肾上腺髓质素对缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖的影响
肾上腺髓质素对缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖的影响
李耀军 张珍祥 徐永健
关键词：肾上腺髓质素(AM)；缺氧性肺动脉高压；肺动脉平滑肌细胞(PASMC) 为了探讨肾上腺髓质素(AM)在缺氧性肺动脉高压的作用，我们检测了AM对缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的影响。
材料与方法 PASMC获取与培养：健康成年猪，体重120 kg，在无菌条件下取出肺动脉干，用组织贴块法进行原代和传代培养，实验用第1～2代细胞，分别接种于96孔板，100 μl/孔或接种于装有盖玻片的25 ml培养瓶中(1 ml/瓶)，培养24 h后换无血清培养液，静息20 h，换含20 ml/L小牛血清的培养液后分组培养。常氧组：培养液不含AM，于体积分数为5% CO2、95%空气，常氧条件下培养。缺氧组：培养液不含AM，在5% CO2、6% O2、89% N2缺氧条件下培养。缺氧+AM组：培养液含10-7mol/L AM(美国Sigma公司)，并于缺氧组相同条件下培养。每组设8个平行孔，在各实验条件下培养24 h后用台盼蓝染色和倒置显微镜下观察PASMC生长。
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甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测细胞增殖：上述各组在各实验条件培养24 h后，每孔分别加入MTT 10 μl(终浓度为5 mg/ml)，37 ℃孵育4 h，弃去培养液，加二甲基亚砜(DMSO)100 μl/孔，溶液混合后于492 nm在酶标仪上读A值(曾称光密度OD值)。
增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化检测：将实验处理后长有PASMC的盖玻片取出，采用SP法进行免疫组化检测，联苯二胺(DAB)显色封片，用JLTY-300型全自动图像分析仪(同济千屏影像公司)，在相同的放大倍数下(10×20)各组随机取30个细胞测平均A值，以表示细胞染色的强度。
统计学处理：采用方差分析比较差异的显著性，组间差异采用q检验。
结果 MTT比色法：缺氧组A值(0.514±0.035)与常氧组(0.373±0.010)比较差异有显著性(P<0.01)，缺氧+AM组为0.394±0.025，显著低于缺氧组(P<0.01)。
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AM对PASMC PCNA表达的影响：常氧条件下培养的PASMC PCNA呈阳性表达，阳性颗粒为棕黄色，定位于细胞核、清晰无扩散，缺氧组PASMC PCNA表达增强，表现为颗粒明显增多，分布密集、深染、广泛存在于所有核内，缺氧+AM组的PASMC PCNA阳性颗粒明显少于单纯缺氧组，着色较浅，分布较稀疏(图1～3)。图像分析显示，缺氧组平均A值为0.31±0.08，显著高于常氧组的0.17±0.04(P<0.01)，缺氧+AM组为0.17±0.05，显著低于缺氧组(P<0.01)，而与常氧组比较差异无显著性。
讨论 本组实验发现肾上腺髓质素对肺血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用，推测肾上腺髓质素具有抑制肺血管重构作用。
肺动脉高压患者血浆中AM浓度升高，在缺氧性肺动脉高压大鼠肺的结合位点增多[1]，因为AM能够降低肺动脉压[2]，抑制肺血管平滑肌增殖，我们认为，AM升高在肺动脉高压发病中起着自身代偿作用，防止肺动脉压力无限升高。
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图1 PCNA在常氧培养的PASMC的表达
免疫组化 × 200
图2 PCNA在缺氧培养的PASMC的表达
免疫组化 × 200
图3 PCNA在缺氧+AM培养的PASMC的表达
免疫组化 ×200
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作者单位：李耀军(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室)
张珍祥(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室)
徐永健(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室)
参考文献
1.Zhao L, Brown LA, Owji AA, et al. Adrenomedullin activity in chronically hypoxic rat lungs. Am J Physiol, 1996，271:622-629.
2.Lippton H, Chang JK, Ho Q, et al. Adrenomedullin dilates the pulmonary vascular bed in vivo. J Appl Physiol，1994, 76:2154-2156., http://www.100md.com
李耀军 张珍祥 徐永健
关键词：肾上腺髓质素(AM)；缺氧性肺动脉高压；肺动脉平滑肌细胞(PASMC) 为了探讨肾上腺髓质素(AM)在缺氧性肺动脉高压的作用，我们检测了AM对缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的影响。
材料与方法 PASMC获取与培养：健康成年猪，体重120 kg，在无菌条件下取出肺动脉干，用组织贴块法进行原代和传代培养，实验用第1～2代细胞，分别接种于96孔板，100 μl/孔或接种于装有盖玻片的25 ml培养瓶中(1 ml/瓶)，培养24 h后换无血清培养液，静息20 h，换含20 ml/L小牛血清的培养液后分组培养。常氧组：培养液不含AM，于体积分数为5% CO2、95%空气，常氧条件下培养。缺氧组：培养液不含AM，在5% CO2、6% O2、89% N2缺氧条件下培养。缺氧+AM组：培养液含10-7mol/L AM(美国Sigma公司)，并于缺氧组相同条件下培养。每组设8个平行孔，在各实验条件下培养24 h后用台盼蓝染色和倒置显微镜下观察PASMC生长。
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甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测细胞增殖：上述各组在各实验条件培养24 h后，每孔分别加入MTT 10 μl(终浓度为5 mg/ml)，37 ℃孵育4 h，弃去培养液，加二甲基亚砜(DMSO)100 μl/孔，溶液混合后于492 nm在酶标仪上读A值(曾称光密度OD值)。
增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化检测：将实验处理后长有PASMC的盖玻片取出，采用SP法进行免疫组化检测，联苯二胺(DAB)显色封片，用JLTY-300型全自动图像分析仪(同济千屏影像公司)，在相同的放大倍数下(10×20)各组随机取30个细胞测平均A值，以表示细胞染色的强度。
统计学处理：采用方差分析比较差异的显著性，组间差异采用q检验。
结果 MTT比色法：缺氧组A值(0.514±0.035)与常氧组(0.373±0.010)比较差异有显著性(P<0.01)，缺氧+AM组为0.394±0.025，显著低于缺氧组(P<0.01)。
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AM对PASMC PCNA表达的影响：常氧条件下培养的PASMC PCNA呈阳性表达，阳性颗粒为棕黄色，定位于细胞核、清晰无扩散，缺氧组PASMC PCNA表达增强，表现为颗粒明显增多，分布密集、深染、广泛存在于所有核内，缺氧+AM组的PASMC PCNA阳性颗粒明显少于单纯缺氧组，着色较浅，分布较稀疏(图1～3)。图像分析显示，缺氧组平均A值为0.31±0.08，显著高于常氧组的0.17±0.04(P<0.01)，缺氧+AM组为0.17±0.05，显著低于缺氧组(P<0.01)，而与常氧组比较差异无显著性。
讨论 本组实验发现肾上腺髓质素对肺血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用，推测肾上腺髓质素具有抑制肺血管重构作用。
肺动脉高压患者血浆中AM浓度升高，在缺氧性肺动脉高压大鼠肺的结合位点增多[1]，因为AM能够降低肺动脉压[2]，抑制肺血管平滑肌增殖，我们认为，AM升高在肺动脉高压发病中起着自身代偿作用，防止肺动脉压力无限升高。
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图1 PCNA在常氧培养的PASMC的表达
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图2 PCNA在缺氧培养的PASMC的表达
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图3 PCNA在缺氧+AM培养的PASMC的表达
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作者单位：李耀军(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室)
张珍祥(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室)
徐永健(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室)
参考文献
1.Zhao L, Brown LA, Owji AA, et al. Adrenomedullin activity in chronically hypoxic rat lungs. Am J Physiol, 1996，271:622-629.
2.Lippton H, Chang JK, Ho Q, et al. Adrenomedullin dilates the pulmonary vascular bed in vivo. J Appl Physiol，1994, 76:2154-2156., http://www.100md.com