低氧高二氧化碳对肺动脉内皮素1基因表达的影响
低氧高二氧化碳对肺动脉内皮素1基因表达的影响
王良兴 陈少贤 徐正介 喻林升 谢于鹏 陈彦凡 王卫 王群姬 张洪勤
摘 要 目的 探讨内皮素1(ET-1)基因表达变化在慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)性肺动脉高压形成中的作用及川芎嗪的影响。方法 将SD大鼠分为正常对照组(A组)，4周低O2高CO2组(B组)，4周低O2高CO2+川芎嗪组(C组)。采用透射电镜、图像分析、原位杂交等方法，研究4周低O2高CO2和川芎嗪对大鼠肺动脉平均压(mPAP)、颈动脉平均压(mCAP)、肺细小动脉显微和超微结构ET-1及ET-1基因表达的影响。结果 (1) B组mPAP与A组比较，差异有显著性(P<0.01)；C组mPAP与B组比较，差异有显著性(P<0.01)，3组间mCAP比较，差异无显著性(P>0.05)。B组血浆ET-1浓度与A组比较，差异有显著性(P<0.01)；C组与B组比较，差异有显著性(P<0.01)；(2) 光镜下肺细小动脉管壁面积/管总面积比值(WA/TA)、肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度(SMC)B组与A组比较，差异有显著性(P均<0.01)，C组WA/TA、SMC与B组比较，差异有显著性(P均<0.01)；电镜下，B组肺细小动脉中膜平滑肌细胞增生，面积增大，染色质增多，外膜胶原纤维密集，C组大鼠肺细小动脉中膜平滑肌细胞和外膜胶原纤维增生与B组比较明显减轻；(3) 原位杂交发现，B组Ⅰ级(直径>200 μm)、Ⅱ级(直径50～200 μm)、Ⅲ级(直径<50 μm)肺细小动脉ET-1 mRNA平均吸光度值与A组比较差异有显著性(P均<0.01)，C组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肺细小动脉ET-1 mRNA平均吸光度值与B组比较差异有显著性(P均<0.01)。结论 肺动脉ET-1基因表达增强为慢性低O2高CO2性肺动脉高压形成的重要机制，川芎嗪抑制肺动脉ET-1基因表达可能为其抑制慢性低O2高CO2性肺动脉高压的机制之一。
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关键词：川芎嗪；缺氧；高碳酸血症；肺动脉；内皮素；基因
慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病的中心环节是肺动脉高压的形成，阐明肺动脉高压的形成机制以及寻求理想的抑制肺动脉高压药物一直是COPD、肺心病防治的重要研究课题。我们采用慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)肺动脉高压大鼠模型，研究肺动脉内皮素1(ET-1)基因表达变化在肺动脉高压形成和肺血管结构重建中的作用及川芎嗪的影响。
材料与方法
一、动物模型的制备
雄性SD大鼠(温州医学院实验动物中心提供)30只，体重180～280 g，适应性饲养1周后，随机分为3组：(1) 正常对照组(A组，10只)：作为常压氧下的对照；(2) 低O2高CO2 4周组(B组，10只)：置于常压低O2高CO2舱中，吸入气O2浓度为8.5%～11.0%，CO2浓度为5.0%～6.5%，每日10 h，其余时间与正常对照组在同一室内，室温15～20 ℃，相对湿度50%～70%饲养到规定时间；(3) 低O2高CO2 4周+川芎嗪组(C组，10只)：川芎嗪购自无锡市第七制药厂，批号9610051，80 mg*kg-1*d-1，腹腔注射，其余条件同(2)组。
, 百拇医药
二、肺动脉和颈动脉平均压的测定
用1%戊巴比妥钠，腹腔注射行全身麻醉，仰卧固定，作颈正中切口，自颈外静脉插管至肺动脉并行颈总动脉插管，分别连接YL-3和YL-4型压力传感器，输入SJ-42型生理记录仪测取平均肺动脉压(mPAP)和平均颈动脉压(mCAP)。
三、血浆ET-1的测定
放射免疫法测定动脉血ET-1浓度(北京美迪科生物技术有限公司的试剂盒)，严格按说明书操作。
四、光镜标本制作及观察
放血处死大鼠，取出肺组织，10%缓冲甲醛溶液固定，取固定后的肺，左肺门水平横切，做石蜡切片，厚约5 μm，行HE染色、弹力纤维及VG染色，每只大鼠选1张肺组织切片，每张切片随机选取直径约100～200 μm肺细小动脉5支，用图像分析仪心肺血管分析软件(华东理工大学研制)测定平均血管总面积(外弹力板以内)、血管腔面积(内膜表面以内)以计算相对比值肺细小动脉管壁面积/管总面积(WA/TA)，并测定肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度(SMC，每1 000平方微米中细胞核数)。
, 百拇医药
五、电镜标本制作及观察
大鼠放血处死立即完整取出肺，在肺门水平横切面切取1 mm×1 mm×1 mm大小肺组织各2块，用2.5%戊二醛作前固定，1%锇酸作后固定，Epon 812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，常规染色，H-600型透射电镜观察肺小动脉超微结构改变，并摄片。
六、原位杂交
1.寡核苷酸探针：采用地高辛标记的ET-1多相寡核苷酸探针(武汉博士德生物工程有限公司)，ET-1寡核苷酸探针序列来源于：鼠基因U35233 GI1244501，(1)34-68(探针序列CTAAT AAACG GGTAC TAGAA GAGAG ACGAC AAGCA)；(2) 231-265(探针序列GGTGG ACCTG TAGTA GACCC AGTTG TGAGG GCTCG)。
2.杂交过程 放血处死大鼠，取出肺组织，迅速以10%缓冲甲醛固定，常规脱水，透明并石蜡包埋，连续切片，标本经二甲苯脱蜡至水，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，滴加地高辛标记的ET-1寡核苷酸探针杂交，封闭，滴加小鼠抗地高辛，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，滴加SABC，二氨基丁酸(DAB)显色，苏木素复染，阳性结果呈棕黄色。每组随机选5只大鼠，每只大鼠选1张肺组织切片，每张切片随机选取直径>200 μm(Ⅰ级)、直径50～200 μm(Ⅱ级)、直径<50 μm(Ⅲ级)的肺内动脉各5支，用图像分析仪心肺血管分析软件(华东理工大学研制)检测上述3级肺内动脉管壁平均吸光度值作为管壁ET-1 mRNA的相对含量。
, 百拇医药
统计学处理：数据以X±s表示，采用spss软件进行组间t检验
结果
一、三组mPAP、mCAP、WA/TA、SMC及ET-1的比较
4周低O2高CO2和川芎嗪对大鼠mPAP、mCAP、WA/TA、SMC及血浆ET-1的影响见表1。
二、慢性低O2高CO2和川芎嗪对大鼠肺细小动脉超微结构的影响
表1 三组mPAP、mCAP、WA/TA、SMC、ET-1浓度的变化(X±s)
组 别
只数
, 百拇医药
mPAP(mm Hg)
mCAP(mm Hg)
WA/TA(%)
SMC
ET-1(ng/L)
正常对照组
8
14.4±1.7
133±7
30± 4.4
6.1±1.3
96±35
, 百拇医药
低O2高CO2组
8
21.2±1.5△
132±5
53±10.0△
9.9±2.7△
254±29△
低O2高CO2+川芎嗪组
8
16.0±3.0*
, 百拇医药
134±8
34± 2.4*
6.4±1.0*
167±30*
注：各组入舱饲养大鼠为10只，实验过程大鼠损耗，实测数据各组鼠数为8只(下同)；与对照组比较△P<0.01；与低O2高CO2组比较
* P<0.01
电镜下发现，正常对照组大鼠肺细小动脉内膜、中膜、外膜清晰，内皮细胞扁平，中膜有1～2层环形平滑肌，平滑肌细胞间有散在的胶原纤维，外膜为疏松的结缔组织，有少量纤维母细胞和胶原纤维。慢性低O2高CO2大鼠肺细小动脉内皮细胞向管腔内突起，呈立方或柱状上皮，中膜平滑肌细胞增生，面积增大呈立方形，核粗大染色质增多，外膜胶原纤维高度密集呈束状。慢性低O2高CO2+川芎嗪组大鼠肺细小动脉内皮细胞基本恢复扁平，中膜平滑肌细胞增生减轻，面积变小，外膜胶原纤维明显减少。
, 百拇医药
三、三组肺细小动脉ET-1 mRNA相对含量比较
慢性低O2高CO2和川芎嗪对大鼠肺动脉ET-1基因表达的影响见表2。
表2 各组肺细小动脉ET-1 mRNA相对含量变化(X±s)
组别
只数
ET-1 mRNA平均吸光度值
Ⅰ级肺
内动脉
Ⅱ级肺
内动脉
, http://www.100md.com Ⅲ级肺
内动脉
正常对照组
8
0.068±
0.014
0.060±
0.012
0.057±
0.011
低O2高CO2组
8
, 百拇医药 0.105±
0.026△
0.089±
0.008△
0.084±
0.008△
低O2高CO2+
川芎嗪组
8
0.076±
0.016*
, 百拇医药
0.065±
0.013*
0.058±
0.011*
注：与对照组比较△P<0.01；与低O2高CO2组比较*P<0.01讨论
近年来发现内皮素为目前已知最强的缩血管物质，在肺动脉高压的发生以及肺血管结构重建中发挥着重要作用[1]，但以往报道有关这方面的实验研究大多采用单纯缺O2所致肺动脉高压动物模型，临床上COPD患者通气功能障碍常导致肺泡低O2和CO2潴留，而高CO2在肺动脉高压形成中起着一定的作用[2]。因此我们的实验采用本研究室先期建立的慢性低O2高CO2性肺动脉高压动物模型，探讨ET-1在肺动脉高压形成中的作用及川芎嗪的影响。
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本组实验发现，慢性低O2高CO2大鼠较正常对照组肺动脉压力明显升高。光镜下，慢性低O2高CO2大鼠肺细小动脉管壁明显增厚、平滑肌细胞核密度增高，电镜下肺细小动脉中膜平滑肌细胞增生、面积增大、染色质增多、外膜胶原纤维高度密集，提示4周低O2高CO2导致大鼠肺动脉高压和肺动脉结构重建。
本组实验发现，慢性低O2高CO2大鼠血浆ET-1浓度较正常对照组明显升高，原位杂交发现，慢性低O2高CO2组大鼠肺细小动脉ET-1 mRNA表达较正常对照组明显增强，据报道，内皮素具有强烈收缩肺动脉[3]、刺激肺动脉平滑肌细胞增生[4]和促进肺动脉外膜纤维母细胞及胶原纤维增生的作用[5，6]，因此推测肺动脉ET-1的合成分泌增多可能为慢性低O2高CO2引起肺动脉高压和肺血管结构重建的重要原因。
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近年来川芎嗪在抑制肺动脉高压方面的作用备受关注。本组实验发现，慢性低O2高CO2+川芎嗪组大鼠与慢性低O2高CO2组比较，mPAP明显下降，mCAP无明显改变，提示川芎嗪可预防慢性低O2高CO2性肺动脉高压的形成而对体循环压力无明显影响，即对肺动脉压力具有选择性抑制作用，光镜下发现，慢性低O2高CO2+川芎嗪组WA/TA和SMC较慢性低O2高CO2组明显减低，电镜下发现川芎嗪可明显抑制由慢性低O2高CO2引起的肺细小动脉中膜平滑肌的增生和外膜胶原纤维的堆积，提示川芎嗪具有抑制慢性低O2高CO2大鼠的肺血管结构重建作用。
本组实验进一步发现，川芎嗪可减低慢性低O2高CO2肺动脉高压大鼠血浆ET-1浓度和肺细小动脉ET-1基因的表达，因此推测川芎嗪减少肺动脉内皮素的合成可能为其抑制慢性低O2高CO2性肺动脉高压和肺血管结构重建的重要作用机制之一。
, 百拇医药
图1 电镜显示4周低O2高CO2组大鼠肺细小动脉内皮细胞向管腔内突起，呈立方或柱状上皮，中膜
平滑肌细胞面积增大，呈立方形，核粗大，染色质增多 ×8 000
图2 电镜显示4周低O2高CO2
组大鼠肺细小动脉外膜胶原纤维高度密集，呈束状 ×8 000
图3 ET-1原位杂交显示4周正常对
, 百拇医药
照组大鼠肺细小动脉管壁棕黄色染色浅淡 苏木素复染 ×160
图4 ET-1原位杂交显示4周低O2
高CO2组大鼠肺细小动脉管壁染色明显增强(棕黄色) 苏木素复染 ×160
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(398530)
作者单位：王良兴(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
陈少贤(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
徐正介(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
, 百拇医药
谢于鹏(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
陈彦凡(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
王卫(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
喻林升(325000，温州医学院附属第一医院病理科)
王群姬(325000，温州医学院附属第一医院病理科)
张洪勤(分子生物学研究中心)
参考文献
1.Nakanishi K, Tajima F, Nakata Y, et al. Expression of endothelin-1 in rats developing hypobaric hypixia-induced pulmonary hypertension. Lab Invest, 1999, 79:1347-1357.
, 百拇医药
2.Myers JL, Domkwski PW, Wang Y, et al. Sympathetic blockade blunts hypercapnic pulmonary arterial vasoconstriction in newborn piglets. Eur J Cardiothorac Surg, 1998, 13:298-305.
3.Luscher TF. Endothelin: Systemic arterial and pulmonary effects of a new peptide with potent biologic properties. Am Rev Respir Dis, 1992, 146:56-60.
4.Janakider K, Fisher MA, Delvecchio PJ, et al. Endothelin-1 stimulates DNA synthesis and proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol, 1992, 263:1295-1301.
, 百拇医药
5.Dawes KE. Characterization of fibroblast mitogens and chemoattractants produced by endothelial cells exposed to hypoxia. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10:552-559.
6.Mansoor AM, Honda M, Saida K, et al. Endothelin induced collagen remodeling in experimental pulmomary hypertension. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 215:981-986., 百拇医药
王良兴 陈少贤 徐正介 喻林升 谢于鹏 陈彦凡 王卫 王群姬 张洪勤
摘 要 目的 探讨内皮素1(ET-1)基因表达变化在慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)性肺动脉高压形成中的作用及川芎嗪的影响。方法 将SD大鼠分为正常对照组(A组)，4周低O2高CO2组(B组)，4周低O2高CO2+川芎嗪组(C组)。采用透射电镜、图像分析、原位杂交等方法，研究4周低O2高CO2和川芎嗪对大鼠肺动脉平均压(mPAP)、颈动脉平均压(mCAP)、肺细小动脉显微和超微结构ET-1及ET-1基因表达的影响。结果 (1) B组mPAP与A组比较，差异有显著性(P<0.01)；C组mPAP与B组比较，差异有显著性(P<0.01)，3组间mCAP比较，差异无显著性(P>0.05)。B组血浆ET-1浓度与A组比较，差异有显著性(P<0.01)；C组与B组比较，差异有显著性(P<0.01)；(2) 光镜下肺细小动脉管壁面积/管总面积比值(WA/TA)、肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度(SMC)B组与A组比较，差异有显著性(P均<0.01)，C组WA/TA、SMC与B组比较，差异有显著性(P均<0.01)；电镜下，B组肺细小动脉中膜平滑肌细胞增生，面积增大，染色质增多，外膜胶原纤维密集，C组大鼠肺细小动脉中膜平滑肌细胞和外膜胶原纤维增生与B组比较明显减轻；(3) 原位杂交发现，B组Ⅰ级(直径>200 μm)、Ⅱ级(直径50～200 μm)、Ⅲ级(直径<50 μm)肺细小动脉ET-1 mRNA平均吸光度值与A组比较差异有显著性(P均<0.01)，C组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肺细小动脉ET-1 mRNA平均吸光度值与B组比较差异有显著性(P均<0.01)。结论 肺动脉ET-1基因表达增强为慢性低O2高CO2性肺动脉高压形成的重要机制，川芎嗪抑制肺动脉ET-1基因表达可能为其抑制慢性低O2高CO2性肺动脉高压的机制之一。
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关键词：川芎嗪；缺氧；高碳酸血症；肺动脉；内皮素；基因
慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病的中心环节是肺动脉高压的形成，阐明肺动脉高压的形成机制以及寻求理想的抑制肺动脉高压药物一直是COPD、肺心病防治的重要研究课题。我们采用慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)肺动脉高压大鼠模型，研究肺动脉内皮素1(ET-1)基因表达变化在肺动脉高压形成和肺血管结构重建中的作用及川芎嗪的影响。
材料与方法
一、动物模型的制备
雄性SD大鼠(温州医学院实验动物中心提供)30只，体重180～280 g，适应性饲养1周后，随机分为3组：(1) 正常对照组(A组，10只)：作为常压氧下的对照；(2) 低O2高CO2 4周组(B组，10只)：置于常压低O2高CO2舱中，吸入气O2浓度为8.5%～11.0%，CO2浓度为5.0%～6.5%，每日10 h，其余时间与正常对照组在同一室内，室温15～20 ℃，相对湿度50%～70%饲养到规定时间；(3) 低O2高CO2 4周+川芎嗪组(C组，10只)：川芎嗪购自无锡市第七制药厂，批号9610051，80 mg*kg-1*d-1，腹腔注射，其余条件同(2)组。
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二、肺动脉和颈动脉平均压的测定
用1%戊巴比妥钠，腹腔注射行全身麻醉，仰卧固定，作颈正中切口，自颈外静脉插管至肺动脉并行颈总动脉插管，分别连接YL-3和YL-4型压力传感器，输入SJ-42型生理记录仪测取平均肺动脉压(mPAP)和平均颈动脉压(mCAP)。
三、血浆ET-1的测定
放射免疫法测定动脉血ET-1浓度(北京美迪科生物技术有限公司的试剂盒)，严格按说明书操作。
四、光镜标本制作及观察
放血处死大鼠，取出肺组织，10%缓冲甲醛溶液固定，取固定后的肺，左肺门水平横切，做石蜡切片，厚约5 μm，行HE染色、弹力纤维及VG染色，每只大鼠选1张肺组织切片，每张切片随机选取直径约100～200 μm肺细小动脉5支，用图像分析仪心肺血管分析软件(华东理工大学研制)测定平均血管总面积(外弹力板以内)、血管腔面积(内膜表面以内)以计算相对比值肺细小动脉管壁面积/管总面积(WA/TA)，并测定肺细小动脉中膜平滑肌细胞核密度(SMC，每1 000平方微米中细胞核数)。
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五、电镜标本制作及观察
大鼠放血处死立即完整取出肺，在肺门水平横切面切取1 mm×1 mm×1 mm大小肺组织各2块，用2.5%戊二醛作前固定，1%锇酸作后固定，Epon 812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，常规染色，H-600型透射电镜观察肺小动脉超微结构改变，并摄片。
六、原位杂交
1.寡核苷酸探针：采用地高辛标记的ET-1多相寡核苷酸探针(武汉博士德生物工程有限公司)，ET-1寡核苷酸探针序列来源于：鼠基因U35233 GI1244501，(1)34-68(探针序列CTAAT AAACG GGTAC TAGAA GAGAG ACGAC AAGCA)；(2) 231-265(探针序列GGTGG ACCTG TAGTA GACCC AGTTG TGAGG GCTCG)。
2.杂交过程 放血处死大鼠，取出肺组织，迅速以10%缓冲甲醛固定，常规脱水，透明并石蜡包埋，连续切片，标本经二甲苯脱蜡至水，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，滴加地高辛标记的ET-1寡核苷酸探针杂交，封闭，滴加小鼠抗地高辛，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，滴加SABC，二氨基丁酸(DAB)显色，苏木素复染，阳性结果呈棕黄色。每组随机选5只大鼠，每只大鼠选1张肺组织切片，每张切片随机选取直径>200 μm(Ⅰ级)、直径50～200 μm(Ⅱ级)、直径<50 μm(Ⅲ级)的肺内动脉各5支，用图像分析仪心肺血管分析软件(华东理工大学研制)检测上述3级肺内动脉管壁平均吸光度值作为管壁ET-1 mRNA的相对含量。
, 百拇医药
统计学处理：数据以X±s表示，采用spss软件进行组间t检验
结果
一、三组mPAP、mCAP、WA/TA、SMC及ET-1的比较
4周低O2高CO2和川芎嗪对大鼠mPAP、mCAP、WA/TA、SMC及血浆ET-1的影响见表1。
二、慢性低O2高CO2和川芎嗪对大鼠肺细小动脉超微结构的影响
表1 三组mPAP、mCAP、WA/TA、SMC、ET-1浓度的变化(X±s)
组 别
只数
, 百拇医药
mPAP(mm Hg)
mCAP(mm Hg)
WA/TA(%)
SMC
ET-1(ng/L)
正常对照组
8
14.4±1.7
133±7
30± 4.4
6.1±1.3
96±35
, 百拇医药
低O2高CO2组
8
21.2±1.5△
132±5
53±10.0△
9.9±2.7△
254±29△
低O2高CO2+川芎嗪组
8
16.0±3.0*
, 百拇医药
134±8
34± 2.4*
6.4±1.0*
167±30*
注：各组入舱饲养大鼠为10只，实验过程大鼠损耗，实测数据各组鼠数为8只(下同)；与对照组比较△P<0.01；与低O2高CO2组比较
* P<0.01
电镜下发现，正常对照组大鼠肺细小动脉内膜、中膜、外膜清晰，内皮细胞扁平，中膜有1～2层环形平滑肌，平滑肌细胞间有散在的胶原纤维，外膜为疏松的结缔组织，有少量纤维母细胞和胶原纤维。慢性低O2高CO2大鼠肺细小动脉内皮细胞向管腔内突起，呈立方或柱状上皮，中膜平滑肌细胞增生，面积增大呈立方形，核粗大染色质增多，外膜胶原纤维高度密集呈束状。慢性低O2高CO2+川芎嗪组大鼠肺细小动脉内皮细胞基本恢复扁平，中膜平滑肌细胞增生减轻，面积变小，外膜胶原纤维明显减少。
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三、三组肺细小动脉ET-1 mRNA相对含量比较
慢性低O2高CO2和川芎嗪对大鼠肺动脉ET-1基因表达的影响见表2。
表2 各组肺细小动脉ET-1 mRNA相对含量变化(X±s)
组别
只数
ET-1 mRNA平均吸光度值
Ⅰ级肺
内动脉
Ⅱ级肺
内动脉
, http://www.100md.com Ⅲ级肺
内动脉
正常对照组
8
0.068±
0.014
0.060±
0.012
0.057±
0.011
低O2高CO2组
8
, 百拇医药 0.105±
0.026△
0.089±
0.008△
0.084±
0.008△
低O2高CO2+
川芎嗪组
8
0.076±
0.016*
, 百拇医药
0.065±
0.013*
0.058±
0.011*
注：与对照组比较△P<0.01；与低O2高CO2组比较*P<0.01讨论
近年来发现内皮素为目前已知最强的缩血管物质，在肺动脉高压的发生以及肺血管结构重建中发挥着重要作用[1]，但以往报道有关这方面的实验研究大多采用单纯缺O2所致肺动脉高压动物模型，临床上COPD患者通气功能障碍常导致肺泡低O2和CO2潴留，而高CO2在肺动脉高压形成中起着一定的作用[2]。因此我们的实验采用本研究室先期建立的慢性低O2高CO2性肺动脉高压动物模型，探讨ET-1在肺动脉高压形成中的作用及川芎嗪的影响。
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本组实验发现，慢性低O2高CO2大鼠较正常对照组肺动脉压力明显升高。光镜下，慢性低O2高CO2大鼠肺细小动脉管壁明显增厚、平滑肌细胞核密度增高，电镜下肺细小动脉中膜平滑肌细胞增生、面积增大、染色质增多、外膜胶原纤维高度密集，提示4周低O2高CO2导致大鼠肺动脉高压和肺动脉结构重建。
本组实验发现，慢性低O2高CO2大鼠血浆ET-1浓度较正常对照组明显升高，原位杂交发现，慢性低O2高CO2组大鼠肺细小动脉ET-1 mRNA表达较正常对照组明显增强，据报道，内皮素具有强烈收缩肺动脉[3]、刺激肺动脉平滑肌细胞增生[4]和促进肺动脉外膜纤维母细胞及胶原纤维增生的作用[5，6]，因此推测肺动脉ET-1的合成分泌增多可能为慢性低O2高CO2引起肺动脉高压和肺血管结构重建的重要原因。
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近年来川芎嗪在抑制肺动脉高压方面的作用备受关注。本组实验发现，慢性低O2高CO2+川芎嗪组大鼠与慢性低O2高CO2组比较，mPAP明显下降，mCAP无明显改变，提示川芎嗪可预防慢性低O2高CO2性肺动脉高压的形成而对体循环压力无明显影响，即对肺动脉压力具有选择性抑制作用，光镜下发现，慢性低O2高CO2+川芎嗪组WA/TA和SMC较慢性低O2高CO2组明显减低，电镜下发现川芎嗪可明显抑制由慢性低O2高CO2引起的肺细小动脉中膜平滑肌的增生和外膜胶原纤维的堆积，提示川芎嗪具有抑制慢性低O2高CO2大鼠的肺血管结构重建作用。
本组实验进一步发现，川芎嗪可减低慢性低O2高CO2肺动脉高压大鼠血浆ET-1浓度和肺细小动脉ET-1基因的表达，因此推测川芎嗪减少肺动脉内皮素的合成可能为其抑制慢性低O2高CO2性肺动脉高压和肺血管结构重建的重要作用机制之一。
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图1 电镜显示4周低O2高CO2组大鼠肺细小动脉内皮细胞向管腔内突起，呈立方或柱状上皮，中膜
平滑肌细胞面积增大，呈立方形，核粗大，染色质增多 ×8 000
图2 电镜显示4周低O2高CO2
组大鼠肺细小动脉外膜胶原纤维高度密集，呈束状 ×8 000
图3 ET-1原位杂交显示4周正常对
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照组大鼠肺细小动脉管壁棕黄色染色浅淡 苏木素复染 ×160
图4 ET-1原位杂交显示4周低O2
高CO2组大鼠肺细小动脉管壁染色明显增强(棕黄色) 苏木素复染 ×160
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(398530)
作者单位：王良兴(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
陈少贤(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
徐正介(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
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谢于鹏(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
陈彦凡(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
王卫(325000，温州医学院附属第一医院呼吸科)
喻林升(325000，温州医学院附属第一医院病理科)
王群姬(325000，温州医学院附属第一医院病理科)
张洪勤(分子生物学研究中心)
参考文献
1.Nakanishi K, Tajima F, Nakata Y, et al. Expression of endothelin-1 in rats developing hypobaric hypixia-induced pulmonary hypertension. Lab Invest, 1999, 79:1347-1357.
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2.Myers JL, Domkwski PW, Wang Y, et al. Sympathetic blockade blunts hypercapnic pulmonary arterial vasoconstriction in newborn piglets. Eur J Cardiothorac Surg, 1998, 13:298-305.
3.Luscher TF. Endothelin: Systemic arterial and pulmonary effects of a new peptide with potent biologic properties. Am Rev Respir Dis, 1992, 146:56-60.
4.Janakider K, Fisher MA, Delvecchio PJ, et al. Endothelin-1 stimulates DNA synthesis and proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol, 1992, 263:1295-1301.
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5.Dawes KE. Characterization of fibroblast mitogens and chemoattractants produced by endothelial cells exposed to hypoxia. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 10:552-559.
6.Mansoor AM, Honda M, Saida K, et al. Endothelin induced collagen remodeling in experimental pulmomary hypertension. Biochem Biophys Res Commun, 1995, 215:981-986., 百拇医药