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编号:10501390
分支杆菌鉴定方法的比较研究
http://www.100md.com 《中华结核和呼吸杂志》 2000年第10期
     分支杆菌鉴定方法的比较研究

    刘金伟 匡铁吉 王金河 裴宁 宋萍 仲斌

    关键词:微菌落法;多重聚合酶链反应(PCR);分支杆菌;菌种鉴定 比较了微菌落法、多重聚合酶链反应(PCR)法和传统法用于分支杆菌临床分离物菌种鉴定的效果,现报告如下。

    材料与方法:试验菌株:(1) 标准菌株:结核分支杆菌H37RV、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疬分支杆菌、偶然分支杆菌和耻垢分支杆菌标准株,均购自北京结核病胸部肿瘤研究所。(2) 临床分离株:来自我院结核病住院患者的痰、胸液和脑脊液。

    传统分型鉴定试验:(1) 培养鉴定试验:按常规制备对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基,取试验菌株菌悬液(10-2/ml)0.1 ml接种,37 ℃培养,4周看结果。(2) 生化试验:68 ℃耐热过氧化氢酶试验、硝酸还原试验和吐温80水解试验,均按常规操作。
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    微菌落观察法:取试验菌株在37 ℃培养2~3周的斜面生长物,用无菌生理盐水配制相当于10-3 mg湿菌/ml接种液,取0.1 ml接种匡氏琼脂平皿3个,涂匀后置36 ℃含5% CO2的温箱培养3、7、12 d后分别在100倍显微镜下观察微菌形态,记录结果。

    多重PCR鉴定法:多重PCR的三对引物是:MT1和MT2、PT1和PT2、IS5和IS6,它们分别扩增表达32 000蛋白的基因序列[1]、MTP40蛋白的基因序列[2]和IS6110插入序列[3]。DNA扩增采用的PCR仪为英国Techne公司产品,型号为GeneE,操作见参考文献[4]。

    结果与讨论 三种菌种鉴定法用于分支杆菌鉴定所耗时间见表1。
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    表1 三种方法用于200株分支杆菌鉴别耗用时间比较

    鉴别方法

    鉴别内容

    平均耗时(d)

    传统法

    结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌

    28

    微菌落观察法

    结核菌群与非结核分支杆菌

    7.8

    多重PCR法

    结核、牛分支杆菌与非结核分支杆菌
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    2~3

    表2 三种方法用于分支杆菌菌型鉴别的结果比较

    方 法

    受试菌株数

    正确鉴别

    菌株数

    %

    传统法

    200

    193

    96.5

    微菌落观察法

    200
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    194

    97.0

    多重PCR法

    200

    196

    98.0

    注:经χ2检验,三种方法鉴别正确率比较P>0.05

    三种方法用于200株分支杆菌鉴定结果见表2。200株受试菌株中,有非结核分支杆菌11株,牛分支杆菌2株,其余187株均为结核分支杆菌,其中非结核分支杆菌株占5.5%。采用传统鉴定法,有4株结核分支杆菌株和2株非结核分支杆菌菌株鉴别不明确。微菌落法鉴别错误的有4株,其中2株由于平皿上有杂菌污染而错误地鉴定为非结核分支杆菌菌株。故在操作过程中严防杂菌污染,对提高微菌落法鉴定分支杆菌的准确率具有重要意义。多重PCR扩增分支杆菌DNA时产生1~3条带,其中引物MT1-MT2扩增一条500 bp的分支杆菌属特异DNA片段;引物IS5-IS6扩增一条1 000 bp长的结核分支杆菌菌群特异DNA带;引物PT1-PT2扩增一条约400 bp的结核分支杆菌种特异片段。扩增产物电泳后,结核分支杆菌DNA标本产生3条带,牛分支杆菌DNA标本产生2条带,非结核分支杆菌DNA标本产生1条带。影响多重PCR鉴定分支杆菌效果的主要因素是复性温度和Taq酶质量。多重PCR法复性温度为71 ℃,与延伸温度只差1 ℃,必须很准确。表1结果表明,采用传统法鉴定分支杆菌需28 d,与微菌落法和多重PCR法相比差异有非常显著性(P<0.001);微菌落法需7.8 d,与多重PCR法相比差异有显著性(P<0.01)。三种方法相比,多重PCR法用于分支杆菌菌种鉴定所耗时间最短,其次是微菌落法,传统法耗时最长。表2结果表明,三种方法用于分支杆菌菌种鉴定的正确率差异无显著性(P>0.05)。本研究提示,微菌落法和多重PCR法对分支杆菌菌种鉴定具有快速、准确的优点,较传统法更能满足结核病临床的需要。
, 百拇医药
    作者单位:刘金伟(100091 北京,解放军第三○九医院)

    匡铁吉(100091 北京,解放军第三○九医院)

    王金河(100091 北京,解放军第三○九医院)

    裴宁(100091 北京,解放军第三○九医院)

    宋萍(100091 北京,解放军第三○九医院)

    仲斌(100091 北京,解放军第三○九医院)

    参考文献

    1.Borremans M, de Witt L, Volckaert G, et al. Cloning, sequence determination, and expression of a 32 kilodalton protein of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, 1989, 57:3123-3130.
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    2.Parra CA, Londono LP, Del Portillo P, et al. Characterization and molecular cloning of a species-specific sequence. Infect Immun, 1991, 59:3411-3417.

    3.Thierry D, Brisson-Noel A, Vincent-Levy-Frebault V, et al. Characteristic of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS6110, and its application in diagnosis. J Clin Microbiol, 1990, 28:2668-2673.

    4.Del Patricia P, Thomas MC, Martine E, et al. Multiprimer PCR system for differential identification of Mycobacteria in clinical samples. J Clin Microbiol, 1996, 34:324-328., http://www.100md.com