/nm
3.00
, 百拇医药
10
517
436
2.25
15
523
441
1.00
35
529
448
0.80
50
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538
457
0.60
60
541
466
0.50
72
544
466
图1 胶体金粒径与最大吸收峰波长的回归直线
通过电镜照片中胶体金颗粒均匀程度与可见光区吸收峰宽的比较，可见主峰宽度越小，颗粒越均匀(图2A)；主峰宽度越大，颗粒越不均匀，出现椭圆形及多角形(图2B)。
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图2 胶体金颗粒的电镜照片与光谱扫描图
A.胶体金的颗粒直径约23 nm；B.颗粒直径50～70 nm
3 讨论
选用透射电镜观测是鉴定胶体金粒径及分布的金标准，但这种方法不便于日常工作使用。我们所建立的通过可见光光谱测定胶体金粒径及分布的方法将测量标准量化，并对实验数据作了统计分析，拟合出颗粒直径与其吸收峰波长的关系曲线。这样,根据吸收峰波长查表可直接得出颗粒直径的具体数值，通过其峰形又可直观地了解颗粒的均一程度。这一方法操作简便快捷，更适合实验室日常使用。
[作者简介] 彭剑淳(1976-)，女，河北定洲人，助理实验师。
彭剑淳(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
, 百拇医药
刘晓达(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
丁晓萍(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
付占江(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
王全立(军事医学科学院野战输血研究所, 北京 100850)
参考文献
[1] Elghanian R, Storhoff JJ, Mucic RC, et al. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles[J]. Science, 1997, 277(5329):1078.
[2] Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J].Nat Phys Sci,1973,241(105):20.
[3] Horisberger M,Rosset J.Colloidal gold, a useful marker for transmission and scannng electron microscopy[J].J Histochem Cytochem,1997,25(4)：295., http://www.100md.com