MTT微量稀释法检测头癣分离株对抗真菌药的MIC值
http://www.100md.com
中华皮肤科杂志 2000年第33卷第5期
MTT微量稀释法检测头癣分离株对抗真菌药的MIC值
于长平 张福仁 赵毅 程焕明
关键词：MTT微量肉汤稀释法；头癣；特比萘芬；伊曲康唑；MIC
为探索敏感而可靠的丝状真菌药敏试验方法，我们用MTT微量肉汤稀释法测定了38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值。
一、材料与方法
(一)实验材料：
1.受试菌种：犬小孢子菌(M.canis)17株，须癣毛癣菌(T.mentagrophyte)15株，红色毛癣菌(T.rubrum)4株，紫色毛癣菌(T.violaceum)2株。皆分离自头癣患者，纯化后做小培养，根据菌落和显微镜下特征、玉米粉吐温琼脂试验、尿素酶试验等鉴定菌种，置4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
2.药物：特比萘芬原粉由齐鲁制药厂药物研究所提供，批号98-05-10。伊曲康唑原粉来自西安杨森制药有限公司，生产日期98-09-10。
3.培养基：沙堡培养基、玉米粉培养基和马铃薯培养基(PDA)按文献配制。新鲜配制RPMI1640培养基(Sigma公司)，缓冲液用3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS，34.54g/L，Sigma公司)，1NNaOH调pH至7.0，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
4.显色剂：MTT(上海伯奥生物科技公司)，配成0.5%溶液。
5.甲溶解液：十二烷基硫酸钠(SDS，AmreCo进口分装)，二甲基甲酰胺(DMF，如皋市化学试剂厂)，配成200g/LSDS-50%(V/V)DMF的甲溶解液。
(二)试验方法：
, 百拇医药 1.微量药敏板制备：将2种药物分别溶于100%二甲基亚砜，使质量浓度为0.4mg/mL，再用1640培养基稀释，然后10级倍比稀释,使起始浓度2μg/mL，终末浓度为0.0039μg/mL，对应加入无菌96孔酶标板中，每孔100μL，第11孔加不含药的1640液基100μL，第12孔加不含药液基200μL，第11孔作阳性对照、第12孔作空白对照。置-70℃冰箱备用。
2.菌液制备：将受试菌株从4℃取出，活化后转种于PDA培养基，26℃培养10d，用含0.05%吐温80的无菌生理盐水1mL注入到PDA斜面上，收集菌悬液，用1640液基调整浓度到(2～4)×104cfu/mL,置4℃备用。
3.菌液接种：药敏板从-70℃取出融化，将各菌株的菌悬液每孔加100μL，12孔不加，此步骤使菌液浓度稀释为(1～2)×104cfu/mL，药物质量浓度为0.002～1μg/mL。
4.培养、加显色剂及甲溶解液：接种菌液后药敏板置28℃培养，每天观察生长情况。阳性对照孔生长良好后，各孔加MTT20μL，放28℃温箱4h。然后于各孔加甲溶解液100μL。
, http://www.100md.com
5.结果判定：分别于加甲溶液后18h、24h、30h，用酶标仪(DG3022A型，华东电子管厂)于550nm处，以空白孔调零测各孔吸光度值，以与生长对照孔相比吸光度值下降90%以上的最低药物浓度孔为MIC终点。
1周后完全按上述方法和程序重复1次。
二、结果
阳性对照孔于培养5d时即生长良好。加入甲溶液后18h、24h和30h所测各孔吸光度值基本一致。4种皮肤癣菌对特比萘芬和伊曲康唑的MIC范围分别为0.002～0.063μg/mL和0.002～1μg/mL，均值分别为0.004μg/mL和0.006μg/mL；2种药物对各菌种的MIC值及均值见表1。
表1MTT微量稀释法测定38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值μg/mL
, 百拇医药
菌种
MIC范围
MIC均值
犬小孢子菌
特比萘芬
0.002～0.016
0.003
伊曲康唑
0.002～1
0.007
须癣毛癣菌
特比萘芬
0.002～0.063
, 百拇医药
0.005
伊曲康唑
0.002～0.063
0.004
红色毛癣菌
特比萘芬
0.002～0.008
0.003
伊曲康唑
0.002～0.004
0.003
紫色毛癣菌
, http://www.100md.com
特比萘芬
0.002～0.5
0.016
伊曲康唑
0.002～0.004
0.003
三、讨论
MTT是一种可为活细胞线粒体呼吸还原成有色产物的无色染料，产色的程度与细胞活性成正比，因此可用分光光度计或酶标仪定量测定细胞代谢活性。Jahn等[1]用MTT法进行了白念珠菌和曲霉体外药敏试验。但是过去的MTT法需将作用体系离心，去除上清液，然后加入甲溶解液，步骤较复杂。本试验首次在真菌药敏试验中应用200g/LSDS-50%(V/V)DMF作为MTT还原产物——甲的溶解液，实验发现其溶解力强，不与MTT反应，不需去除上清液，显色稳定。
, http://www.100md.com
实验中菌液接种浓度为104cfu/mL，在RPMI1640培养基中28℃培养5d皮肤癣菌即生长良好，此条件适合于皮肤癣菌体外药敏试验，与其他报道一致[1-3]。但是MTT法是测定细胞代谢活性受抑制的程度，而不是直接测定细胞数量减少的程度，因此推测培养时间可缩短到小于5d。
初步研究结果显示，特比萘芬和伊曲康唑对皮肤癣菌头癣分离株有强大的抗菌活性，可用于头癣的治疗。MTT微量稀释法测定皮肤癣菌MIC用药量少，结果定量客观，且重复性好。
作者单位：于长平(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
张福仁(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
赵毅(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
程焕明(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Jahn B, Martin E, Stueben A,et al. Susceptibility testing of Candida albicans and Aspergillus species by a simple microtiter menadione- augmented 3- (4,5- dimethyl- 2- thiazolyl)- 2,5- diphenyl- 2H- tetrazolium bromide assay, J Clin Microbiol,1995,33:661- 667.
[2]Espinel Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. J Clin Microbiol, 1997, 35: 139- 143.
[3]Hazen KC. Fungicidal versus fungistatic activity of terbinafine and itraconazole:an in vitro comparison.J Am Acad Dermatol,1998,38(5 Pt3):S37- S41., http://www.100md.com
于长平 张福仁 赵毅 程焕明
关键词：MTT微量肉汤稀释法；头癣；特比萘芬；伊曲康唑；MIC
为探索敏感而可靠的丝状真菌药敏试验方法，我们用MTT微量肉汤稀释法测定了38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值。
一、材料与方法
(一)实验材料：
1.受试菌种：犬小孢子菌(M.canis)17株，须癣毛癣菌(T.mentagrophyte)15株，红色毛癣菌(T.rubrum)4株，紫色毛癣菌(T.violaceum)2株。皆分离自头癣患者，纯化后做小培养，根据菌落和显微镜下特征、玉米粉吐温琼脂试验、尿素酶试验等鉴定菌种，置4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
2.药物：特比萘芬原粉由齐鲁制药厂药物研究所提供，批号98-05-10。伊曲康唑原粉来自西安杨森制药有限公司，生产日期98-09-10。
3.培养基：沙堡培养基、玉米粉培养基和马铃薯培养基(PDA)按文献配制。新鲜配制RPMI1640培养基(Sigma公司)，缓冲液用3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS，34.54g/L，Sigma公司)，1NNaOH调pH至7.0，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
4.显色剂：MTT(上海伯奥生物科技公司)，配成0.5%溶液。
5.甲溶解液：十二烷基硫酸钠(SDS，AmreCo进口分装)，二甲基甲酰胺(DMF，如皋市化学试剂厂)，配成200g/LSDS-50%(V/V)DMF的甲溶解液。
(二)试验方法：
, 百拇医药 1.微量药敏板制备：将2种药物分别溶于100%二甲基亚砜，使质量浓度为0.4mg/mL，再用1640培养基稀释，然后10级倍比稀释,使起始浓度2μg/mL，终末浓度为0.0039μg/mL，对应加入无菌96孔酶标板中，每孔100μL，第11孔加不含药的1640液基100μL，第12孔加不含药液基200μL，第11孔作阳性对照、第12孔作空白对照。置-70℃冰箱备用。
2.菌液制备：将受试菌株从4℃取出，活化后转种于PDA培养基，26℃培养10d，用含0.05%吐温80的无菌生理盐水1mL注入到PDA斜面上，收集菌悬液，用1640液基调整浓度到(2～4)×104cfu/mL,置4℃备用。
3.菌液接种：药敏板从-70℃取出融化，将各菌株的菌悬液每孔加100μL，12孔不加，此步骤使菌液浓度稀释为(1～2)×104cfu/mL，药物质量浓度为0.002～1μg/mL。
4.培养、加显色剂及甲溶解液：接种菌液后药敏板置28℃培养，每天观察生长情况。阳性对照孔生长良好后，各孔加MTT20μL，放28℃温箱4h。然后于各孔加甲溶解液100μL。
, http://www.100md.com
5.结果判定：分别于加甲溶液后18h、24h、30h，用酶标仪(DG3022A型，华东电子管厂)于550nm处，以空白孔调零测各孔吸光度值，以与生长对照孔相比吸光度值下降90%以上的最低药物浓度孔为MIC终点。
1周后完全按上述方法和程序重复1次。
二、结果
阳性对照孔于培养5d时即生长良好。加入甲溶液后18h、24h和30h所测各孔吸光度值基本一致。4种皮肤癣菌对特比萘芬和伊曲康唑的MIC范围分别为0.002～0.063μg/mL和0.002～1μg/mL，均值分别为0.004μg/mL和0.006μg/mL；2种药物对各菌种的MIC值及均值见表1。
表1MTT微量稀释法测定38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值μg/mL
, 百拇医药
菌种
MIC范围
MIC均值
犬小孢子菌
特比萘芬
0.002～0.016
0.003
伊曲康唑
0.002～1
0.007
须癣毛癣菌
特比萘芬
0.002～0.063
, 百拇医药
0.005
伊曲康唑
0.002～0.063
0.004
红色毛癣菌
特比萘芬
0.002～0.008
0.003
伊曲康唑
0.002～0.004
0.003
紫色毛癣菌
, http://www.100md.com
特比萘芬
0.002～0.5
0.016
伊曲康唑
0.002～0.004
0.003
三、讨论
MTT是一种可为活细胞线粒体呼吸还原成有色产物的无色染料，产色的程度与细胞活性成正比，因此可用分光光度计或酶标仪定量测定细胞代谢活性。Jahn等[1]用MTT法进行了白念珠菌和曲霉体外药敏试验。但是过去的MTT法需将作用体系离心，去除上清液，然后加入甲溶解液，步骤较复杂。本试验首次在真菌药敏试验中应用200g/LSDS-50%(V/V)DMF作为MTT还原产物——甲的溶解液，实验发现其溶解力强，不与MTT反应，不需去除上清液，显色稳定。
, http://www.100md.com
实验中菌液接种浓度为104cfu/mL，在RPMI1640培养基中28℃培养5d皮肤癣菌即生长良好，此条件适合于皮肤癣菌体外药敏试验，与其他报道一致[1-3]。但是MTT法是测定细胞代谢活性受抑制的程度，而不是直接测定细胞数量减少的程度，因此推测培养时间可缩短到小于5d。
初步研究结果显示，特比萘芬和伊曲康唑对皮肤癣菌头癣分离株有强大的抗菌活性，可用于头癣的治疗。MTT微量稀释法测定皮肤癣菌MIC用药量少，结果定量客观，且重复性好。
作者单位：于长平(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
张福仁(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
赵毅(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
程焕明(250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所)
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Jahn B, Martin E, Stueben A,et al. Susceptibility testing of Candida albicans and Aspergillus species by a simple microtiter menadione- augmented 3- (4,5- dimethyl- 2- thiazolyl)- 2,5- diphenyl- 2H- tetrazolium bromide assay, J Clin Microbiol,1995,33:661- 667.
[2]Espinel Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. J Clin Microbiol, 1997, 35: 139- 143.
[3]Hazen KC. Fungicidal versus fungistatic activity of terbinafine and itraconazole:an in vitro comparison.J Am Acad Dermatol,1998,38(5 Pt3):S37- S41., http://www.100md.com