霍乱毒素A、B亚基基因比例表达的精确调节
曹诚 李平 李杰之 石成华 马清钧
摘 要 目的：研究霍乱毒素A亚基基因内部翻译起始序列的翻译起始效率与A亚基基因翻译起始效率的关系。方法：将基因内翻译起始序列合成后克隆到上游含有起始密码和无起始密码的报告质粒中，研究表达水平的差异。结果：在上游翻译起始区(translation initiation region,TIR)与报告基因间插入该序列，基因的表达水平提高1倍；当上游的翻译起始密码由ATG突变为ATC时，内部翻译起始序列几乎失去翻译起始功能。结论：TIR-1的翻译起始效率与上游起始序列的起始效率相同；且受上游翻译起始序列的精确调控。
关键词：霍乱毒素；热不稳定毒素；操纵子；翻译调控
, http://www.100md.com 原核基因普遍存在多顺反子现象。同一操纵子中的功能相关的基因根据功能需要，往往以一定的比例表达。霍乱毒素由1个A亚基和5个B亚基组成， 由霍乱毒素操纵子(ctx)编码,其B基因(ctxB)的表达水平是A基因(ctxA)的5(在霍乱弧菌中表达)至7(在大肠杆菌中表达)倍，以前的报道认为这种差异主要是因为ctxB的SD序列较为合适[1]。
我们的前期研究证实，霍乱毒素A、B亚基基因间存在翻译偶联现象，而且在霍乱毒素A亚基基因内部存在一个80 bp的翻译调控元件，含有3个典型的翻译起始序列(图1)，通过点突变将TIR-3的起始密码ATG突变后，B基因的表达水平降低至1/9,通过体外转录-体外翻译研究证实了从该调控元件的翻译起始效率较从ctxA基因的翻译起始效率高得多(全文另发表)。根据上述结果，我们认为霍乱毒素A、B基因比例表达的机理是：在A基因内部存在多个翻译起始序列，从该序列起始翻译的核糖体与从ctxA基因起始密码起始翻译的核糖体一起到达ctxA基因的终止密码，并可通过翻译偶联机制继续B基因的翻译，从而使ctxB基因的翻译水平为ctxA基因的5～7倍。
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图1 霍乱毒素A亚基基因内部的翻译调控序列及其RNA二级结构
由于该翻译调控元件所含3个典型的翻译起始序列均位于强的RNA二级结构中，因此，我们认为这些翻译起始区没有独立的翻译起始活性，只有当上游(ctxA)起始翻译的核糖体翻译至该区时，使该区的RNA二级结构打开，从而有核糖体从该翻译起始区起始翻译。从内部翻译调控元件的翻译起始与上游(ctxA)起始密码起始翻译的效率有关，并具有一定比例，从而实现精确调控。本研究从多条途径证实了上述设想。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
pORF-1，M13mp18及大肠杆菌菌株DH5α均为本室保存。
1.2 工具酶及化学试剂
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA 连接酶为Promega公司产品，vent DNA聚合酶为New England Biolabs公司产品，邻硝基苯基β-D-半乳糖苷(ONPG)为Gibco/BRL公司产品，其他试剂为国产分析纯试剂。
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1.3 PCR引物
LacP11:5′-TGGAATTCCCGACTGGAAAGC-
GG,与lac启动子上游序列配对；
LacP1:5′-TCGGATCCGCACTAGT(C/G)-ATAGCTGTTTCCTGTGTG与lacZ基因SD序列和起始密码互补，用LacP11+LacP1为引物，以M13mp18为模板，可以扩增出含有lac启动子、lacZ基因翻译起始调控序列的DNA片段，由于其中(C/G)采用了混合核苷酸法合成，因此同时可以得到将lacZ基因的起始密码突变为ATC的突变体。
1.4 DNA重组及DNA序列分析
按文献[2]进行。其中PCR使用混有少量vent DNA 聚合酶的Taq DNA 聚合酶(按1 U Taq酶加入0.1 U vent酶),以降低错误掺入概率。同位素测序时使用Phramacia 公司的T7 DNA测序酶及其试剂盒；DNA自动序列分析采用Pekin Elmer ABI373型DNA序列分析仪。
, 百拇医药
1.5 β-半乳糖苷酶活性的测定
本研究以β-半乳糖苷酶为报告基因，其表达水平的测定简述如下：待测菌株在LB培养基中培养至稳定期(37℃培养20 h)，按1%的比例接种至25 ml LB 培养基(装于250 ml 的三角瓶)，37℃、200 r/min振荡培养3.5 h,加IPTG至终浓度1 mmol/L诱导30 min,取0.5 ml菌液，加入10 μl 裂解液(1.25% SDS，2.5 mmol/L MnSO4,12.5%甲苯，62.5% β-巯基乙醇)[3]，振荡后37℃保温10 min后取10 μl用于酶活性测定。
在96孔反应板中加入20 mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0),第一孔190 μl,后续各孔100 μl，将10 μl裂解样品加入第1孔(20倍稀释)，然后依次做2倍稀释，稀释完毕后加入25 μl底物(ONPG 10 mg/ml,MgSO4 5 mmol/L,磷酸缓冲液20 mmol/L，pH8.0),37℃温育30 min,加入100 μl Na2CO3 终止反应，于405 nm波长测定吸光度，以1∶320稀释时的D405值为单位。
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2 结果与讨论
2.1 ctxA基因内部翻译起始元件的合成
根据图1,合成了编码TIR-1的的两个核苷酸片段：
HAⅠ ：5′-GCTCTAGACCTCCTGATGAAATAA
AGCAGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAG
ACTAGTCAGG ATCCG；
HAⅡ:5′-TCGGATCCACTAGTCTGTC。
HAⅡ与HAⅠ的3′端互补，二者退火后通过大肠杆菌DNA聚合酶I大片段补平，可以得到完整的TIR-1片段。用XbaⅠ和BamHⅠ酶切后克隆至M13mp18进行DNA序列分析，挑选序列完全正确的克隆应用于后续研究。
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2.2 报告基因的构建
本研究的目的是检验TIR-1在大肠杆菌中是否具有翻译起始功能，以及其翻译起始功能与上游翻译起始效率的关系，因此我们使用lac启动子替代ctx启动子(该启动子存在复杂的调控模式)，使用lacZ基因的翻译起始序列为上游的翻译起始序列，使用lacZ基因作为报告基因，构建了报告质粒pMCB和pMCQ(图2).pMCB含有lacZ基因的ATG，而pMCQ中，则将ATG突变为ATC，从而不具有翻译起始功能.上述质粒PCR扩增部分均经DNA序列分析证实完全正确.
图2 报告质粒pMCB及pMCQ的构建
由于PCR引物中采用了混合核苷酸合成，因此通过在
X-gal平板变蓝及序列分析得到pMCB和pMCQ
2.3 TIR-1使报告基因的表达增加1倍
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将TIR-1用XbaⅠ BamHⅠ酶切后克隆至pMCB的SPeⅠ及BemHⅠ位点，构建了质粒pMCB-10，经酶切、PCR同时转化大肠杆菌DH5，进行表达水平的比较(表1)。
表1 pMCB、pMCQ、pMCB10及pMCQ10质粒
在大肠杆菌中表达水平的比较
质 粒
测定
次数
表达量平均值
(D405)
表达量/细菌生物量
(D600)平均值
, 百拇医药
pMCB
12
1.179±0.067
0.450±0.04
pMCQ
12
0.221±0.008
0.080±0.003
pMCB10
12
2.388±0.142
1.090±0.06
, http://www.100md.com
pMCQ10
12
0.092±0.007
0.033±0.003
由表1可见，当TIR-1以合适的相位插入lacZ的起始密码和结构基因之间后，pMCB10β-半乳糖苷酶的表达量是pMCB的2.02倍，如考虑细菌生长量的差异，则较pMCB高2.4倍，说明从TIR-1翻译起始的效率与从上游lacZ基因的起始密码起始的效率相近， 而且成一定比例，与预期结果相符。
2.4 TIR-1的翻译起始活性与上游翻译起始相关
同上述，将TIR-1克隆至pMCQ,构建质粒pMCQ10,lacZ基因没有自己的起始密码，但TIR-1的翻译起始结构保留完整。结果lacZ基因表达水平低于pMCQ,从TIR-1几乎没有翻译起始，说明TIR-1处的翻译起始受上游翻译起始的调控：当上游不能翻译时，由于TIR-1的较强的二级结构，不能起始翻译，这种调控方式与翻译弱化调控非常类似。
, 百拇医药
以上结果证实，霍乱毒素A亚基基因内部翻译调控序列的翻译起始活性受上游翻译起始效率的调控。如果从ctxA起始密码有一个核糖体起始翻译，该核糖体通过翻译调控元件时，RNA二级结构打开，在TIR-1有一个核糖体起始翻译；从TIR-2、TIR-3也会各有1个或多个核糖体起始翻译(与核糖体在TIR-1起始时停留时间有关 )，这些核糖体翻译至ctxA基因的终止密码，并通过翻译偶联继续B亚基基因的翻译，使B基因的翻译水平远高于A基因的翻译水平，使B基因的表达水平是A基因的5～7倍。从ctxA基因内部翻译调控元件的翻译起始效率受ctxA基因起始密码起始效率的精确调控，从而实现ctxA、B基因比例表达的精确调控。
[基金项目]北京市自然科学基金资助项目(5992014)
[作者简介]曹诚(1966-)，男，湖北宜昌人，副研究员，博士。
曹诚(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
, 百拇医药
李平(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
李杰之(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
石成华(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
马清钧(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
参考文献
[1]Mecananos JJ,Murphy JR.Cholera toxin genes:nucleotide sequence.Deletion analysis and vaccine development[J].Nature,1983，306(5943)：551.
[2]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆[M].北京：科学出版社，1992.1.21.
[3]Putnam SL,Koch AL.Complications in the simplest cellular enzyme assay:lysis of Escherichia coli for the assay of beta-galactosidase[J].Anal Biochem，1975，63(2):350., 百拇医药
摘 要 目的：研究霍乱毒素A亚基基因内部翻译起始序列的翻译起始效率与A亚基基因翻译起始效率的关系。方法：将基因内翻译起始序列合成后克隆到上游含有起始密码和无起始密码的报告质粒中，研究表达水平的差异。结果：在上游翻译起始区(translation initiation region,TIR)与报告基因间插入该序列，基因的表达水平提高1倍；当上游的翻译起始密码由ATG突变为ATC时，内部翻译起始序列几乎失去翻译起始功能。结论：TIR-1的翻译起始效率与上游起始序列的起始效率相同；且受上游翻译起始序列的精确调控。
关键词：霍乱毒素；热不稳定毒素；操纵子；翻译调控
, http://www.100md.com 原核基因普遍存在多顺反子现象。同一操纵子中的功能相关的基因根据功能需要，往往以一定的比例表达。霍乱毒素由1个A亚基和5个B亚基组成， 由霍乱毒素操纵子(ctx)编码,其B基因(ctxB)的表达水平是A基因(ctxA)的5(在霍乱弧菌中表达)至7(在大肠杆菌中表达)倍，以前的报道认为这种差异主要是因为ctxB的SD序列较为合适[1]。
我们的前期研究证实，霍乱毒素A、B亚基基因间存在翻译偶联现象，而且在霍乱毒素A亚基基因内部存在一个80 bp的翻译调控元件，含有3个典型的翻译起始序列(图1)，通过点突变将TIR-3的起始密码ATG突变后，B基因的表达水平降低至1/9,通过体外转录-体外翻译研究证实了从该调控元件的翻译起始效率较从ctxA基因的翻译起始效率高得多(全文另发表)。根据上述结果，我们认为霍乱毒素A、B基因比例表达的机理是：在A基因内部存在多个翻译起始序列，从该序列起始翻译的核糖体与从ctxA基因起始密码起始翻译的核糖体一起到达ctxA基因的终止密码，并可通过翻译偶联机制继续B基因的翻译，从而使ctxB基因的翻译水平为ctxA基因的5～7倍。
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图1 霍乱毒素A亚基基因内部的翻译调控序列及其RNA二级结构
由于该翻译调控元件所含3个典型的翻译起始序列均位于强的RNA二级结构中，因此，我们认为这些翻译起始区没有独立的翻译起始活性，只有当上游(ctxA)起始翻译的核糖体翻译至该区时，使该区的RNA二级结构打开，从而有核糖体从该翻译起始区起始翻译。从内部翻译调控元件的翻译起始与上游(ctxA)起始密码起始翻译的效率有关，并具有一定比例，从而实现精确调控。本研究从多条途径证实了上述设想。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
pORF-1，M13mp18及大肠杆菌菌株DH5α均为本室保存。
1.2 工具酶及化学试剂
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA 连接酶为Promega公司产品，vent DNA聚合酶为New England Biolabs公司产品，邻硝基苯基β-D-半乳糖苷(ONPG)为Gibco/BRL公司产品，其他试剂为国产分析纯试剂。
, http://www.100md.com
1.3 PCR引物
LacP11:5′-TGGAATTCCCGACTGGAAAGC-
GG,与lac启动子上游序列配对；
LacP1:5′-TCGGATCCGCACTAGT(C/G)-ATAGCTGTTTCCTGTGTG与lacZ基因SD序列和起始密码互补，用LacP11+LacP1为引物，以M13mp18为模板，可以扩增出含有lac启动子、lacZ基因翻译起始调控序列的DNA片段，由于其中(C/G)采用了混合核苷酸法合成，因此同时可以得到将lacZ基因的起始密码突变为ATC的突变体。
1.4 DNA重组及DNA序列分析
按文献[2]进行。其中PCR使用混有少量vent DNA 聚合酶的Taq DNA 聚合酶(按1 U Taq酶加入0.1 U vent酶),以降低错误掺入概率。同位素测序时使用Phramacia 公司的T7 DNA测序酶及其试剂盒；DNA自动序列分析采用Pekin Elmer ABI373型DNA序列分析仪。
, 百拇医药
1.5 β-半乳糖苷酶活性的测定
本研究以β-半乳糖苷酶为报告基因，其表达水平的测定简述如下：待测菌株在LB培养基中培养至稳定期(37℃培养20 h)，按1%的比例接种至25 ml LB 培养基(装于250 ml 的三角瓶)，37℃、200 r/min振荡培养3.5 h,加IPTG至终浓度1 mmol/L诱导30 min,取0.5 ml菌液，加入10 μl 裂解液(1.25% SDS，2.5 mmol/L MnSO4,12.5%甲苯，62.5% β-巯基乙醇)[3]，振荡后37℃保温10 min后取10 μl用于酶活性测定。
在96孔反应板中加入20 mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0),第一孔190 μl,后续各孔100 μl，将10 μl裂解样品加入第1孔(20倍稀释)，然后依次做2倍稀释，稀释完毕后加入25 μl底物(ONPG 10 mg/ml,MgSO4 5 mmol/L,磷酸缓冲液20 mmol/L，pH8.0),37℃温育30 min,加入100 μl Na2CO3 终止反应，于405 nm波长测定吸光度，以1∶320稀释时的D405值为单位。
, http://www.100md.com
2 结果与讨论
2.1 ctxA基因内部翻译起始元件的合成
根据图1,合成了编码TIR-1的的两个核苷酸片段：
HAⅠ ：5′-GCTCTAGACCTCCTGATGAAATAA
AGCAGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGACAG
ACTAGTCAGG ATCCG；
HAⅡ:5′-TCGGATCCACTAGTCTGTC。
HAⅡ与HAⅠ的3′端互补，二者退火后通过大肠杆菌DNA聚合酶I大片段补平，可以得到完整的TIR-1片段。用XbaⅠ和BamHⅠ酶切后克隆至M13mp18进行DNA序列分析，挑选序列完全正确的克隆应用于后续研究。
, http://www.100md.com
2.2 报告基因的构建
本研究的目的是检验TIR-1在大肠杆菌中是否具有翻译起始功能，以及其翻译起始功能与上游翻译起始效率的关系，因此我们使用lac启动子替代ctx启动子(该启动子存在复杂的调控模式)，使用lacZ基因的翻译起始序列为上游的翻译起始序列，使用lacZ基因作为报告基因，构建了报告质粒pMCB和pMCQ(图2).pMCB含有lacZ基因的ATG，而pMCQ中，则将ATG突变为ATC，从而不具有翻译起始功能.上述质粒PCR扩增部分均经DNA序列分析证实完全正确.
图2 报告质粒pMCB及pMCQ的构建
由于PCR引物中采用了混合核苷酸合成，因此通过在
X-gal平板变蓝及序列分析得到pMCB和pMCQ
2.3 TIR-1使报告基因的表达增加1倍
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将TIR-1用XbaⅠ BamHⅠ酶切后克隆至pMCB的SPeⅠ及BemHⅠ位点，构建了质粒pMCB-10，经酶切、PCR同时转化大肠杆菌DH5，进行表达水平的比较(表1)。
表1 pMCB、pMCQ、pMCB10及pMCQ10质粒
在大肠杆菌中表达水平的比较
质 粒
测定
次数
表达量平均值
(D405)
表达量/细菌生物量
(D600)平均值
, 百拇医药
pMCB
12
1.179±0.067
0.450±0.04
pMCQ
12
0.221±0.008
0.080±0.003
pMCB10
12
2.388±0.142
1.090±0.06
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pMCQ10
12
0.092±0.007
0.033±0.003
由表1可见，当TIR-1以合适的相位插入lacZ的起始密码和结构基因之间后，pMCB10β-半乳糖苷酶的表达量是pMCB的2.02倍，如考虑细菌生长量的差异，则较pMCB高2.4倍，说明从TIR-1翻译起始的效率与从上游lacZ基因的起始密码起始的效率相近， 而且成一定比例，与预期结果相符。
2.4 TIR-1的翻译起始活性与上游翻译起始相关
同上述，将TIR-1克隆至pMCQ,构建质粒pMCQ10,lacZ基因没有自己的起始密码，但TIR-1的翻译起始结构保留完整。结果lacZ基因表达水平低于pMCQ,从TIR-1几乎没有翻译起始，说明TIR-1处的翻译起始受上游翻译起始的调控：当上游不能翻译时，由于TIR-1的较强的二级结构，不能起始翻译，这种调控方式与翻译弱化调控非常类似。
, 百拇医药
以上结果证实，霍乱毒素A亚基基因内部翻译调控序列的翻译起始活性受上游翻译起始效率的调控。如果从ctxA起始密码有一个核糖体起始翻译，该核糖体通过翻译调控元件时，RNA二级结构打开，在TIR-1有一个核糖体起始翻译；从TIR-2、TIR-3也会各有1个或多个核糖体起始翻译(与核糖体在TIR-1起始时停留时间有关 )，这些核糖体翻译至ctxA基因的终止密码，并通过翻译偶联继续B亚基基因的翻译，使B基因的翻译水平远高于A基因的翻译水平，使B基因的表达水平是A基因的5～7倍。从ctxA基因内部翻译调控元件的翻译起始效率受ctxA基因起始密码起始效率的精确调控，从而实现ctxA、B基因比例表达的精确调控。
[基金项目]北京市自然科学基金资助项目(5992014)
[作者简介]曹诚(1966-)，男，湖北宜昌人，副研究员，博士。
曹诚(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
, 百拇医药
李平(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
李杰之(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
石成华(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
马清钧(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850)
参考文献
[1]Mecananos JJ,Murphy JR.Cholera toxin genes:nucleotide sequence.Deletion analysis and vaccine development[J].Nature,1983，306(5943)：551.
[2]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆[M].北京：科学出版社，1992.1.21.
[3]Putnam SL,Koch AL.Complications in the simplest cellular enzyme assay:lysis of Escherichia coli for the assay of beta-galactosidase[J].Anal Biochem，1975，63(2):350., 百拇医药