肢体缺血再灌注引起骨骼肌内皮素表达上调的实验研究
肢体缺血再灌注引起骨骼肌内皮素表达上调的实验研究
彭新生 李佛保
关键词：肢体；缺血再灌注；骨骼肌；内皮素
骨骼肌缺血后出现再灌注损伤[1]。各种因素所致血管痉挛是引起再灌注损伤的因素[2]。内皮素(ET)是一种强烈的血管收缩肽[3]，研究表明，它参与了心肌缺血再灌注损伤[4]。对于内皮素与骨骼肌缺血再灌注损伤的关系少有报道[2，5]。笔者应用放免及免疫组化技术，以明确大鼠肢体缺血再灌注后不同时相点ET-1在肌肉及血浆中的变化规律，为研究ET与骨骼肌缺血再灌注损伤的关系提供依据。
一、材料与方法
1. 动物模型：SD大鼠30只，体重300～400 g，随机分为5组，即假手术组、缺血组、再灌注2，24，48 h组，每组6只。水合氯醛麻醉动物，Skjeldal等[6]法制作骨骼肌缺血再灌注损伤动物模型。
, 百拇医药
2. 血浆ET-1测定：血浆ET-1测定药盒由北京东亚免疫所提供，操作程序按药盒说明书进行。
3. 组织准备及免疫组化染色： 取胫前肌中段约4 mm，置于质量浓度为40 g/L的多聚甲醛中固定8 h，OCT包埋，冷冰切片。采用SP法染色(美国EYMED公司)，其中兔抗ET-1抗体(Penninsula Laboratories，美国)工作浓度为1∶500。以非免疫兔血清及PBS替代Ⅰ抗作阴性对照。DAB显色。
4. 统计学处理：血浆ET-1水平以±s表示，方差分析及Dunnett t检验对数据进行分析，P<0.05为差异有显著性意义。
二、结果
1. 缺血再灌注前后血浆ET-1含量：假手术组、缺血组、再灌注后2，24，48 h组血浆ET-1含量分别为(303.53±38.52)pg/ml、(294.91±38.67 )pg/ml、(325.53±39.03)pg/ml、(311.06±50.67) pg/ml、(344.16±41.85)pg/ml。缺血及再灌注后，各组血浆ET-1水平与假手术组比较差异无显著性意义(P>0.05)。
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2. ET-1免疫组化变化：假手术组肌组织中未见ET-1免疫染色。在缺血组筋膜下肌组织可见ET-1染色，而肌组织中央无着色。再灌注2,24，48 h全部肌组织有ET-1免疫着色。再灌注48 h可见中央肌组织坏死，大量炎性细胞浸润。
三、讨论
ET由3种异质肽组成(ET-1、ET-2和ET-3)。在心肌细胞有ET-1及其mRNA存在[4]。但目前仍未发现正常骨骼肌细胞有ET-1表达[5]。本实验中也未发现正常骨骼肌细胞中有阳性ET-1免疫染色。正常骨骼肌细胞中是否有ET-1 mRNA也存在争论[2，5]。
本实验结果表明，大鼠胫前肌缺血后筋膜下肌组织有ET-1分布，而再灌注后整个肌组织中都有ET-1着色。Hvaal等[5]发现，再灌注72 h后肌组织中仍有ET-1着色。本实验及Hvaal等[5]实验结果均显示，肢体缺血再灌注后血浆中ET-1水平并无变化，提示缺血再灌注后肌组织中表达的ET-1是来自于组织本身，而非血液循环。肌组织中ET-1 mRNA在缺血及再灌注后含量升高[5]，也进一步支持ET-1来自组织本身。由于肌组织由肌细胞、血管、神经及筋膜组成，ET-1可来源于任何一部分。但从免疫染色看，ET-1主要分布于肌细胞中，且整个组织以肌细胞为主，因此，肌细胞可能是缺血再灌注后ET-1的主要来源。ET-1在骨骼肌缺血再灌注后表达上调的意义还不清楚，推测ET-1可能参与了缺血再灌注损伤。
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血管强烈收缩是引起骨骼肌缺血再灌注后低灌注或无灌注的原因之一[1，2]。由于ET-1是强烈的血管收缩肽，故缺血及再灌注后肌组织中ET-1表达明显升高。ET-1参与了心肌缺血再灌注后的血管痉挛[4]。据推测，ET-1也可能参与了骨骼肌缺血再灌注后的血管痉挛。但Wang等[2]的实验结果并不支持ET-1参与了骨骼肌缺血再灌注诱发的血管收缩及低灌注。ET-1还可能通过启动和促进炎症反应来参与骨骼肌缺血再灌注损伤[5]。
总之，肢体缺血与再灌注后，骨骼肌组织中ET-1表达上调，血浆中ET-1含量无变化。ET-1是否参与骨骼肌缺血再灌注损伤有待进一步研究。
作者单位：彭新生(510080 广州，中山医科大学附属第一医院骨科)
李佛保(510080 广州，中山医科大学附属第一医院骨科)
, 百拇医药
参考文献
1，Rubin BB,Romachin A,Walker PM,et al.Mechanisms of post ischemic injury in skeletal muscle:intervention strategies.J Appl Physiol，1996,80:369-387.
2，Wang WZ,Anderson G,Acland RD,et al.Endothelin-1 does not contribute to ischemia/reperfusion-induced vasocostriction in skeletal muscle.J Reconstr Microsurg， 1997,13:439-447.
3，Yanagisawa M,Kurihara H,Kimura S,et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells.Nature， 1988,332:411-415.
, http://www.100md.com
4，Pernow J,Wang QD.Endothelin in myocardial ischemia and reperfusion.Cardiovasc Res， 1997,33:518-526.
5，Hvaal K, Attramadal H, Halvorsen V, et al.Endothelin-1 is upregulated during skeletal muscle ischemia and reperfusion. J Orthop Res， 1998,16:128-135.
6，Skjeldal S,Svindland A,Hvaal K,et al.Severe hindlimb ischemia causes periosteal proliferation in the rat tibia. Acta Orthop Scand， 1997,68:593-597., 百拇医药
彭新生 李佛保
关键词：肢体；缺血再灌注；骨骼肌；内皮素
骨骼肌缺血后出现再灌注损伤[1]。各种因素所致血管痉挛是引起再灌注损伤的因素[2]。内皮素(ET)是一种强烈的血管收缩肽[3]，研究表明，它参与了心肌缺血再灌注损伤[4]。对于内皮素与骨骼肌缺血再灌注损伤的关系少有报道[2，5]。笔者应用放免及免疫组化技术，以明确大鼠肢体缺血再灌注后不同时相点ET-1在肌肉及血浆中的变化规律，为研究ET与骨骼肌缺血再灌注损伤的关系提供依据。
一、材料与方法
1. 动物模型：SD大鼠30只，体重300～400 g，随机分为5组，即假手术组、缺血组、再灌注2，24，48 h组，每组6只。水合氯醛麻醉动物，Skjeldal等[6]法制作骨骼肌缺血再灌注损伤动物模型。
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2. 血浆ET-1测定：血浆ET-1测定药盒由北京东亚免疫所提供，操作程序按药盒说明书进行。
3. 组织准备及免疫组化染色： 取胫前肌中段约4 mm，置于质量浓度为40 g/L的多聚甲醛中固定8 h，OCT包埋，冷冰切片。采用SP法染色(美国EYMED公司)，其中兔抗ET-1抗体(Penninsula Laboratories，美国)工作浓度为1∶500。以非免疫兔血清及PBS替代Ⅰ抗作阴性对照。DAB显色。
4. 统计学处理：血浆ET-1水平以±s表示，方差分析及Dunnett t检验对数据进行分析，P<0.05为差异有显著性意义。
二、结果
1. 缺血再灌注前后血浆ET-1含量：假手术组、缺血组、再灌注后2，24，48 h组血浆ET-1含量分别为(303.53±38.52)pg/ml、(294.91±38.67 )pg/ml、(325.53±39.03)pg/ml、(311.06±50.67) pg/ml、(344.16±41.85)pg/ml。缺血及再灌注后，各组血浆ET-1水平与假手术组比较差异无显著性意义(P>0.05)。
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2. ET-1免疫组化变化：假手术组肌组织中未见ET-1免疫染色。在缺血组筋膜下肌组织可见ET-1染色，而肌组织中央无着色。再灌注2,24，48 h全部肌组织有ET-1免疫着色。再灌注48 h可见中央肌组织坏死，大量炎性细胞浸润。
三、讨论
ET由3种异质肽组成(ET-1、ET-2和ET-3)。在心肌细胞有ET-1及其mRNA存在[4]。但目前仍未发现正常骨骼肌细胞有ET-1表达[5]。本实验中也未发现正常骨骼肌细胞中有阳性ET-1免疫染色。正常骨骼肌细胞中是否有ET-1 mRNA也存在争论[2，5]。
本实验结果表明，大鼠胫前肌缺血后筋膜下肌组织有ET-1分布，而再灌注后整个肌组织中都有ET-1着色。Hvaal等[5]发现，再灌注72 h后肌组织中仍有ET-1着色。本实验及Hvaal等[5]实验结果均显示，肢体缺血再灌注后血浆中ET-1水平并无变化，提示缺血再灌注后肌组织中表达的ET-1是来自于组织本身，而非血液循环。肌组织中ET-1 mRNA在缺血及再灌注后含量升高[5]，也进一步支持ET-1来自组织本身。由于肌组织由肌细胞、血管、神经及筋膜组成，ET-1可来源于任何一部分。但从免疫染色看，ET-1主要分布于肌细胞中，且整个组织以肌细胞为主，因此，肌细胞可能是缺血再灌注后ET-1的主要来源。ET-1在骨骼肌缺血再灌注后表达上调的意义还不清楚，推测ET-1可能参与了缺血再灌注损伤。
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血管强烈收缩是引起骨骼肌缺血再灌注后低灌注或无灌注的原因之一[1，2]。由于ET-1是强烈的血管收缩肽，故缺血及再灌注后肌组织中ET-1表达明显升高。ET-1参与了心肌缺血再灌注后的血管痉挛[4]。据推测，ET-1也可能参与了骨骼肌缺血再灌注后的血管痉挛。但Wang等[2]的实验结果并不支持ET-1参与了骨骼肌缺血再灌注诱发的血管收缩及低灌注。ET-1还可能通过启动和促进炎症反应来参与骨骼肌缺血再灌注损伤[5]。
总之，肢体缺血与再灌注后，骨骼肌组织中ET-1表达上调，血浆中ET-1含量无变化。ET-1是否参与骨骼肌缺血再灌注损伤有待进一步研究。
作者单位：彭新生(510080 广州，中山医科大学附属第一医院骨科)
李佛保(510080 广州，中山医科大学附属第一医院骨科)
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参考文献
1，Rubin BB,Romachin A,Walker PM,et al.Mechanisms of post ischemic injury in skeletal muscle:intervention strategies.J Appl Physiol，1996,80:369-387.
2，Wang WZ,Anderson G,Acland RD,et al.Endothelin-1 does not contribute to ischemia/reperfusion-induced vasocostriction in skeletal muscle.J Reconstr Microsurg， 1997,13:439-447.
3，Yanagisawa M,Kurihara H,Kimura S,et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells.Nature， 1988,332:411-415.
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4，Pernow J,Wang QD.Endothelin in myocardial ischemia and reperfusion.Cardiovasc Res， 1997,33:518-526.
5，Hvaal K, Attramadal H, Halvorsen V, et al.Endothelin-1 is upregulated during skeletal muscle ischemia and reperfusion. J Orthop Res， 1998,16:128-135.
6，Skjeldal S,Svindland A,Hvaal K,et al.Severe hindlimb ischemia causes periosteal proliferation in the rat tibia. Acta Orthop Scand， 1997,68:593-597., 百拇医药