碱性成纤维细胞生长因子对兔自体穿透性角膜移植伤口愈合的影响
碱性成纤维细胞生长因子对兔自体穿透性角膜移植伤口愈合的影响
戴超 刘翔
摘 要 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对穿透角膜移植(PKP)伤口愈合的影响。 方法 12只白色家兔的24只眼采用分层随机方法分为6个组，利用兔自体PKP动物模型，采用临床常用的角膜病给药方法——点眼，通过对伤口愈合强度测定、3H-TdR掺入液闪计数和AgNORs、VG和HE染色以及透射电镜等方法，观察bFGF对PKP术后伤口愈合速度、强度及其质量的影响。 结果 bFGF能增强PKP术后伤口愈合的强度，早期增加伤口处成纤维细胞的数量，增加伤口愈合时3H-TdR的掺入率，使伤口愈合时成纤维细胞及其分泌的胶原纤维呈比较规则的排列。 结论 bFGF能促进PKP术后伤口的愈合，改善伤口愈合的质量。
, 百拇医药
关键词：成纤维细胞生长因子；角膜移植，穿透性；伤口愈合
穿透性角膜移植术(PKP)后伤口愈合拆线时间一般比较长，而长时间的角膜缝线可刺激角膜新生血管长入以及诱发免疫排斥反应而导致角膜植片混浊。因此，如何缩短PKP术后伤口的愈合时间，尽早拆线，是提高PKP手术成功率的关键所在。PKP术后伤口的愈合主要受手术技巧、角膜伤口的对合及术后用药的影响，笔者着重探讨bFGF 点眼对PKP术后伤口愈合的影响。
材料与方法
1. 动物与主要试剂：(1)新西兰白兔，体重2.0～2.5 kg，本院动物室提供。(2)重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)由珠海东大生物制药有限公司提供。(3)3H-脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)购自北京原子能研究所。
2. 自体穿透性角膜移植动物模型的制备：用质量浓度为10 g/L的戊巴比妥钠对兔行耳缘静脉注射麻醉(1 ml/kg体重)，行常规PKP手术，角膜植片和植床均为直径6 mm，角膜植片旋转180°后用10-0进口尼龙线连续缝合，每象限4～6针。待动物清醒后送回动物房专人颗粒饲料喂养。一眼术后3～13 d再行另一只眼手术。
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3. 动物分组：12只新西兰白色家兔，随机分为bFGF治疗和对照2个组，每组6只12眼，各组再随机分到8，14，21 d 3个时相点取材观察。
4. 点眼：术后第1天开始点眼，对照组用等渗盐水，bFGF组用2 400 AU/ml的bFGF 3次/d；另外，在14， 21 d时相点取材者同时用3H-TdR 370 kBq/ml点眼3次/d，共14 d。每种药物均每次只滴约50 μl。
5. 测压：将拆线后的兔俯卧于测压台上，用一次性输液器的针头在距角巩缘后3～5 mm处刺入眼球，并将针头从玻璃体经晶体插入前房，打开三通，然后打开自动抽注机向眼球内匀速注水，直至伤口裂开并压力表的压力不再增加而是突然下降时，记录最高的压力值(在测14 d组和21 d组时先将压力表的压力调到20 kPa)。
6. 角膜取材送检：在距角膜伤口2 mm处剪去周边角膜，将中央带伤口的角膜取1/2置于清洁的青霉素瓶内作液闪计数用，另1/2在伤口处剪出约1 mm×1 mm，用质量浓度为30 g/L的冷戊二醛固定，剩余部分用体积分数为10%的甲醛固定。所有标本均置4℃冰箱保存待用。
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7. 3 H-TdR掺入液闪计数：将取下的1/2角膜分别称重、匀浆、液闪计数。
8. 透射电镜观察：常规固定、脱水、包埋透射电镜下观察角膜伤口各层的超微结构。
9. 光镜观察：常规脱水、包埋、石蜡切片，行HE、VG和AgNORs染色，光学显微镜观察并照相，对AgNORs染色切片行成纤维细胞计数(伤口处随机选5个视野，ⅹ1 000)，每组4张切片共20个视野，取其平均数行统计学处理。
10. 统计学处理方法：数据以±s表示，采用SPLM软件包行多因素方差分析。
结 果
一、兔自体PKP术后伤口愈合强度的测量
bFGF点眼组与对照组比较，在术后8，14，21 d差异均有非常显著性意义(P<0.01)。见表1。
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二、3H-TdR掺入液闪计数
bFGF组与对照组比较在术后14，21 d差异有非常显著性意义(P<0.01)；术后14 d与21 d两组的前后比较差异无显著性意义(P>0.05)。见表2。
三、AgNOs染色成纤维细胞计数
术后8，14 d bFGF组与对照组比较差异有非常显著性意义(P<0.01)。术后21 d，两组间差异无显著性意义(P>0.05)。术后14 d与术后21 d比较：对照组差异有非常显著性意义(P<0.01)；而bFGF组差异无显著性意义(P>0.05)。见表3。
四、PKP术后的形态学观察
1. PKP术后测压时伤口裂开的形态：在术后8 d，各组伤口裂开均为超过180°的大裂口；术后14 d，bFGF组伤口裂开的范围小于180°，而对照组伤口裂开的范围仍超过180°；到术后21 d，bFGF组伤口裂开均小于90°，且bFGF组的1只眼在角巩缘处破裂而伤口处尚未裂开，而对照组4只眼伤口裂开均大于90°，其中2只眼裂开大于180°。
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2. VG染色：术后14，21 d见bFGF组伤口处的胶原纤维量较对照组多，伤口处新生的胶原纤维排列较为规则，而对照组排列较紊乱。
3. AgNORs染色：在术后8，14 d见bFGF组伤口处成纤维细胞较多，见成纤维细胞及其所分泌的胶原排列较规则，对照组排列紊乱。
4. 透射电镜观察：术后8，14 d均可见成纤维细胞核内染色质颗粒较多，线粒体多、体积大，粗面内质网多，核糖体密集，术后21 d，bFGF组见线粒体和粗面内质网均减少，而对照组的线粒体和粗面内质网仍多；另外，bFGF组可见胶原纤维排列较为丰富规则，对照组相对较少且排列紊乱。
表1 PKP术后伤口愈合强度的变化(kPa, ±s)
组别
术后8 d
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术后14 d
术后21 d
对照组
24.13±2.32(4)
53.88±2.95(4)△△
94.75±5.24(4)△△▲▲
bFGF组
36.50±3.19(4)**
122.66±19.98(4)**△△
250.00±23.45(4)**△△▲▲
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注：括号内数字为眼数。与对照组比较：**P<0.01； 与术后8 d比较：△△P<0.01； 术后21 d与14 d比较：▲▲P<0.01表2 PKP术后14，21 d 3 H-TdR掺入率(脉冲/mg， ±s)
组别
术后14 d
术后21 d
对照组
80.00±16.99(4)
85.25±15.44(4)
bFGF组
189.50±11.73(4)**
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194.50±11.82(4)**
注：括号内数字为眼数。与对照组比较：**P<0.01
讨 论
一、关于伤口愈合强度的测量
胡敏等[1]曾采用血压计打气球向前房注气加压的方法，测定角膜伤口所承受压力的极限值。该方法为脉冲式加压，且向前房所注空气除本身压力外，还有气泡向上浮的冲击力量。笔者采用自制的测压装置，应用匀速抽注机匀速地给前房注入林格液，使眼压匀速升高，防止了脉冲式加压产生的冲量和空气泡对角膜伤口的影响。因此，所测压力更接近于角膜伤口所能承受的真实压力，且前房所注林格液能减轻测压过程对角膜内皮的影响，以便以后的形态学观察。
表3 AgNORs染色成纤维细胞计数和对数代换值(±s)
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组别
术后8 d
术后14 d
术后21 d
对照组
3.75±2.10(1.19±0.51)[4]
11.55±5.53(2.33±0.50)[4]△△
29.50±12.17(3.30±0.41)[4]△△▲▲
bFGF组
12.35±7.53(2.34±0.62)[4]**
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32.25±15.36(3.34±0.56)[4]**△△
31.40±11.81(3.37±0.42)[4]△△
注：经方差齐性检验方差不齐，圆括号内数字为对数代换值，方括号内数字为眼数。 与对照组比较：**P<0.01； 与术后8 d比较：△△P<0.01； 术后21 d与14 d比较：▲▲P<0.01
二、bFGF对PKP术后伤口愈合的影响
bFGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞有促有丝分裂作用。体外实验表明，0.1～1 ng/ml的bFGF可明显地刺激成纤维细胞、内皮细胞等的增殖，同时又是一种趋化因子，对晶体纤维细胞、内皮细胞、成纤维细胞和星形胶质细胞均有趋化作用[2]。bFGF作为角膜组织的正常生理成分，在正常角膜组织全层中都有分布，正常状态下主要以无或低活性形态存在于细胞间质中[3]。角膜损伤后伤口处bFGF表达增强[2，4]，可通过自分泌和旁分泌方式影响角膜损伤的修复[5]。bFGF在细胞培养、器官培养中均证实能有效地促进角膜上皮再生，改善角膜愈合质量[6]。bFGF能促进角膜内皮的损伤修复，缩短角膜内皮损伤区闭合时间，提高角膜内皮细胞的密度，加速角膜内皮细胞功能的恢复[7]。bFGF还能促进角膜损伤后基质的修复，降低炎症反应的程度，改善修复质量，维持角膜透明[6]。笔者发现，bFGF在术后早期(术后8 d)即能明显地增加伤口愈合的强度，并且bFGF点眼组伤口的抗张力强度随时间的延长迅速升高，到术后21 d几乎达到正常角膜抗张力强度。通过AgNORs染色成纤维细胞计数发现，bFGF点眼在术后8 d能明显地增加伤口处成纤维细胞的数量，在术后14 d与21 d比较差异无显著性意义，提示在术后14 d伤口处成纤维细胞的数量已迅速地达到高峰。bFGF点眼能显著增加术后14 d和21 d 3 H-TdR在角膜伤口愈合的掺入率，提示bFGF能增加PKP术后伤口愈合所必需的DNA的合成，同时增加PKP术后伤口愈合时蛋白质的合成。在术后14 d和21 d， bFGF点眼组的 3H-TdR掺入率差异无显著性意义，这可能与 3H-TdR点眼均只维持了14 d，而14 d以后伤口愈合仍在继续进行，而无新的 3H-TdR掺入有关。通过对各组VG和AgNOs染色的形态学观察，发现bFGF组成纤维细胞的分布排列及其产生胶原的排列更接近于正常的角膜原板层，而对照组排列紊乱。这是由于bFGF能稳定细胞表型的表达和调节细胞间质(胶原和纤维连接蛋白)的合成及分布，使修复的细胞在形态和排列上趋于正常，这也是bFGF促分化作用的一种表现。作者单位：戴超(400037，重庆，第三军医大学附属新桥医院眼科)
, 百拇医药
刘翔(400037，重庆，第三军医大学附属新桥医院眼科)
参考文献
1，胡敏，徐锦堂，郑通枢.bFGF胶原罩对兔角膜穿通伤的影响.眼科， 1995，4：228-232.
2，Andresen JL,Ehlers N. Chemotaxis of human keratocytes is increased by platelet-derived growth factor-BB, epidermal growth factor,transforming growth factor-α,acidic fibroblast growth factor,insulin-like growth factor-I,and transforming growth factor-β. Curr Eye Res,1998,17:79-87.
, http://www.100md.com
3，Wilson SE， Lloyd SA， He YG. Fibroblast growth factor-1 receptor messenger RNA expression in corneal cells. Cornea， 1993，12:249-254.
4，Faktorovich EG, Badawi DY, Maloney RK, et al. Growth factor expression in corneal wound healing after excimer laser keratectomy.Cornea， 1999,18:580-588.
5，Nakamura M, Nishida T. Differential effects of epidermal growth factor and interleukin-6 on corneal epithelial cells and vascular endothelial cells. Cornea， 1999,18:452-458.
, 百拇医药
6，David T, Rieck P, Renard G, et al.Corneal wound healing modulation using basic fibroblast growth factor after excimer laser photorefractive keratectomy. Cornea， 1995,14:227-234.
7，Hoppenreijs VP, Pels E, Vrensen GE, et al.Basic fibroblast growth factor stimulates corneal endothial cell growth endothial wound healing of human corneas. Invest Ophthalmal Vis Sci, 1994,35:931-944., 百拇医药
戴超 刘翔
摘 要 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对穿透角膜移植(PKP)伤口愈合的影响。 方法 12只白色家兔的24只眼采用分层随机方法分为6个组，利用兔自体PKP动物模型，采用临床常用的角膜病给药方法——点眼，通过对伤口愈合强度测定、3H-TdR掺入液闪计数和AgNORs、VG和HE染色以及透射电镜等方法，观察bFGF对PKP术后伤口愈合速度、强度及其质量的影响。 结果 bFGF能增强PKP术后伤口愈合的强度，早期增加伤口处成纤维细胞的数量，增加伤口愈合时3H-TdR的掺入率，使伤口愈合时成纤维细胞及其分泌的胶原纤维呈比较规则的排列。 结论 bFGF能促进PKP术后伤口的愈合，改善伤口愈合的质量。
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关键词：成纤维细胞生长因子；角膜移植，穿透性；伤口愈合
穿透性角膜移植术(PKP)后伤口愈合拆线时间一般比较长，而长时间的角膜缝线可刺激角膜新生血管长入以及诱发免疫排斥反应而导致角膜植片混浊。因此，如何缩短PKP术后伤口的愈合时间，尽早拆线，是提高PKP手术成功率的关键所在。PKP术后伤口的愈合主要受手术技巧、角膜伤口的对合及术后用药的影响，笔者着重探讨bFGF 点眼对PKP术后伤口愈合的影响。
材料与方法
1. 动物与主要试剂：(1)新西兰白兔，体重2.0～2.5 kg，本院动物室提供。(2)重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)由珠海东大生物制药有限公司提供。(3)3H-脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)购自北京原子能研究所。
2. 自体穿透性角膜移植动物模型的制备：用质量浓度为10 g/L的戊巴比妥钠对兔行耳缘静脉注射麻醉(1 ml/kg体重)，行常规PKP手术，角膜植片和植床均为直径6 mm，角膜植片旋转180°后用10-0进口尼龙线连续缝合，每象限4～6针。待动物清醒后送回动物房专人颗粒饲料喂养。一眼术后3～13 d再行另一只眼手术。
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3. 动物分组：12只新西兰白色家兔，随机分为bFGF治疗和对照2个组，每组6只12眼，各组再随机分到8，14，21 d 3个时相点取材观察。
4. 点眼：术后第1天开始点眼，对照组用等渗盐水，bFGF组用2 400 AU/ml的bFGF 3次/d；另外，在14， 21 d时相点取材者同时用3H-TdR 370 kBq/ml点眼3次/d，共14 d。每种药物均每次只滴约50 μl。
5. 测压：将拆线后的兔俯卧于测压台上，用一次性输液器的针头在距角巩缘后3～5 mm处刺入眼球，并将针头从玻璃体经晶体插入前房，打开三通，然后打开自动抽注机向眼球内匀速注水，直至伤口裂开并压力表的压力不再增加而是突然下降时，记录最高的压力值(在测14 d组和21 d组时先将压力表的压力调到20 kPa)。
6. 角膜取材送检：在距角膜伤口2 mm处剪去周边角膜，将中央带伤口的角膜取1/2置于清洁的青霉素瓶内作液闪计数用，另1/2在伤口处剪出约1 mm×1 mm，用质量浓度为30 g/L的冷戊二醛固定，剩余部分用体积分数为10%的甲醛固定。所有标本均置4℃冰箱保存待用。
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7. 3 H-TdR掺入液闪计数：将取下的1/2角膜分别称重、匀浆、液闪计数。
8. 透射电镜观察：常规固定、脱水、包埋透射电镜下观察角膜伤口各层的超微结构。
9. 光镜观察：常规脱水、包埋、石蜡切片，行HE、VG和AgNORs染色，光学显微镜观察并照相，对AgNORs染色切片行成纤维细胞计数(伤口处随机选5个视野，ⅹ1 000)，每组4张切片共20个视野，取其平均数行统计学处理。
10. 统计学处理方法：数据以±s表示，采用SPLM软件包行多因素方差分析。
结 果
一、兔自体PKP术后伤口愈合强度的测量
bFGF点眼组与对照组比较，在术后8，14，21 d差异均有非常显著性意义(P<0.01)。见表1。
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二、3H-TdR掺入液闪计数
bFGF组与对照组比较在术后14，21 d差异有非常显著性意义(P<0.01)；术后14 d与21 d两组的前后比较差异无显著性意义(P>0.05)。见表2。
三、AgNOs染色成纤维细胞计数
术后8，14 d bFGF组与对照组比较差异有非常显著性意义(P<0.01)。术后21 d，两组间差异无显著性意义(P>0.05)。术后14 d与术后21 d比较：对照组差异有非常显著性意义(P<0.01)；而bFGF组差异无显著性意义(P>0.05)。见表3。
四、PKP术后的形态学观察
1. PKP术后测压时伤口裂开的形态：在术后8 d，各组伤口裂开均为超过180°的大裂口；术后14 d，bFGF组伤口裂开的范围小于180°，而对照组伤口裂开的范围仍超过180°；到术后21 d，bFGF组伤口裂开均小于90°，且bFGF组的1只眼在角巩缘处破裂而伤口处尚未裂开，而对照组4只眼伤口裂开均大于90°，其中2只眼裂开大于180°。
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2. VG染色：术后14，21 d见bFGF组伤口处的胶原纤维量较对照组多，伤口处新生的胶原纤维排列较为规则，而对照组排列较紊乱。
3. AgNORs染色：在术后8，14 d见bFGF组伤口处成纤维细胞较多，见成纤维细胞及其所分泌的胶原排列较规则，对照组排列紊乱。
4. 透射电镜观察：术后8，14 d均可见成纤维细胞核内染色质颗粒较多，线粒体多、体积大，粗面内质网多，核糖体密集，术后21 d，bFGF组见线粒体和粗面内质网均减少，而对照组的线粒体和粗面内质网仍多；另外，bFGF组可见胶原纤维排列较为丰富规则，对照组相对较少且排列紊乱。
表1 PKP术后伤口愈合强度的变化(kPa, ±s)
组别
术后8 d
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术后14 d
术后21 d
对照组
24.13±2.32(4)
53.88±2.95(4)△△
94.75±5.24(4)△△▲▲
bFGF组
36.50±3.19(4)**
122.66±19.98(4)**△△
250.00±23.45(4)**△△▲▲
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注：括号内数字为眼数。与对照组比较：**P<0.01； 与术后8 d比较：△△P<0.01； 术后21 d与14 d比较：▲▲P<0.01表2 PKP术后14，21 d 3 H-TdR掺入率(脉冲/mg， ±s)
组别
术后14 d
术后21 d
对照组
80.00±16.99(4)
85.25±15.44(4)
bFGF组
189.50±11.73(4)**
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194.50±11.82(4)**
注：括号内数字为眼数。与对照组比较：**P<0.01
讨 论
一、关于伤口愈合强度的测量
胡敏等[1]曾采用血压计打气球向前房注气加压的方法，测定角膜伤口所承受压力的极限值。该方法为脉冲式加压，且向前房所注空气除本身压力外，还有气泡向上浮的冲击力量。笔者采用自制的测压装置，应用匀速抽注机匀速地给前房注入林格液，使眼压匀速升高，防止了脉冲式加压产生的冲量和空气泡对角膜伤口的影响。因此，所测压力更接近于角膜伤口所能承受的真实压力，且前房所注林格液能减轻测压过程对角膜内皮的影响，以便以后的形态学观察。
表3 AgNORs染色成纤维细胞计数和对数代换值(±s)
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组别
术后8 d
术后14 d
术后21 d
对照组
3.75±2.10(1.19±0.51)[4]
11.55±5.53(2.33±0.50)[4]△△
29.50±12.17(3.30±0.41)[4]△△▲▲
bFGF组
12.35±7.53(2.34±0.62)[4]**
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32.25±15.36(3.34±0.56)[4]**△△
31.40±11.81(3.37±0.42)[4]△△
注：经方差齐性检验方差不齐，圆括号内数字为对数代换值，方括号内数字为眼数。 与对照组比较：**P<0.01； 与术后8 d比较：△△P<0.01； 术后21 d与14 d比较：▲▲P<0.01
二、bFGF对PKP术后伤口愈合的影响
bFGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞有促有丝分裂作用。体外实验表明，0.1～1 ng/ml的bFGF可明显地刺激成纤维细胞、内皮细胞等的增殖，同时又是一种趋化因子，对晶体纤维细胞、内皮细胞、成纤维细胞和星形胶质细胞均有趋化作用[2]。bFGF作为角膜组织的正常生理成分，在正常角膜组织全层中都有分布，正常状态下主要以无或低活性形态存在于细胞间质中[3]。角膜损伤后伤口处bFGF表达增强[2，4]，可通过自分泌和旁分泌方式影响角膜损伤的修复[5]。bFGF在细胞培养、器官培养中均证实能有效地促进角膜上皮再生，改善角膜愈合质量[6]。bFGF能促进角膜内皮的损伤修复，缩短角膜内皮损伤区闭合时间，提高角膜内皮细胞的密度，加速角膜内皮细胞功能的恢复[7]。bFGF还能促进角膜损伤后基质的修复，降低炎症反应的程度，改善修复质量，维持角膜透明[6]。笔者发现，bFGF在术后早期(术后8 d)即能明显地增加伤口愈合的强度，并且bFGF点眼组伤口的抗张力强度随时间的延长迅速升高，到术后21 d几乎达到正常角膜抗张力强度。通过AgNORs染色成纤维细胞计数发现，bFGF点眼在术后8 d能明显地增加伤口处成纤维细胞的数量，在术后14 d与21 d比较差异无显著性意义，提示在术后14 d伤口处成纤维细胞的数量已迅速地达到高峰。bFGF点眼能显著增加术后14 d和21 d 3 H-TdR在角膜伤口愈合的掺入率，提示bFGF能增加PKP术后伤口愈合所必需的DNA的合成，同时增加PKP术后伤口愈合时蛋白质的合成。在术后14 d和21 d， bFGF点眼组的 3H-TdR掺入率差异无显著性意义，这可能与 3H-TdR点眼均只维持了14 d，而14 d以后伤口愈合仍在继续进行，而无新的 3H-TdR掺入有关。通过对各组VG和AgNOs染色的形态学观察，发现bFGF组成纤维细胞的分布排列及其产生胶原的排列更接近于正常的角膜原板层，而对照组排列紊乱。这是由于bFGF能稳定细胞表型的表达和调节细胞间质(胶原和纤维连接蛋白)的合成及分布，使修复的细胞在形态和排列上趋于正常，这也是bFGF促分化作用的一种表现。作者单位：戴超(400037，重庆，第三军医大学附属新桥医院眼科)
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刘翔(400037，重庆，第三军医大学附属新桥医院眼科)
参考文献
1，胡敏，徐锦堂，郑通枢.bFGF胶原罩对兔角膜穿通伤的影响.眼科， 1995，4：228-232.
2，Andresen JL,Ehlers N. Chemotaxis of human keratocytes is increased by platelet-derived growth factor-BB, epidermal growth factor,transforming growth factor-α,acidic fibroblast growth factor,insulin-like growth factor-I,and transforming growth factor-β. Curr Eye Res,1998,17:79-87.
, http://www.100md.com
3，Wilson SE， Lloyd SA， He YG. Fibroblast growth factor-1 receptor messenger RNA expression in corneal cells. Cornea， 1993，12:249-254.
4，Faktorovich EG, Badawi DY, Maloney RK, et al. Growth factor expression in corneal wound healing after excimer laser keratectomy.Cornea， 1999,18:580-588.
5，Nakamura M, Nishida T. Differential effects of epidermal growth factor and interleukin-6 on corneal epithelial cells and vascular endothelial cells. Cornea， 1999,18:452-458.
, 百拇医药
6，David T, Rieck P, Renard G, et al.Corneal wound healing modulation using basic fibroblast growth factor after excimer laser photorefractive keratectomy. Cornea， 1995,14:227-234.
7，Hoppenreijs VP, Pels E, Vrensen GE, et al.Basic fibroblast growth factor stimulates corneal endothial cell growth endothial wound healing of human corneas. Invest Ophthalmal Vis Sci, 1994,35:931-944., 百拇医药