不同的组织移植到宿主脊髓组织病理学观察
不同的组织移植到宿主脊髓组织病理学观察
张强 廖维宏 王正国 伍亚民 李应玉 陈恒胜
摘 要 目的：研究胚胎脊髓，肋间神经，大网膜，椎旁肌移植到宿主脊髓后发育过程中形态变化。方法：应用脊髓半切洞模型，移植后1，2，4，12周，进行HE、Nissl、嗜银染色和电镜检查，观察移植物存活、分化及其与宿主之间的关系。结果：胚胎脊髓移植到损伤的脊髓后，可在宿主脊髓内继续分化发育，与宿主脊髓形成部分纤维连接；肋间神经移植后，可能通过存活的雪旺氏细胞与宿主脊髓建立一定的结构联系；带蒂的大网膜移植后，可与宿主脊髓 形成血管连接；带蒂的椎旁肌移植最终形成瘢痕组织。结论：胚胎脊髓组织能较好地修复损伤的脊髓。
, 百拇医药
关键词：脊髓损伤；移植；胚胎脊髓；肋间神经；大网膜；椎旁肌
组织移植治疗脊髓损伤的研究已开展多年[1～3]，但以往的研究主要集中在提高移植物存活率，选择合适的移植物，促进功能恢复等方面。而对于移植物在宿主体内的形态发育过程及其与宿主脊髓间连接情况，尚未见较系统的报道。本实验选用了目前常用的胚胎脊髓，肋间神经，带蒂的大网膜，椎旁肌移植到宿主脊髓，观察其在宿主脊髓内发育过程中的形态变化。
1 材料与方法
1.1 动物分组
Wistar 成年大鼠，体重180～250g，雌雄不拘，每个时相点每组6只动物，共96只大鼠。采用大鼠脊髓半切洞损伤，随机将动物分为，A组：损伤+胚胎脊髓组；B组：损伤+肋间神经组；C组：损伤+大网膜组；D组：损伤+椎旁肌组。手术后1，2，4，12周，应用光、电镜观察移植物在大鼠损伤脊髓的形态变化。
, 百拇医药
1.2 手术方法
用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大，用负压吸引的方法损毁并吸除腰膨大左侧半脊髓，造成一约2×2×2mm3大小的洞腔，胚胎脊髓供体为同种异体妊娠14d的大鼠，在麻醉和无菌条件下取出胎鼠，显微镜下仔细切取颈胸段胎鼠脊髓约2mm，尽可能将胚胎脊髓表面的软脊膜等结缔组织切除干净，然后用玻璃针头吸取移植物，注入预制的脊髓洞腔内，然后用9～0线缝合硬脊膜。肋间神经移植组在腹膜后靠近脊髓切取左侧T13肋间神经约1cm，剪成4～5段植入脊髓洞腔内，然后用9～0线缝合硬脊膜。大网膜移植组：取左上腹部纵切口，游离大网膜保留胃网膜左动脉，选择血管丰富脂肪较少的大网膜，将带蒂大网膜自左腰三角经皮下隧道转移到腰背部切口内，将大网膜末端植入脊髓洞腔内。然后用9～0线缝合硬脊膜，并将蒂与硬脊膜缝合固定，注意尽量保持大网膜血运。椎旁肌移植组：顺椎旁肌方向切取一段左侧带蒂的椎旁肌，同样将椎旁肌末端植入脊髓洞腔内，用9～0线缝合硬脊膜，并将肌蒂与硬脊膜缝合固定。
, 百拇医药
1.3 标本和组织切片的制作
手术后1，2，4，12周，每组麻醉5只受体大鼠，开胸暴露心脏，经左心室—主动脉插管，灌注生理盐水200ml，然后灌注4%多聚甲醛200ml。灌注固定2h后，取出移植部位及其头尾侧各3个节段的脊髓，投入相同固定液中再继续固定24h，修剪后石蜡包埋切片，HE,Nissl，嗜银染色，每个标本损伤区和头尾侧各取一张切片，光镜下观察。常规电镜标本制作用3%戊二醛后固定，镜下修出移植物，常规电镜制片，JEN-100SX电镜观察。
2 结 果
2.1 胚胎脊髓移植组
妊娠14d时胎鼠脊髓主要有梭形或矮柱状神经上皮细胞构成，在腹侧套层内，也可见到核大而浅染的神经母细胞，把此时的胎鼠脊髓植入损伤的成体脊髓后1周，光镜下见移植组织存活良好，移植组织结构较松散，内有大量的成神经细胞，其体积普遍小于成鼠神经元，成神经细胞胞质少，着色深。电镜下成神经细胞紧密相连，核仁不明显，异染色质丰富，胞浆内细胞器较少。术后2周光镜下移植组织结构与1周时基本相似，但成神经细胞减少，神经母细胞开始分化增多，出现核分裂相，电镜下见神经母细胞质内有丰富的粗面内质网和线立体等细胞器。术后4周移植物部分神经元体积增大，电镜下见神经细胞突起延长，并与其他神经细胞形成联系。移植后12周移植物体积增大，有少量神经细胞形态接近正常脊髓前角神经元(图1)，移植物与宿主脊髓有部分纤维交错(图2)，电镜下见部分神经细胞已发育成熟，并与其他神经细胞形成突触联系(图3)。
, 百拇医药
2.2 肋间神经移植组
术后1周，光镜下见肋间神经在脊髓内存活良好，移植组织和宿主脊髓组织有较多的胶质细胞。电镜下见肋间神经存活，但神经髓鞘变性。术后2周，光、电镜检查结果与1周时相同，但胶质细胞明显减少。术后4周，光镜检查与2周相同，电镜下可见存活的雪旺氏细胞。术后12周，肋间神经与脊髓形成部分纤维连接，电镜下见存活的雪旺氏细胞包裹的轴突有髓鞘形成(图4)。
2.3 带蒂的大网膜移植组
术后1周，光镜下见大网膜血管长入宿主脊髓，脊髓内有胶质细胞增生，电镜下见有大量新生的血管(图5)，脊髓髓鞘变性。术后2周，光、电镜检查同前。术后4周，脊髓内胶质细胞减少，移植物长入脊髓的血管数量增多，直径变大。术后12周，大网膜与脊髓已形成较好的血管联系，电镜下见变性的髓鞘已恢复正常。
2.4 带蒂的椎旁肌移植组
, http://www.100md.com
术后1周，光镜观察见移植的肌肉组织存活，肌组织结构清楚，有少量的血管长入宿主脊髓内，损伤脊髓内有较多的胶质细胞增生。电镜下见肌肉组织形态正常，有清楚的明暗带结构。术后4周，光镜下见肌肉组织结构不清，部分肌肉组织纤维化变性(图6)，长入脊髓的血管萎缩。电镜下见部分肌肉结构紊乱，成纤维细胞增生。移植后12周，光镜下变化同前，电镜下见肌原纤维明暗带结构消失纤维变性。
3 讨 论
不同的组织移植能直接或间接促进损伤后脊髓的修复，已有许多报道[1，3]。但对这些组织进行移植后病理比较研究尚无见系统报道，我们的实验结果表明低分化的胚胎脊髓移植不仅可以在宿主脊髓内存活、发育、分化，而且能够与宿主脊髓达到良好的整合，互相投射部分神经纤维，并建立一些神经通路联系。肋间神经移植可以在宿主脊髓内存活并形成一些神经纤维联系，但数量较少，组织学观察未见到神经元样神经细胞，而且对脊髓的修复较差。带蒂的大网膜移植，可以与宿主脊髓形成血管联系，但不能形成神经细胞修复损伤的脊髓。带蒂的椎旁肌移植后，2周前与宿主脊髓可以形成少量的血管联系，但随着时间的延长，可能是由于缺少血运，肌肉组织萎缩变性，血管挛缩，对宿主脊髓修复无益。因此我们认为如果提供血运的大网膜与胚胎神经组织联合移植，可能为损伤脊髓的修复提供更好的环境，有益于损伤脊髓的修复。
, http://www.100md.com
图1 胚胎脊髓移植12周，少量成神经细胞发育成成熟的神经元，Nissl染色×200 图2 胚胎脊髓移植12周，移植物和宿主脊髓有少量纤维交错，嗜银染色×200 图3 胚胎脊髓移植12周，电镜下见突触形成×12 000 图4 肋间神经移植12周，电镜下见髓鞘再生良好×12 000 图5 带蒂大网膜移植2周，电镜下见新生的血管×12 000 图6 带蒂椎旁肌移植4周，移植肌肉出现纤维化变性，HE染色×200
本课题为全军医学重点实验室资助项目，编号97015
作者简介：张 强(1963-)，男，山东济宁人，主治医师，医学博士，作者单位：张强(解放军第88医院全军骨科中心，山东泰安 271000)
廖维宏(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
王正国(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
, 百拇医药
伍亚民(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
李应玉(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
陈恒胜(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
研究方向：脊柱外科。电话：(0538)6213002-39307
参考文献：
〔1〕 Zompa EA,Cain LD,Everhart AW,et al.Transplant therapy:Recovery of function after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,1997,14(8):479～506.
〔2〕 胥少汀.关于带血运组织移植覆盖于脊髓[J].中华骨科杂志，1997，5：283～283.
〔3〕 Cheng H,Yihai D.Spinal cord repair in adult paraplegic rat:partial restoration of hind limb function[J].Science,1996,273:510～513.
〔4〕 赵文汝，张振伟，周庆芬，等.带蒂骶棘肌脊髓移植后移植肌瓣的组织学观察[J].中国脊髓柱脊髓杂志，1995，3(5)：209～210., http://www.100md.com
张强 廖维宏 王正国 伍亚民 李应玉 陈恒胜
摘 要 目的：研究胚胎脊髓，肋间神经，大网膜，椎旁肌移植到宿主脊髓后发育过程中形态变化。方法：应用脊髓半切洞模型，移植后1，2，4，12周，进行HE、Nissl、嗜银染色和电镜检查，观察移植物存活、分化及其与宿主之间的关系。结果：胚胎脊髓移植到损伤的脊髓后，可在宿主脊髓内继续分化发育，与宿主脊髓形成部分纤维连接；肋间神经移植后，可能通过存活的雪旺氏细胞与宿主脊髓建立一定的结构联系；带蒂的大网膜移植后，可与宿主脊髓 形成血管连接；带蒂的椎旁肌移植最终形成瘢痕组织。结论：胚胎脊髓组织能较好地修复损伤的脊髓。
, 百拇医药
关键词：脊髓损伤；移植；胚胎脊髓；肋间神经；大网膜；椎旁肌
组织移植治疗脊髓损伤的研究已开展多年[1～3]，但以往的研究主要集中在提高移植物存活率，选择合适的移植物，促进功能恢复等方面。而对于移植物在宿主体内的形态发育过程及其与宿主脊髓间连接情况，尚未见较系统的报道。本实验选用了目前常用的胚胎脊髓，肋间神经，带蒂的大网膜，椎旁肌移植到宿主脊髓，观察其在宿主脊髓内发育过程中的形态变化。
1 材料与方法
1.1 动物分组
Wistar 成年大鼠，体重180～250g，雌雄不拘，每个时相点每组6只动物，共96只大鼠。采用大鼠脊髓半切洞损伤，随机将动物分为，A组：损伤+胚胎脊髓组；B组：损伤+肋间神经组；C组：损伤+大网膜组；D组：损伤+椎旁肌组。手术后1，2，4，12周，应用光、电镜观察移植物在大鼠损伤脊髓的形态变化。
, 百拇医药
1.2 手术方法
用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大，用负压吸引的方法损毁并吸除腰膨大左侧半脊髓，造成一约2×2×2mm3大小的洞腔，胚胎脊髓供体为同种异体妊娠14d的大鼠，在麻醉和无菌条件下取出胎鼠，显微镜下仔细切取颈胸段胎鼠脊髓约2mm，尽可能将胚胎脊髓表面的软脊膜等结缔组织切除干净，然后用玻璃针头吸取移植物，注入预制的脊髓洞腔内，然后用9～0线缝合硬脊膜。肋间神经移植组在腹膜后靠近脊髓切取左侧T13肋间神经约1cm，剪成4～5段植入脊髓洞腔内，然后用9～0线缝合硬脊膜。大网膜移植组：取左上腹部纵切口，游离大网膜保留胃网膜左动脉，选择血管丰富脂肪较少的大网膜，将带蒂大网膜自左腰三角经皮下隧道转移到腰背部切口内，将大网膜末端植入脊髓洞腔内。然后用9～0线缝合硬脊膜，并将蒂与硬脊膜缝合固定，注意尽量保持大网膜血运。椎旁肌移植组：顺椎旁肌方向切取一段左侧带蒂的椎旁肌，同样将椎旁肌末端植入脊髓洞腔内，用9～0线缝合硬脊膜，并将肌蒂与硬脊膜缝合固定。
, 百拇医药
1.3 标本和组织切片的制作
手术后1，2，4，12周，每组麻醉5只受体大鼠，开胸暴露心脏，经左心室—主动脉插管，灌注生理盐水200ml，然后灌注4%多聚甲醛200ml。灌注固定2h后，取出移植部位及其头尾侧各3个节段的脊髓，投入相同固定液中再继续固定24h，修剪后石蜡包埋切片，HE,Nissl，嗜银染色，每个标本损伤区和头尾侧各取一张切片，光镜下观察。常规电镜标本制作用3%戊二醛后固定，镜下修出移植物，常规电镜制片，JEN-100SX电镜观察。
2 结 果
2.1 胚胎脊髓移植组
妊娠14d时胎鼠脊髓主要有梭形或矮柱状神经上皮细胞构成，在腹侧套层内，也可见到核大而浅染的神经母细胞，把此时的胎鼠脊髓植入损伤的成体脊髓后1周，光镜下见移植组织存活良好，移植组织结构较松散，内有大量的成神经细胞，其体积普遍小于成鼠神经元，成神经细胞胞质少，着色深。电镜下成神经细胞紧密相连，核仁不明显，异染色质丰富，胞浆内细胞器较少。术后2周光镜下移植组织结构与1周时基本相似，但成神经细胞减少，神经母细胞开始分化增多，出现核分裂相，电镜下见神经母细胞质内有丰富的粗面内质网和线立体等细胞器。术后4周移植物部分神经元体积增大，电镜下见神经细胞突起延长，并与其他神经细胞形成联系。移植后12周移植物体积增大，有少量神经细胞形态接近正常脊髓前角神经元(图1)，移植物与宿主脊髓有部分纤维交错(图2)，电镜下见部分神经细胞已发育成熟，并与其他神经细胞形成突触联系(图3)。
, 百拇医药
2.2 肋间神经移植组
术后1周，光镜下见肋间神经在脊髓内存活良好，移植组织和宿主脊髓组织有较多的胶质细胞。电镜下见肋间神经存活，但神经髓鞘变性。术后2周，光、电镜检查结果与1周时相同，但胶质细胞明显减少。术后4周，光镜检查与2周相同，电镜下可见存活的雪旺氏细胞。术后12周，肋间神经与脊髓形成部分纤维连接，电镜下见存活的雪旺氏细胞包裹的轴突有髓鞘形成(图4)。
2.3 带蒂的大网膜移植组
术后1周，光镜下见大网膜血管长入宿主脊髓，脊髓内有胶质细胞增生，电镜下见有大量新生的血管(图5)，脊髓髓鞘变性。术后2周，光、电镜检查同前。术后4周，脊髓内胶质细胞减少，移植物长入脊髓的血管数量增多，直径变大。术后12周，大网膜与脊髓已形成较好的血管联系，电镜下见变性的髓鞘已恢复正常。
2.4 带蒂的椎旁肌移植组
, http://www.100md.com
术后1周，光镜观察见移植的肌肉组织存活，肌组织结构清楚，有少量的血管长入宿主脊髓内，损伤脊髓内有较多的胶质细胞增生。电镜下见肌肉组织形态正常，有清楚的明暗带结构。术后4周，光镜下见肌肉组织结构不清，部分肌肉组织纤维化变性(图6)，长入脊髓的血管萎缩。电镜下见部分肌肉结构紊乱，成纤维细胞增生。移植后12周，光镜下变化同前，电镜下见肌原纤维明暗带结构消失纤维变性。
3 讨 论
不同的组织移植能直接或间接促进损伤后脊髓的修复，已有许多报道[1，3]。但对这些组织进行移植后病理比较研究尚无见系统报道，我们的实验结果表明低分化的胚胎脊髓移植不仅可以在宿主脊髓内存活、发育、分化，而且能够与宿主脊髓达到良好的整合，互相投射部分神经纤维，并建立一些神经通路联系。肋间神经移植可以在宿主脊髓内存活并形成一些神经纤维联系，但数量较少，组织学观察未见到神经元样神经细胞，而且对脊髓的修复较差。带蒂的大网膜移植，可以与宿主脊髓形成血管联系，但不能形成神经细胞修复损伤的脊髓。带蒂的椎旁肌移植后，2周前与宿主脊髓可以形成少量的血管联系，但随着时间的延长，可能是由于缺少血运，肌肉组织萎缩变性，血管挛缩，对宿主脊髓修复无益。因此我们认为如果提供血运的大网膜与胚胎神经组织联合移植，可能为损伤脊髓的修复提供更好的环境，有益于损伤脊髓的修复。
, http://www.100md.com
图1 胚胎脊髓移植12周，少量成神经细胞发育成成熟的神经元，Nissl染色×200 图2 胚胎脊髓移植12周，移植物和宿主脊髓有少量纤维交错，嗜银染色×200 图3 胚胎脊髓移植12周，电镜下见突触形成×12 000 图4 肋间神经移植12周，电镜下见髓鞘再生良好×12 000 图5 带蒂大网膜移植2周，电镜下见新生的血管×12 000 图6 带蒂椎旁肌移植4周，移植肌肉出现纤维化变性，HE染色×200
本课题为全军医学重点实验室资助项目，编号97015
作者简介：张 强(1963-)，男，山东济宁人，主治医师，医学博士，作者单位：张强(解放军第88医院全军骨科中心，山东泰安 271000)
廖维宏(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
王正国(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
, 百拇医药
伍亚民(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
李应玉(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
陈恒胜(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所)
研究方向：脊柱外科。电话：(0538)6213002-39307
参考文献：
〔1〕 Zompa EA,Cain LD,Everhart AW,et al.Transplant therapy:Recovery of function after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,1997,14(8):479～506.
〔2〕 胥少汀.关于带血运组织移植覆盖于脊髓[J].中华骨科杂志，1997，5：283～283.
〔3〕 Cheng H,Yihai D.Spinal cord repair in adult paraplegic rat:partial restoration of hind limb function[J].Science,1996,273:510～513.
〔4〕 赵文汝，张振伟，周庆芬，等.带蒂骶棘肌脊髓移植后移植肌瓣的组织学观察[J].中国脊髓柱脊髓杂志，1995，3(5)：209～210., http://www.100md.com