氧化砷诱导食管癌细胞凋亡线粒体形态改变
沈忠英 沈健 陈铭华 李乔山 洪超群
摘 要 目的 通过研究食管癌细胞株SHEEC1细胞凋亡早期线粒体的形态改变和bcl-2、bax的表达，以了解三氧化二砷(As2O3)作用于食管癌细胞的机制。方法 食管癌细胞株SHEEC1用1、2、3 μmol/L As2O3作用2、4、6、12、24 h。用Annexin-V 荧光探针，流式细胞仪和DNA组方图检测早期凋亡细胞；光镜和电镜检测凋亡细胞的形态学改变；用罗达明(Rhodamin 123)荧光探针检查活细胞线粒体的改变；用免疫组织化学SP方法检查bcl-2和bax的表达。结果 SHEEC1细胞经As2O3作用24 h出现细胞凋亡的典型形态改变。4 h可用Annexin-V查出早期凋亡细胞。线粒体的超微结构改变如下：As2O3作用2～4 h内线粒体增生，伴有电子密度高物质出现在基质，是早期细胞损伤的现象。作用6 h线粒体进行性肿胀，12 h出现气球样外观，甚至外膜破裂。不同剂量皆引起损伤脱落细胞bcl-2表达下调和bax上调。结论 由As2O3诱导的SHEEC1细胞凋亡，线粒体形态改变是早期改变，细胞凋亡和bax表达上调及bcl-2表达下调有密切关系。
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关键词：食管肿瘤；脱噬作用；线粒体；原致癌基因蛋白质c-bcl-2；肿瘤细胞，培养的
近年来用三氧化二砷(As2O3)治疗急性白血病已引起人们的重视[1，2]。其治疗机制是诱导肿瘤细胞凋亡[3，4]。我们曾报道As2O3诱导食管癌细胞凋亡，主要表现在细胞核超微结构改变[5，6]。最近我们发现As2O3诱导食管癌细胞凋亡过程中线粒体的改变[7]。我们拟通过研究As2O3诱导细胞凋亡的早期改变，重点在线粒体的形态改变及bcl-2、bax的表达，以阐明As2O3引起食管癌细胞凋亡的作用点，并证实As2O3是一种线粒体毒性药物。
, 百拇医药
材料与方法
1.细胞系和用药方法：食管癌细胞系SHEEC1是我室用HPV18 E6E7和TPA 协同诱导胚胎食管上皮恶性转化细胞[8]，在M199培养基中加10%小牛血清培养传代。As2O3(Sigma公司产品， Lot A1010)用培养基配成1、2、3 μmol/L。用药方法：细胞培养在250 ml培养瓶和24孔塑料培养板(Corning 公司产品)，内置盖玻片，每孔接种细胞5×104个，分1、2、3 μmol/L 3浓度As2O3组及1组对照，在第2、4、6、12、24 h取标本检查。
2.透射电镜检查：收获细胞离心成团，2.5%戊二醛固定，常规电镜制样，日立H-300电镜检查。
3.流式细胞仪检查：DNA倍体测定按常规制样，碘化丙锭(propidium iodide ，PI)染色，检查细胞周期和凋亡峰。Annexin V 检测：取培养细胞106用PBS洗，200 r/min离心5 min。Annexin-V-Fluos标记试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，按试剂盒方法作活细胞染色。流式细胞仪(FACSort，B-D公司)检测。
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4.罗达明123 (Rhodamin123，Rho123)荧光探针标记：Rho123， MW 381 ，Molecular Probes公司产品。细胞在24孔板盖玻片上生长。1、2、3 μmol/L As2O3作用，定时取片，PBS洗涤，Rho123(10 μg/ml)染色，在37℃， 5% CO2培养箱温育30 min，PBS洗3次，在落射荧光显微镜(Nikon Fluophot)下检查，激发光505 nm，发射光534 nm。
5.免疫组织化学检查：用细胞离心机(Cytospin Ⅲ,美国Shandon 公司)收集脱落细胞，4%多聚甲醛固定。bcl-2、bax兔抗人多克隆抗体及SP免疫组织化学试剂盒(Santa Cruz公司产品)购自北京中山生物技术公司，按试剂盒操作方法，并设阳性和阴性对照。脱落细胞另作苏木素细胞核染色。
结果
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1.凋亡细胞的形态改变：SHEEC1加不同浓度As2O3后24 h均出现细胞凋亡，多数细胞核染色质凝集靠边呈典型凋亡细胞核改变(图1)。
2.细胞凋亡的指标：1 μmol/L As2O3作用早期凋亡细胞较少，As2O3 2 μmol/L作用4 h Annexin V显示早期凋亡细胞占7.1%。DNA组方图显示细胞凋亡峰，12 h凋亡细胞7.5%，24 h凋亡细胞 35.0%。3 μmol/L As2O3作用细胞易进入凋亡后期改变。
3.线粒体Rho 123荧光标记：加药后2 h线粒体数目增加， 4 h出现有粗大线粒体，多在胞质外带(图2)。12 h及24 h线粒体外形结构不清。
4.细胞超微结构改变：不同浓度As2O3作用后2～4 h，线粒体数目增多，大小不一，椭圆形、双层膜和内嵴清晰(图3)，有的线粒体肿胀，内嵴减少缩短，有电子密度高的不定形物质沉淀，细胞核染色质开始凝集(图4)。 作用6 h可见线粒体肿胀，嵴消失；12 h外膜消失，基质透明呈气球样，并可见自噬泡。核染色质凝集成块及开始靠近核膜(图5)，作用24 h细胞皱缩，核变圆，染色质凝集靠边，出现凋亡的改变(图6)。1 μmol/L As2O3作用，病变发展较慢，而3 μmol/L As2O3作用病变发展较快，病变发生时间缩短。
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5.bcl-2和bax的表达：不同浓度As2O3作用2、6、12、24 h时收集细胞，bcl-2蛋白产物免疫组织化学检测呈阴性(图7)，bax蛋白产物免疫组织化学染色呈深褐色，为高度表达(图8)。
讨论
细胞凋亡是一个发展的过程，有其早、中、晚期的改变，不同浓度的As2O3作用于SHEEC1细胞系4～6 h时出现凋亡早期改变：形态学上细胞完整，结构清晰，细胞核染色质轻度凝集，线粒体增多，肿胀，基质有致密物质沉积，有溶酶体自噬泡。Annexin-V染色流式细胞仪检查，证实磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)外露。Rho123 荧光探针显示在凋亡早期线粒体增生和肿胀。3 μmol/L As2O3作用24 h凋亡细胞出现晚期改变：多数细胞死亡，出现典型的细胞凋亡改变，如细胞皱缩，细胞核变圆，染色质凝集靠边，核膜不完整。线粒体空泡化或外膜破裂呈气球状，胞质呈退行性变。
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线粒体是细胞内一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸链、电子传递，三羧酸循环和氧化磷酸化的场地，也是产生能量的场所，其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动[9]。线粒体膜通透性改变和跨膜电位改变使线粒体肿胀，位于线粒体内外膜间隙的细胞色素c进入胞质，激活某些蛋白酶系统(caspases)[10]，是凋亡产生的起源。细胞核改变是核酸酶进入核内使染色质致密化和DNA断裂[11]。
Rho123是一种分子探针，属于慢反应膜电位荧光探针，用以检测线粒体内侧负电荷。它不但可以显示线粒体的形态，也可通过线粒体内荧光强度的改变，计算膜电位的增减，反映线粒体膜的通透性，是研究线粒体形态和功能的良好试剂。
我们多次检查不同浓度As2O3 作用于食管癌细胞系造成的损伤细胞，皆出现bcl-2表达下调和bax表达增加，证实这两者参与了细胞凋亡的过程。bcl-2可以预防细胞凋亡[12]，bax能促进线粒体膜通透性改变，使细胞色素c释放引起细胞凋亡[13]。bcl-2/bax互相拮抗，其作用位置在线粒体，两者皆为细胞凋亡的调节基因。
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图1 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3 作用24 h出现多数凋亡细胞,细胞皱缩,细胞核变圆, 变小,染色质凝集成块,靠边 苏木素×400
图2 SHEEC1细胞加2 μmolAs2O3 作用4 h活细胞Rhodamin荧光探针图象。左侧细胞线粒体增多,肿大,右侧改变不明显 Rho123×1 000
图3 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3 作用 6 h图像出现线粒体增多,分布不均,大小不一,膜结构和嵴保存，细胞核染色质未见凝集 × 15 000
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图4 密集线粒体轻度肿胀, 结构模糊，周围细胞质电子密度增加 ×20 000
图5 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3作用6 h，线粒体肿大,内嵴消失,有的剩单层膜, 呈气球状,核染色质凝集 ×15 000
图6 同上,24 h,细胞出现皱缩，染色质连结成块, 靠边，胞质线粒体增多、变性 ×7 000
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图7 As2O3作用6 h,损伤脱落细胞，bcl-2呈阴性 SP法×400
图8 同上，bax染色细胞质呈强阳性 SP法×400
砷等氧化剂也作用在线粒体的膜转移电位，产生过量H2O2产物，使膜脂质过氧化作用和线粒体肿胀。我们研究证明As2O3诱导细胞凋亡，线粒体在药物作用4 h内即开始发生改变。核的改变晚于12 h。As2O3引起氧化应激(oxidative stress )毒性作用可能是通过线粒体膜通透性和膜电位改变，也可使bcl-2和bax表达异常而产生细胞凋亡。因此认为As2O3具有线粒体毒性，可用于治疗食管癌。
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作者单位：沈忠英(515031 汕头大学医学院病理学研究室)
沈健(515031 汕头大学医学院病理学研究室)
参考文献
1 孙鸿德，马玲，胡晓晨，等. 癌灵1号结合中医辩证治疗急性早幼粒细胞白血病32例. 中国中西医结合杂志,1992,12:170-171.
2 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins. Blood, 1996,88:1052-1061.
, 百拇医药
3 Look AT. Arsenic and apoptosis in the treatment of acute promyelocytic leukemia. J Natl Cancer Inst, 1998,90:86-88.
4 Shao W, Fanelli M, Ferrara FF, et al. Arsenic trioxide as an inducer of apoptosis and loss of PML/RAR alpha protein in acute promyelocytic leukemia cells. J Natl Cancer Inst, 1998, 90:124-133.
5 沈忠英,谭立军,蔡维佳，等. 氧化砷诱导食管癌细胞系细胞凋亡的形态学研究. 华人消化杂志, 1998,6:226-229.
6 Shen ZY, Tan LJ, Cai WJ, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis of oesophageal carcinoma in vitro. Int J Mol Med, 1999,4:33-37.
, 百拇医药
7 Shen ZY, Shen J, Cai WJ, et al. The alteration of mitochondria is an early event of arsenic trioxide induced apoptosis in esophageal carcinoma cells.Int J Mol Med, 2000,5:155-158.
8 沈忠英,蔡维佳,沈健，等. HPV18E6E7诱发人胚食管上皮永生化和TPA 协同诱发恶性转化的研究. 病毒学学报,1999,15:1-7.
9 Kunz-Schughart LA, Habbersett RC, Freyer JP. Mitochondrial function in oncogene-transfected rat fibroblasts isolated from multicellular spheroids. Am J Physiol,1997,273(5 pt l):C1487-1495.
, 百拇医药
10 Bossy-Wetzel E, Newmeyer DD, Green DR. Mitochondrial cytochrome c release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization. EMBO J, 1998,17:37-49.
11 Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor or ICAD. Nature,1998,391:43-50.
12 Rosse T, Olivier R, Monney L, et al. Bcl- 2 prolongs cell survival after bax-induced release of cytochrome c. Nature, 1998,391:496-499.
13 Pastorino JG, Chen ST, Tafani M, et al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition. J Biol Chem,1998,273:7770-7775., http://www.100md.com
摘 要 目的 通过研究食管癌细胞株SHEEC1细胞凋亡早期线粒体的形态改变和bcl-2、bax的表达，以了解三氧化二砷(As2O3)作用于食管癌细胞的机制。方法 食管癌细胞株SHEEC1用1、2、3 μmol/L As2O3作用2、4、6、12、24 h。用Annexin-V 荧光探针，流式细胞仪和DNA组方图检测早期凋亡细胞；光镜和电镜检测凋亡细胞的形态学改变；用罗达明(Rhodamin 123)荧光探针检查活细胞线粒体的改变；用免疫组织化学SP方法检查bcl-2和bax的表达。结果 SHEEC1细胞经As2O3作用24 h出现细胞凋亡的典型形态改变。4 h可用Annexin-V查出早期凋亡细胞。线粒体的超微结构改变如下：As2O3作用2～4 h内线粒体增生，伴有电子密度高物质出现在基质，是早期细胞损伤的现象。作用6 h线粒体进行性肿胀，12 h出现气球样外观，甚至外膜破裂。不同剂量皆引起损伤脱落细胞bcl-2表达下调和bax上调。结论 由As2O3诱导的SHEEC1细胞凋亡，线粒体形态改变是早期改变，细胞凋亡和bax表达上调及bcl-2表达下调有密切关系。
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关键词：食管肿瘤；脱噬作用；线粒体；原致癌基因蛋白质c-bcl-2；肿瘤细胞，培养的
近年来用三氧化二砷(As2O3)治疗急性白血病已引起人们的重视[1，2]。其治疗机制是诱导肿瘤细胞凋亡[3，4]。我们曾报道As2O3诱导食管癌细胞凋亡，主要表现在细胞核超微结构改变[5，6]。最近我们发现As2O3诱导食管癌细胞凋亡过程中线粒体的改变[7]。我们拟通过研究As2O3诱导细胞凋亡的早期改变，重点在线粒体的形态改变及bcl-2、bax的表达，以阐明As2O3引起食管癌细胞凋亡的作用点，并证实As2O3是一种线粒体毒性药物。
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材料与方法
1.细胞系和用药方法：食管癌细胞系SHEEC1是我室用HPV18 E6E7和TPA 协同诱导胚胎食管上皮恶性转化细胞[8]，在M199培养基中加10%小牛血清培养传代。As2O3(Sigma公司产品， Lot A1010)用培养基配成1、2、3 μmol/L。用药方法：细胞培养在250 ml培养瓶和24孔塑料培养板(Corning 公司产品)，内置盖玻片，每孔接种细胞5×104个，分1、2、3 μmol/L 3浓度As2O3组及1组对照，在第2、4、6、12、24 h取标本检查。
2.透射电镜检查：收获细胞离心成团，2.5%戊二醛固定，常规电镜制样，日立H-300电镜检查。
3.流式细胞仪检查：DNA倍体测定按常规制样，碘化丙锭(propidium iodide ，PI)染色，检查细胞周期和凋亡峰。Annexin V 检测：取培养细胞106用PBS洗，200 r/min离心5 min。Annexin-V-Fluos标记试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，按试剂盒方法作活细胞染色。流式细胞仪(FACSort，B-D公司)检测。
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4.罗达明123 (Rhodamin123，Rho123)荧光探针标记：Rho123， MW 381 ，Molecular Probes公司产品。细胞在24孔板盖玻片上生长。1、2、3 μmol/L As2O3作用，定时取片，PBS洗涤，Rho123(10 μg/ml)染色，在37℃， 5% CO2培养箱温育30 min，PBS洗3次，在落射荧光显微镜(Nikon Fluophot)下检查，激发光505 nm，发射光534 nm。
5.免疫组织化学检查：用细胞离心机(Cytospin Ⅲ,美国Shandon 公司)收集脱落细胞，4%多聚甲醛固定。bcl-2、bax兔抗人多克隆抗体及SP免疫组织化学试剂盒(Santa Cruz公司产品)购自北京中山生物技术公司，按试剂盒操作方法，并设阳性和阴性对照。脱落细胞另作苏木素细胞核染色。
结果
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1.凋亡细胞的形态改变：SHEEC1加不同浓度As2O3后24 h均出现细胞凋亡，多数细胞核染色质凝集靠边呈典型凋亡细胞核改变(图1)。
2.细胞凋亡的指标：1 μmol/L As2O3作用早期凋亡细胞较少，As2O3 2 μmol/L作用4 h Annexin V显示早期凋亡细胞占7.1%。DNA组方图显示细胞凋亡峰，12 h凋亡细胞7.5%，24 h凋亡细胞 35.0%。3 μmol/L As2O3作用细胞易进入凋亡后期改变。
3.线粒体Rho 123荧光标记：加药后2 h线粒体数目增加， 4 h出现有粗大线粒体，多在胞质外带(图2)。12 h及24 h线粒体外形结构不清。
4.细胞超微结构改变：不同浓度As2O3作用后2～4 h，线粒体数目增多，大小不一，椭圆形、双层膜和内嵴清晰(图3)，有的线粒体肿胀，内嵴减少缩短，有电子密度高的不定形物质沉淀，细胞核染色质开始凝集(图4)。 作用6 h可见线粒体肿胀，嵴消失；12 h外膜消失，基质透明呈气球样，并可见自噬泡。核染色质凝集成块及开始靠近核膜(图5)，作用24 h细胞皱缩，核变圆，染色质凝集靠边，出现凋亡的改变(图6)。1 μmol/L As2O3作用，病变发展较慢，而3 μmol/L As2O3作用病变发展较快，病变发生时间缩短。
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5.bcl-2和bax的表达：不同浓度As2O3作用2、6、12、24 h时收集细胞，bcl-2蛋白产物免疫组织化学检测呈阴性(图7)，bax蛋白产物免疫组织化学染色呈深褐色，为高度表达(图8)。
讨论
细胞凋亡是一个发展的过程，有其早、中、晚期的改变，不同浓度的As2O3作用于SHEEC1细胞系4～6 h时出现凋亡早期改变：形态学上细胞完整，结构清晰，细胞核染色质轻度凝集，线粒体增多，肿胀，基质有致密物质沉积，有溶酶体自噬泡。Annexin-V染色流式细胞仪检查，证实磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)外露。Rho123 荧光探针显示在凋亡早期线粒体增生和肿胀。3 μmol/L As2O3作用24 h凋亡细胞出现晚期改变：多数细胞死亡，出现典型的细胞凋亡改变，如细胞皱缩，细胞核变圆，染色质凝集靠边，核膜不完整。线粒体空泡化或外膜破裂呈气球状，胞质呈退行性变。
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线粒体是细胞内一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸链、电子传递，三羧酸循环和氧化磷酸化的场地，也是产生能量的场所，其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动[9]。线粒体膜通透性改变和跨膜电位改变使线粒体肿胀，位于线粒体内外膜间隙的细胞色素c进入胞质，激活某些蛋白酶系统(caspases)[10]，是凋亡产生的起源。细胞核改变是核酸酶进入核内使染色质致密化和DNA断裂[11]。
Rho123是一种分子探针，属于慢反应膜电位荧光探针，用以检测线粒体内侧负电荷。它不但可以显示线粒体的形态，也可通过线粒体内荧光强度的改变，计算膜电位的增减，反映线粒体膜的通透性，是研究线粒体形态和功能的良好试剂。
我们多次检查不同浓度As2O3 作用于食管癌细胞系造成的损伤细胞，皆出现bcl-2表达下调和bax表达增加，证实这两者参与了细胞凋亡的过程。bcl-2可以预防细胞凋亡[12]，bax能促进线粒体膜通透性改变，使细胞色素c释放引起细胞凋亡[13]。bcl-2/bax互相拮抗，其作用位置在线粒体，两者皆为细胞凋亡的调节基因。
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图1 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3 作用24 h出现多数凋亡细胞,细胞皱缩,细胞核变圆, 变小,染色质凝集成块,靠边 苏木素×400
图2 SHEEC1细胞加2 μmolAs2O3 作用4 h活细胞Rhodamin荧光探针图象。左侧细胞线粒体增多,肿大,右侧改变不明显 Rho123×1 000
图3 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3 作用 6 h图像出现线粒体增多,分布不均,大小不一,膜结构和嵴保存，细胞核染色质未见凝集 × 15 000
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图4 密集线粒体轻度肿胀, 结构模糊，周围细胞质电子密度增加 ×20 000
图5 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3作用6 h，线粒体肿大,内嵴消失,有的剩单层膜, 呈气球状,核染色质凝集 ×15 000
图6 同上,24 h,细胞出现皱缩，染色质连结成块, 靠边，胞质线粒体增多、变性 ×7 000
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图7 As2O3作用6 h,损伤脱落细胞，bcl-2呈阴性 SP法×400
图8 同上，bax染色细胞质呈强阳性 SP法×400
砷等氧化剂也作用在线粒体的膜转移电位，产生过量H2O2产物，使膜脂质过氧化作用和线粒体肿胀。我们研究证明As2O3诱导细胞凋亡，线粒体在药物作用4 h内即开始发生改变。核的改变晚于12 h。As2O3引起氧化应激(oxidative stress )毒性作用可能是通过线粒体膜通透性和膜电位改变，也可使bcl-2和bax表达异常而产生细胞凋亡。因此认为As2O3具有线粒体毒性，可用于治疗食管癌。
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作者单位：沈忠英(515031 汕头大学医学院病理学研究室)
沈健(515031 汕头大学医学院病理学研究室)
参考文献
1 孙鸿德，马玲，胡晓晨，等. 癌灵1号结合中医辩证治疗急性早幼粒细胞白血病32例. 中国中西医结合杂志,1992,12:170-171.
2 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins. Blood, 1996,88:1052-1061.
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3 Look AT. Arsenic and apoptosis in the treatment of acute promyelocytic leukemia. J Natl Cancer Inst, 1998,90:86-88.
4 Shao W, Fanelli M, Ferrara FF, et al. Arsenic trioxide as an inducer of apoptosis and loss of PML/RAR alpha protein in acute promyelocytic leukemia cells. J Natl Cancer Inst, 1998, 90:124-133.
5 沈忠英,谭立军,蔡维佳，等. 氧化砷诱导食管癌细胞系细胞凋亡的形态学研究. 华人消化杂志, 1998,6:226-229.
6 Shen ZY, Tan LJ, Cai WJ, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis of oesophageal carcinoma in vitro. Int J Mol Med, 1999,4:33-37.
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7 Shen ZY, Shen J, Cai WJ, et al. The alteration of mitochondria is an early event of arsenic trioxide induced apoptosis in esophageal carcinoma cells.Int J Mol Med, 2000,5:155-158.
8 沈忠英,蔡维佳,沈健，等. HPV18E6E7诱发人胚食管上皮永生化和TPA 协同诱发恶性转化的研究. 病毒学学报,1999,15:1-7.
9 Kunz-Schughart LA, Habbersett RC, Freyer JP. Mitochondrial function in oncogene-transfected rat fibroblasts isolated from multicellular spheroids. Am J Physiol,1997,273(5 pt l):C1487-1495.
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10 Bossy-Wetzel E, Newmeyer DD, Green DR. Mitochondrial cytochrome c release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization. EMBO J, 1998,17:37-49.
11 Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor or ICAD. Nature,1998,391:43-50.
12 Rosse T, Olivier R, Monney L, et al. Bcl- 2 prolongs cell survival after bax-induced release of cytochrome c. Nature, 1998,391:496-499.
13 Pastorino JG, Chen ST, Tafani M, et al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition. J Biol Chem,1998,273:7770-7775., http://www.100md.com