一氧化氮合酶调节伤段脊髓血流量的作用及其机制
一氧化氮合酶调节伤段脊髓血流量的作用及其机制
周初松 严兵 刘成龙 靳安民 张辉 童斌辉
摘 要 目的 探讨一氧化氮合酶(NOS)在脊髓损伤早期调节伤段脊髓血流量的作用及其机制。 方法 通过大鼠脊髓伤前30 min蛛网膜下腔注射NOS底物左旋精氨酸(L-Arg)及其不同剂量的抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)，采用激光多普勒血流仪观测不同NOS活性状态对伤段脊髓血流量的影响；同时应用免疫组化和酶标免疫电镜技术，进一步研究NOS在脊髓组织中的分布规律及其调节血流量的超微结构特征。 结果 伤前注射L-Arg导致伤段脊髓伤后早期血流量明显改善；而注射不同剂量的抑制剂则导致剂量依赖性血流量降低。参与脊髓血流量调节的NOS主要是位于神经细胞胞浆内的Ⅰ型。 结论 NOS在脊髓损伤早期伤段脊髓血流量的调节中起着极其关键的作用；许多含有NOS的神经细胞和其突起与脊髓微血管毗邻的解剖学结构确保了半衰期极短的一氧化氮(NO)在其丧失活性之前作用于微血管，从而发挥其调节微循环的功能。
, 百拇医药
关键词：脊髓损伤；一氧化氮合酶；微循环；免疫电镜技术
一氧化氮合酶(NOS)广泛存在于机体内各种组织中，由其催化合成的一氧化氮(NO)具有广泛而多样的生物学效应。然而关于脊髓组织中NOS在调节伤段脊髓血流量中所起的作用及其可能的调节机制尚不清楚。为此，笔者通过改变早期伤段脊髓NOS的活性状态，研究其对伤段脊髓血流量的影响；并应用免疫组化及酶标免疫电镜技术，探讨NOS在脊髓组织中的分布规律及其调节脊髓血流量的超微结构特征。
材料与方法
1. 实验动物及分组：雌性SD大鼠51只，体重(250±300)g。其中45只经枕骨大孔插入PE-10导管于蛛网膜下腔6.5～7.0 cm，将观察48 h后无脊髓损伤的40只大鼠分为5组，每组8只。即A组：假手术组；B组：损伤对照组；C组：左旋精氨酸(L-Arg)组；D组：亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME) 0.15 mg组；E组：L-NAME 1.5 mg组。另外6只大鼠用于免疫组化和酶标免疫电镜观察。
, 百拇医药
2. 脊髓压迫动物模型制备：通过插入的PE管于伤前30 min给药。A、B组分别注入10 μl等渗盐水；C组注入含L-Arg 0.3 mg的等渗盐水10 μl；D、E组分别注入含L-NAME 0.15，1.5 mg的等渗盐水10 μl。各组大鼠以质量浓度为10 g/L的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(30 mg/kg)。按Nystrom等[1]的方法致伤B、C、D、E组动物脊髓T8，9段，压迫重量为35 g,时间为10 min。
3. 伤段脊髓血流量的监测：在维持室温(20±1)℃、并用电毯保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃条件下，用激光多普勒血流仪动态监测伤段脊髓血流量，以注药前测量值为基数，各时相以基数的百分率表示该时相脊髓血流量的相对值。
4. 免疫组化及酶标免疫电镜技术：大鼠麻醉后，以质量浓度为40 g/L的多聚甲醛-苦味酸250 ml行心内灌注。取T8，9段脊髓立即浸入上述灌注液中继续固定5 h。于-20℃恒冷切片机中切片，片厚20 μm。0.1 mol/L PBS液漂洗，过氧化氢酶阻断剂孵育。再加入1∶50稀释的多克隆抗体NOS-Ⅰ或NOS-Ⅲ4℃孵育36 h，漂洗后加入生物素化羊抗兔抗体37℃孵育1 h，再加入抗生物素蛋白链菌素偶联过氧化物酶(streptavidin peroxidase conjugate) 37℃孵育30 min。切片一部分加入二胺基联苯胺(DAB)显色10 min ；另一部分采用包埋前免疫过氧化物酶染色方法[2]进行免疫电镜观察，片厚100 nm。
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5. 统计学处理：均值间差异采用方差分析和t检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有显著性意义。
结 果
1. 不同NOS活性状态对伤段脊髓血流量的影响： 脊髓损伤前30 min 给予NOS底物L-Arg 导致伤段脊髓伤后50 min 内脊髓血流量明显高于损伤对照组(P<0.01)；而注射不同剂量NOS抑制剂L-NAME则导致剂量依赖性血流量降低，且剂量越大，干扰时间越长。
2. 脊髓组织免疫组化观察：神经元型NOS(NOS-Ⅰ)免疫染色位于神经细胞体和突起胞浆内，这些阳性细胞主要集中于脊髓灰质的中间外侧柱、中央管周围、脊髓后角、脊髓前角；而内皮型NOS(NOS-Ⅲ)免疫染色未见阳性结果。
3. 酶标免疫电镜观察：胞浆内NOS呈大小不等的颗粒状，大多数颗粒位于囊状结构中；许多胞浆内NOS位于与血管紧邻的神经细胞突起内，并可见含有NOS的神经细胞与微血管壁紧邻。
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讨 论
急性脊髓损伤包括原发性机械损伤及其引起的一系列级联放大的迟发性神经坏死而造成的继发性损伤，它是在原发损伤基础上产生的程度更重、范围更广的损伤。现已认识到血管机制及神经生化机制是继发性脊髓损伤过程中的两大机制，且神经生化物质作用的最终结果是导致损伤脊髓血流的进一步破坏。因而了解影响损伤脊髓血流改变的根本原因极为重要。
NOS的生物学作用是通过其催化合成的NO介导，而NO具有扩张血管、阻止血小板黏附与聚集的功能[3]。本实验结果表明，给予NOS底物促进了NO的产生，从而导致伤段脊髓早期微循环的改善；相反，抑制NO的产生则导致损伤脊髓血流量进一步下降。说明NOS在脊髓血流调节中起关键作用。
中枢神经系统NOS主要包括NOS-Ⅰ、诱导型(NOS-Ⅱ)、NOS-Ⅲ[4]。诱导型需经翻译、转录等一系列复杂过程才能产生，故不可能在脊髓损伤后短时间内起作用。免疫组化结果表明，在早期脊髓血流调节中起主要作用的是NOS-Ⅰ。那么位于神经细胞胞浆内囊状结构中的NOS是如何参与脊髓血流的调节呢？酶标免疫电镜结果进一步阐明了其调节脊髓血流的解剖学基础。由于NO半衰期极短，在体内不能贮存，是在NOS催化下合成[5]，而NOS主要位于神经细胞内，所以许多含有NOS的神经细胞和其突起与脊髓微血管毗邻的解剖学结构能确保NO在其丧失活性之前作用于微血管，从而发挥其调节脊髓微循环的功能。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800166)
作者单位：周初松(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
刘成龙(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
靳安民(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
张辉(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
童斌辉(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
严兵(解放军第二十五医院骨科)
参考文献
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1，Nystrom B,Berglund JE.Spinal cord restitution following compression injuries in rats.Acta Neurol Scand, 1988,78:467-472.
2，倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.第1版.北京：北京科学技术出版社， 1993.171-172.
3，Schmidt HW,Walter U.NO at work.Cell, 1994,78:919-925.
4，Haley JE.Gases as neurotransmitters. Essays Biochem, 1998, 33: 79-91.
5，Paakkari I, Lindsberg P.Nitric oxide in the central nervous system.Ann Med, 1995, 27: 369-377., http://www.100md.com
周初松 严兵 刘成龙 靳安民 张辉 童斌辉
摘 要 目的 探讨一氧化氮合酶(NOS)在脊髓损伤早期调节伤段脊髓血流量的作用及其机制。 方法 通过大鼠脊髓伤前30 min蛛网膜下腔注射NOS底物左旋精氨酸(L-Arg)及其不同剂量的抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)，采用激光多普勒血流仪观测不同NOS活性状态对伤段脊髓血流量的影响；同时应用免疫组化和酶标免疫电镜技术，进一步研究NOS在脊髓组织中的分布规律及其调节血流量的超微结构特征。 结果 伤前注射L-Arg导致伤段脊髓伤后早期血流量明显改善；而注射不同剂量的抑制剂则导致剂量依赖性血流量降低。参与脊髓血流量调节的NOS主要是位于神经细胞胞浆内的Ⅰ型。 结论 NOS在脊髓损伤早期伤段脊髓血流量的调节中起着极其关键的作用；许多含有NOS的神经细胞和其突起与脊髓微血管毗邻的解剖学结构确保了半衰期极短的一氧化氮(NO)在其丧失活性之前作用于微血管，从而发挥其调节微循环的功能。
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关键词：脊髓损伤；一氧化氮合酶；微循环；免疫电镜技术
一氧化氮合酶(NOS)广泛存在于机体内各种组织中，由其催化合成的一氧化氮(NO)具有广泛而多样的生物学效应。然而关于脊髓组织中NOS在调节伤段脊髓血流量中所起的作用及其可能的调节机制尚不清楚。为此，笔者通过改变早期伤段脊髓NOS的活性状态，研究其对伤段脊髓血流量的影响；并应用免疫组化及酶标免疫电镜技术，探讨NOS在脊髓组织中的分布规律及其调节脊髓血流量的超微结构特征。
材料与方法
1. 实验动物及分组：雌性SD大鼠51只，体重(250±300)g。其中45只经枕骨大孔插入PE-10导管于蛛网膜下腔6.5～7.0 cm，将观察48 h后无脊髓损伤的40只大鼠分为5组，每组8只。即A组：假手术组；B组：损伤对照组；C组：左旋精氨酸(L-Arg)组；D组：亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME) 0.15 mg组；E组：L-NAME 1.5 mg组。另外6只大鼠用于免疫组化和酶标免疫电镜观察。
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2. 脊髓压迫动物模型制备：通过插入的PE管于伤前30 min给药。A、B组分别注入10 μl等渗盐水；C组注入含L-Arg 0.3 mg的等渗盐水10 μl；D、E组分别注入含L-NAME 0.15，1.5 mg的等渗盐水10 μl。各组大鼠以质量浓度为10 g/L的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(30 mg/kg)。按Nystrom等[1]的方法致伤B、C、D、E组动物脊髓T8，9段，压迫重量为35 g,时间为10 min。
3. 伤段脊髓血流量的监测：在维持室温(20±1)℃、并用电毯保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃条件下，用激光多普勒血流仪动态监测伤段脊髓血流量，以注药前测量值为基数，各时相以基数的百分率表示该时相脊髓血流量的相对值。
4. 免疫组化及酶标免疫电镜技术：大鼠麻醉后，以质量浓度为40 g/L的多聚甲醛-苦味酸250 ml行心内灌注。取T8，9段脊髓立即浸入上述灌注液中继续固定5 h。于-20℃恒冷切片机中切片，片厚20 μm。0.1 mol/L PBS液漂洗，过氧化氢酶阻断剂孵育。再加入1∶50稀释的多克隆抗体NOS-Ⅰ或NOS-Ⅲ4℃孵育36 h，漂洗后加入生物素化羊抗兔抗体37℃孵育1 h，再加入抗生物素蛋白链菌素偶联过氧化物酶(streptavidin peroxidase conjugate) 37℃孵育30 min。切片一部分加入二胺基联苯胺(DAB)显色10 min ；另一部分采用包埋前免疫过氧化物酶染色方法[2]进行免疫电镜观察，片厚100 nm。
, http://www.100md.com
5. 统计学处理：均值间差异采用方差分析和t检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有显著性意义。
结 果
1. 不同NOS活性状态对伤段脊髓血流量的影响： 脊髓损伤前30 min 给予NOS底物L-Arg 导致伤段脊髓伤后50 min 内脊髓血流量明显高于损伤对照组(P<0.01)；而注射不同剂量NOS抑制剂L-NAME则导致剂量依赖性血流量降低，且剂量越大，干扰时间越长。
2. 脊髓组织免疫组化观察：神经元型NOS(NOS-Ⅰ)免疫染色位于神经细胞体和突起胞浆内，这些阳性细胞主要集中于脊髓灰质的中间外侧柱、中央管周围、脊髓后角、脊髓前角；而内皮型NOS(NOS-Ⅲ)免疫染色未见阳性结果。
3. 酶标免疫电镜观察：胞浆内NOS呈大小不等的颗粒状，大多数颗粒位于囊状结构中；许多胞浆内NOS位于与血管紧邻的神经细胞突起内，并可见含有NOS的神经细胞与微血管壁紧邻。
, http://www.100md.com
讨 论
急性脊髓损伤包括原发性机械损伤及其引起的一系列级联放大的迟发性神经坏死而造成的继发性损伤，它是在原发损伤基础上产生的程度更重、范围更广的损伤。现已认识到血管机制及神经生化机制是继发性脊髓损伤过程中的两大机制，且神经生化物质作用的最终结果是导致损伤脊髓血流的进一步破坏。因而了解影响损伤脊髓血流改变的根本原因极为重要。
NOS的生物学作用是通过其催化合成的NO介导，而NO具有扩张血管、阻止血小板黏附与聚集的功能[3]。本实验结果表明，给予NOS底物促进了NO的产生，从而导致伤段脊髓早期微循环的改善；相反，抑制NO的产生则导致损伤脊髓血流量进一步下降。说明NOS在脊髓血流调节中起关键作用。
中枢神经系统NOS主要包括NOS-Ⅰ、诱导型(NOS-Ⅱ)、NOS-Ⅲ[4]。诱导型需经翻译、转录等一系列复杂过程才能产生，故不可能在脊髓损伤后短时间内起作用。免疫组化结果表明，在早期脊髓血流调节中起主要作用的是NOS-Ⅰ。那么位于神经细胞胞浆内囊状结构中的NOS是如何参与脊髓血流的调节呢？酶标免疫电镜结果进一步阐明了其调节脊髓血流的解剖学基础。由于NO半衰期极短，在体内不能贮存，是在NOS催化下合成[5]，而NOS主要位于神经细胞内，所以许多含有NOS的神经细胞和其突起与脊髓微血管毗邻的解剖学结构能确保NO在其丧失活性之前作用于微血管，从而发挥其调节脊髓微循环的功能。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800166)
作者单位：周初松(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
刘成龙(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
靳安民(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
张辉(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
童斌辉(510282 广州，第一军医大学附属珠江医院全军骨科中心)
严兵(解放军第二十五医院骨科)
参考文献
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1，Nystrom B,Berglund JE.Spinal cord restitution following compression injuries in rats.Acta Neurol Scand, 1988,78:467-472.
2，倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.第1版.北京：北京科学技术出版社， 1993.171-172.
3，Schmidt HW,Walter U.NO at work.Cell, 1994,78:919-925.
4，Haley JE.Gases as neurotransmitters. Essays Biochem, 1998, 33: 79-91.
5，Paakkari I, Lindsberg P.Nitric oxide in the central nervous system.Ann Med, 1995, 27: 369-377., http://www.100md.com