糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究
糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究
葛坚 林明楷 卓业鸿 郑健梁
摘 要 目的 探索糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法及超微结构的特点。方法 从小梁切除术中取得的巩膜内板层，应用组织学培养方法进行患者小梁细胞体外培养及鉴定，并将糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞与正常小梁细胞的超微结构进行分析和比较。结果 糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞经鉴定确为小梁细胞，但与正常小梁细胞相比，其细胞的微绒毛、吞饮小泡及胞浆的溶酶体含量较少。结论 糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养成功使小梁细胞培养体系更加完善，糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞超微结构的改变可能是青光眼发病的细胞基础。
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关键词：糖皮质激素类；青光眼；小梁网；细胞，培养的；显微镜检查，电子
小梁细胞体外培养研究现已成为青光眼发病机制研究中最热门的课题，许多类型的青光眼如原发开角型青光眼、糖皮质激素性青光眼等均表现出一定的细胞学基础。如果能从青光眼患者房水流出通道获得小梁细胞，则可提供一独特的机会来研究青光眼发病的细胞机制和可能的治疗方法。几年来，我们在小梁细胞体外培养成功的基础上，进行糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究，现将结果报告如下。
材料和方法
一、材料
1.组织块：来源于中山眼科中心青光眼专业确诊并行小梁切除术的糖皮质激素性青光眼患者，从小梁切除术中取得的带小梁的巩膜内板层组织块。糖皮质激素性青光眼的诊断标准：明确用糖皮质激素滴眼液病史，连续用药至少3个月，用量为0.1%地塞米松滴眼液10支,每支10 ml；房角开放，色素较多；特征性的晶状体后囊下混浊;外周血淋巴细胞糖皮质激素受体结合位点较高[1]；有典型的青光眼视功能损害，并与用药史及基础眼压一致；病情进展较快。
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2.已鉴定的正常小梁细胞。
3.主要试剂：DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物研究所)，电镜固定液，电镜染液，免疫组化试剂盒(华美生物工程公司)，兔抗人纤维连接蛋白单克隆抗体(anti-fibronectin，Anti-FN),兔抗人层粘连蛋白单克隆抗体(anti-laminin， Anti-LN)，兔抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(anti-neuron specific enolase， Anti-NSE)(美国Dako公司)。
4.主要仪器设备：CO2培养箱(美国Forma公司)，培养瓶，倒置相差显微镜，超薄切片机，透射电镜。
二、方法
1.细胞培养：将从小梁切除术中取得的带小梁的巩膜内板层组织块放入取材液中，在移入培养瓶之前，确认组织块内皮面并将小梁面贴壁，当贴壁确切后，加入DMEM培养基，其中含20%胎牛血清、1×105 IU/L青霉素及100 ng/L链霉素。置于37℃、体积分数为0.05的CO2、体积分数为0.95的空气及一定湿度的培养箱中培养。每5～7天换液1次,约2周时细胞长出，细胞局部融合后，用0.25%胰蛋白酶消化后传代。
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2.小梁细胞鉴定：用鉴定正常小梁细胞的方法[2]，取第3代融合细胞，通过形态学(光镜、电镜)，免疫组织化学方法(Anti-LN、Anti-FN、Anti-NSE染色)予以鉴定。做免疫组化前，将融合生长的小梁细胞用胰酶消化，滴于培养瓶中的盖玻片上，置于培养箱中培养3天，染色前用PBS或Hanks液充分洗涤，纯冷丙酮固定10～20 min，制成细胞铺片。
3.超微结构研究：分别收集糖皮质激素性青光眼患者和正常的体外培养的第4代小梁细胞，离心、固定，切片，染色，透射电镜观察，并将两组细胞的超微结构进行比较分析。
结果
一、小梁细胞生长过程
糖皮质激素性青光眼患者的小梁细胞自巩膜组织块中长出约需2周，原代细胞生长缓慢，约2～3周方达到局部融合。小梁细胞的形态呈三角形、星形、不规则形，细胞体积大，多突起；细胞核呈圆形、椭圆形，位于细胞的中央，核仁明显。原代细胞形态略不一致，传 2或 3代后细胞形态渐一致，细胞融合时呈旋涡状，细胞体紧密相接，但无重叠生长(图1)。
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二、小梁细胞鉴定
电镜下培养的糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞表面有绒毛突起，细胞间有缝隙连接和紧密连接，细胞器多，细胞核质分布不均，核仁明显且有多个。免疫组织化学染色(Anti-LN、Anti-FN、Anti-NSE染色)均为阳性(图2)。
三、小梁细胞超微结构改变
在比较糖皮质激素性青光眼患者和正常人小梁细胞时，我们发现两种细胞的光镜形态及免疫组化特性极为相似；电镜观察可见患者小梁细胞虽保持微绒毛、吞饮小泡、长的缝隙连接、多核仁等结构，但细胞的微绒毛、吞饮小泡、胞浆的溶酶体等均较正常人小梁细胞减少(图3,4)。
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图1 糖皮质激素性青光眼未融合的小梁细胞 绿色滤光片×100 图2 糖皮质激素性青光眼小梁细胞免疫组化染色阳性 Anti-NSE×400 图3 糖皮质激素性青光眼小梁细胞的超微结构 ×16 000 图4 正常人小梁细胞的超微结构 ×20 000
讨论
人类的房水流出途径包括经小梁网的Schlemm管途径和经睫状体上腔与脉络膜上腔的葡萄膜巩膜途径，而Schlemm管途径最为重要[3]。小梁细胞的数量、结构和功能的改变是开角型青光眼发病的细胞学基础[4-6]。小梁细胞充当流出道的内皮细胞，作为结缔组织细胞参与小梁网不同部位细胞外基质的分泌和代谢，作为吞噬细胞可清除引起房水流出口阻塞的碎屑；小梁细胞功能活动的异常将导致房水流畅性的改变，引起眼内压升高[7]。由于从青光眼患者获得的小梁细胞，带有更多的疾病信息，对这些小梁细胞的研究所得的结论将更准确、客观地反映疾病的发生过程，因而青光眼小梁细胞体外培养研究在青光眼发病机制的研究中作用更加重大。
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总结近年的培养经验，我们认为糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养与正常人小梁细胞培养相似，仅取材和接种方法不同，取材是细胞培养的关键步骤。小梁组织仅存在于房角的狭窄区域，在行小梁切除术时，巩膜内板层应尽可能向后，直至暴露出带色素的小梁区；组织块取出后，应避免手术器械直接损害小梁区；小梁组织上的色素作为组织块内皮面的标记，以保证接种时小梁面贴壁。由于小梁细胞的损害与青光眼的病程有关，晚期或绝对期患者小梁组织上存活的小梁细胞可能较少，培养不易成功；老年人小梁细胞的生命力不够强，因而选择病情轻、年龄小的患者，培养容易成功。另外，抗代谢药物在手术中的应用，对培养结果也有影响，应避免药物污染的器械接触组织块或巩膜瓣下使用这类药物。
由于小梁细胞属内皮细胞，无独特的标志，培养的小梁细胞至今仍然未有完善的鉴别标准和分离、纯化方法，因此培养的小梁细胞必须与邻近可能出现的成纤维细胞、角膜内皮细胞等污染细胞相鉴别[8]。我们将糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞，经光镜、电镜形态和免疫组化鉴定为小梁细胞。
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通过比较分析，我们发现糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞的超微结构发生改变。正常的在体小梁细胞具有活泼的吞噬功能[9,10]，以清除小梁网上的色素、大分子物质、组织碎屑、氧化产物等，保持房水流出道的通畅，而吞饮作用则是小梁细胞转运房水的主要形式；小梁细胞的功能活动与细胞表面的微绒毛、胞内框架结构和胞浆溶酶体等有关。糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞的微绒毛、吞饮小泡、胞浆中的溶酶体较正常人小梁细胞减少，这些超微结构的改变是否提示小梁细胞的吞噬和吞饮功能下降，进而引起细胞外基质堆积和流出阻力增大，导致眼内压升高，尚待进一步研究。
总之，只要选材适当、取材准确，小梁切除术所得的组织块同样可以用于小梁细胞体外培养；糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法的建立，不但使小梁细胞培养体系更加完善，且由于青光眼患者的小梁细胞能更准确、更客观地反映疾病的发生过程，因而在青光眼发病机制研究中必将起着更加重大的作用。
作者单位：葛坚(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
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林明楷(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
卓业鸿(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
郑健梁(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
参考文献
1，Yehong Zhuo,Jian Ge,Yan Guo.Characterization of glucocorticoid receptor on lymphocytes in Chinese patients with glucocorticoid-induced glaucoma.Eye Science ,1998,14:145-148.
2，葛坚，卓业鸿.人眼小梁细胞体外培养及生物学特性研究.眼科学报,1996,12:64-69.
, http://www.100md.com
3，Bill A, Mepea O. Mechanisms and routes of aqueous humor drainage. In: Albert DM, Jakobiec FA, eds. Principles and practice of ophthalmology: basic sciences. Philadelphia: Saunders,1994.206-226.
4，Fine BS,Yanoff M, Stone RA.A clinicopathologic study of four cases of primary open-angle glaucoma compared to normal eyes. Am J Ophthalmol,1981,91:88-105.
5，Rohen JW. Why is intraocular pressure elevated in chronic simple glaucoma? Ophthalmology, 1983,90:758-765.
, http://www.100md.com
6，Alvarado J, Murphy C, Polansky J, et al. Age-related changes in trabecular meshwork cellularity. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1981,21:714-727.
7，Polansky JR, Alvarado JA. Cellular mechanisms influencing the aqueous humor outflow pathway. In: Albert DM, Jakobiec FA,eds. Principles and practice of ophthalmology : basic sciences. Philadelphia:Saunders,1994.226-251.
8，Polansky JR, Weinreb RN, Baxter JD, et al. Human trabecular cells: I.establishment in tissue culture and growth characteristics. Invest Ophthalmol Vis Sic,1979,18:1043-1049.
9，杨新光,李美玉. 牛眼小梁网细胞体外培养及吞噬功能的研究. 中华眼科杂志,1996，32:136-139.
10，White VA, Grierson I. Phagocytosis in cultured bovine trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci,1988,29 Suppl:125-128., 百拇医药
葛坚 林明楷 卓业鸿 郑健梁
摘 要 目的 探索糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法及超微结构的特点。方法 从小梁切除术中取得的巩膜内板层，应用组织学培养方法进行患者小梁细胞体外培养及鉴定，并将糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞与正常小梁细胞的超微结构进行分析和比较。结果 糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞经鉴定确为小梁细胞，但与正常小梁细胞相比，其细胞的微绒毛、吞饮小泡及胞浆的溶酶体含量较少。结论 糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养成功使小梁细胞培养体系更加完善，糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞超微结构的改变可能是青光眼发病的细胞基础。
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关键词：糖皮质激素类；青光眼；小梁网；细胞，培养的；显微镜检查，电子
小梁细胞体外培养研究现已成为青光眼发病机制研究中最热门的课题，许多类型的青光眼如原发开角型青光眼、糖皮质激素性青光眼等均表现出一定的细胞学基础。如果能从青光眼患者房水流出通道获得小梁细胞，则可提供一独特的机会来研究青光眼发病的细胞机制和可能的治疗方法。几年来，我们在小梁细胞体外培养成功的基础上，进行糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究，现将结果报告如下。
材料和方法
一、材料
1.组织块：来源于中山眼科中心青光眼专业确诊并行小梁切除术的糖皮质激素性青光眼患者，从小梁切除术中取得的带小梁的巩膜内板层组织块。糖皮质激素性青光眼的诊断标准：明确用糖皮质激素滴眼液病史，连续用药至少3个月，用量为0.1%地塞米松滴眼液10支,每支10 ml；房角开放，色素较多；特征性的晶状体后囊下混浊;外周血淋巴细胞糖皮质激素受体结合位点较高[1]；有典型的青光眼视功能损害，并与用药史及基础眼压一致；病情进展较快。
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2.已鉴定的正常小梁细胞。
3.主要试剂：DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物研究所)，电镜固定液，电镜染液，免疫组化试剂盒(华美生物工程公司)，兔抗人纤维连接蛋白单克隆抗体(anti-fibronectin，Anti-FN),兔抗人层粘连蛋白单克隆抗体(anti-laminin， Anti-LN)，兔抗人神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(anti-neuron specific enolase， Anti-NSE)(美国Dako公司)。
4.主要仪器设备：CO2培养箱(美国Forma公司)，培养瓶，倒置相差显微镜，超薄切片机，透射电镜。
二、方法
1.细胞培养：将从小梁切除术中取得的带小梁的巩膜内板层组织块放入取材液中，在移入培养瓶之前，确认组织块内皮面并将小梁面贴壁，当贴壁确切后，加入DMEM培养基，其中含20%胎牛血清、1×105 IU/L青霉素及100 ng/L链霉素。置于37℃、体积分数为0.05的CO2、体积分数为0.95的空气及一定湿度的培养箱中培养。每5～7天换液1次,约2周时细胞长出，细胞局部融合后，用0.25%胰蛋白酶消化后传代。
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2.小梁细胞鉴定：用鉴定正常小梁细胞的方法[2]，取第3代融合细胞，通过形态学(光镜、电镜)，免疫组织化学方法(Anti-LN、Anti-FN、Anti-NSE染色)予以鉴定。做免疫组化前，将融合生长的小梁细胞用胰酶消化，滴于培养瓶中的盖玻片上，置于培养箱中培养3天，染色前用PBS或Hanks液充分洗涤，纯冷丙酮固定10～20 min，制成细胞铺片。
3.超微结构研究：分别收集糖皮质激素性青光眼患者和正常的体外培养的第4代小梁细胞，离心、固定，切片，染色，透射电镜观察，并将两组细胞的超微结构进行比较分析。
结果
一、小梁细胞生长过程
糖皮质激素性青光眼患者的小梁细胞自巩膜组织块中长出约需2周，原代细胞生长缓慢，约2～3周方达到局部融合。小梁细胞的形态呈三角形、星形、不规则形，细胞体积大，多突起；细胞核呈圆形、椭圆形，位于细胞的中央，核仁明显。原代细胞形态略不一致，传 2或 3代后细胞形态渐一致，细胞融合时呈旋涡状，细胞体紧密相接，但无重叠生长(图1)。
, 百拇医药
二、小梁细胞鉴定
电镜下培养的糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞表面有绒毛突起，细胞间有缝隙连接和紧密连接，细胞器多，细胞核质分布不均，核仁明显且有多个。免疫组织化学染色(Anti-LN、Anti-FN、Anti-NSE染色)均为阳性(图2)。
三、小梁细胞超微结构改变
在比较糖皮质激素性青光眼患者和正常人小梁细胞时，我们发现两种细胞的光镜形态及免疫组化特性极为相似；电镜观察可见患者小梁细胞虽保持微绒毛、吞饮小泡、长的缝隙连接、多核仁等结构，但细胞的微绒毛、吞饮小泡、胞浆的溶酶体等均较正常人小梁细胞减少(图3,4)。
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图1 糖皮质激素性青光眼未融合的小梁细胞 绿色滤光片×100 图2 糖皮质激素性青光眼小梁细胞免疫组化染色阳性 Anti-NSE×400 图3 糖皮质激素性青光眼小梁细胞的超微结构 ×16 000 图4 正常人小梁细胞的超微结构 ×20 000
讨论
人类的房水流出途径包括经小梁网的Schlemm管途径和经睫状体上腔与脉络膜上腔的葡萄膜巩膜途径，而Schlemm管途径最为重要[3]。小梁细胞的数量、结构和功能的改变是开角型青光眼发病的细胞学基础[4-6]。小梁细胞充当流出道的内皮细胞，作为结缔组织细胞参与小梁网不同部位细胞外基质的分泌和代谢，作为吞噬细胞可清除引起房水流出口阻塞的碎屑；小梁细胞功能活动的异常将导致房水流畅性的改变，引起眼内压升高[7]。由于从青光眼患者获得的小梁细胞，带有更多的疾病信息，对这些小梁细胞的研究所得的结论将更准确、客观地反映疾病的发生过程，因而青光眼小梁细胞体外培养研究在青光眼发病机制的研究中作用更加重大。
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总结近年的培养经验，我们认为糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养与正常人小梁细胞培养相似，仅取材和接种方法不同，取材是细胞培养的关键步骤。小梁组织仅存在于房角的狭窄区域，在行小梁切除术时，巩膜内板层应尽可能向后，直至暴露出带色素的小梁区；组织块取出后，应避免手术器械直接损害小梁区；小梁组织上的色素作为组织块内皮面的标记，以保证接种时小梁面贴壁。由于小梁细胞的损害与青光眼的病程有关，晚期或绝对期患者小梁组织上存活的小梁细胞可能较少，培养不易成功；老年人小梁细胞的生命力不够强，因而选择病情轻、年龄小的患者，培养容易成功。另外，抗代谢药物在手术中的应用，对培养结果也有影响，应避免药物污染的器械接触组织块或巩膜瓣下使用这类药物。
由于小梁细胞属内皮细胞，无独特的标志，培养的小梁细胞至今仍然未有完善的鉴别标准和分离、纯化方法，因此培养的小梁细胞必须与邻近可能出现的成纤维细胞、角膜内皮细胞等污染细胞相鉴别[8]。我们将糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞，经光镜、电镜形态和免疫组化鉴定为小梁细胞。
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通过比较分析，我们发现糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞的超微结构发生改变。正常的在体小梁细胞具有活泼的吞噬功能[9,10]，以清除小梁网上的色素、大分子物质、组织碎屑、氧化产物等，保持房水流出道的通畅，而吞饮作用则是小梁细胞转运房水的主要形式；小梁细胞的功能活动与细胞表面的微绒毛、胞内框架结构和胞浆溶酶体等有关。糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞的微绒毛、吞饮小泡、胞浆中的溶酶体较正常人小梁细胞减少，这些超微结构的改变是否提示小梁细胞的吞噬和吞饮功能下降，进而引起细胞外基质堆积和流出阻力增大，导致眼内压升高，尚待进一步研究。
总之，只要选材适当、取材准确，小梁切除术所得的组织块同样可以用于小梁细胞体外培养；糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法的建立，不但使小梁细胞培养体系更加完善，且由于青光眼患者的小梁细胞能更准确、更客观地反映疾病的发生过程，因而在青光眼发病机制研究中必将起着更加重大的作用。
作者单位：葛坚(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
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林明楷(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
卓业鸿(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
郑健梁(510060 广州，中山医科大学中山眼科中心)
参考文献
1，Yehong Zhuo,Jian Ge,Yan Guo.Characterization of glucocorticoid receptor on lymphocytes in Chinese patients with glucocorticoid-induced glaucoma.Eye Science ,1998,14:145-148.
2，葛坚，卓业鸿.人眼小梁细胞体外培养及生物学特性研究.眼科学报,1996,12:64-69.
, http://www.100md.com
3，Bill A, Mepea O. Mechanisms and routes of aqueous humor drainage. In: Albert DM, Jakobiec FA, eds. Principles and practice of ophthalmology: basic sciences. Philadelphia: Saunders,1994.206-226.
4，Fine BS,Yanoff M, Stone RA.A clinicopathologic study of four cases of primary open-angle glaucoma compared to normal eyes. Am J Ophthalmol,1981,91:88-105.
5，Rohen JW. Why is intraocular pressure elevated in chronic simple glaucoma? Ophthalmology, 1983,90:758-765.
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6，Alvarado J, Murphy C, Polansky J, et al. Age-related changes in trabecular meshwork cellularity. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1981,21:714-727.
7，Polansky JR, Alvarado JA. Cellular mechanisms influencing the aqueous humor outflow pathway. In: Albert DM, Jakobiec FA,eds. Principles and practice of ophthalmology : basic sciences. Philadelphia:Saunders,1994.226-251.
8，Polansky JR, Weinreb RN, Baxter JD, et al. Human trabecular cells: I.establishment in tissue culture and growth characteristics. Invest Ophthalmol Vis Sic,1979,18:1043-1049.
9，杨新光,李美玉. 牛眼小梁网细胞体外培养及吞噬功能的研究. 中华眼科杂志,1996，32:136-139.
10，White VA, Grierson I. Phagocytosis in cultured bovine trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci,1988,29 Suppl:125-128., 百拇医药