子宫颈病变中端粒酶活性的表达
子宫颈病变中端粒酶活性的表达
徐耀红 马桂珍 李守柔 崔满华 黄冰玉
关键词：子宫颈；端粒酶 端粒是真核细胞染色体末端的一种重复片段，能够维持染色体的稳定和完整性[1]，避免其发生融合、降解或重组等变化，随着细胞分裂，端粒逐渐缩短，致使细胞衰老、死亡[2]。端粒酶是一种逆转录酶，能以自身的RNA为模板，指导合成端粒DNA。正常人体细胞中端粒酶的表达很低，或完全检测不到，而在恶性肿瘤细胞中，端粒酶常呈阳性表达，使端粒保持一定长度[3]，因而细胞具有无限生长和繁殖的能力。 本研究采用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplifi- cation protocol, TRAP)，对宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及宫颈癌中端粒酶活性进行检测，现报道如下。
一、资料与方法
, http://www.100md.com
1.研究对象：自1998年4月至1999年2月间来我院就诊的患者，伴有慢性宫颈炎症的子宫肌瘤患者30例，其中宫颈糜烂15例、宫颈肥大7例、宫颈息肉3例、宫颈腺囊肿5例；CIN患者20例，其中CIN 1级6例、CIN 2级2例、CIN 3级4例、宫颈原位癌8例；宫颈癌患者22例。年龄29～65岁(平均51岁)。于行子宫切除术时迅速切除部分宫颈组织置-80℃保存。标本同时行病理组织学检查。
2.方法：采用常规TRAP法及改良的银染显色方法检测端粒酶活性。取80～100 mg冻存的组织于0℃ 400 μl洗液(含10 mmol羟乙磺酸钾、1.5 mmol 氯化镁、10 mmol氯化钾、1.0 mmol二硫苏糖醇，pH 7.5)中充分洗涤，离心后加入200 μl裂解液[含0.5% 胆酰胺二甲基丙磺酸、10 mmol 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸、1 mmol 氯化镁、1 mmol 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、0.1 mmol 苯*****、10%甘油、5.0 mmol β-巯基乙醇，pH 7.5]，再加入前导引物、4种脱氧核苷酸混合物等，24℃水浴30 min，再加入逆转引物及Taq酶，前导引物及逆转引物的序列分别为：5′-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGG- GTTGGGGTTGGGGTTG-3′，5′-CACGAAACAGCTATGACCCCTAA- CCCTAACCCTAACCCT-3′(加拿大纽芬兰大学赠予)。然后进行聚合酶链反应(PCR)：热启动94℃ 3 min，以95℃ 30 s、50℃ 30 s、75℃ 45 s、循环30次。取40 μl 上述产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶、1×TBE缓冲液中，以150 V电压电泳3 h后，进行改良的银染显色，即将凝胶置固定液(含10.0%乙醇、0.5%乙酸)中振荡10 min，加入硝酸银至终浓度为0.2%，振荡10 min，超纯水洗涤后，加入显色液(3.0%氢氧化钠、0.4%甲醛)振荡至所有条带出现。以连续出现的6个碱基间隔的梯状条带为端粒酶阳性，同时设Hela细胞为阳性对照，正常宫颈组织为阴性对照。
, 百拇医药
3.统计学方法：采用χ2检验。
二、结果
30例慢性宫颈炎组织中，仅1例宫颈Ⅱ度糜烂者呈端粒酶阳性，阳性率3%。20例CIN中，宫颈不典型增生12例，其中CIN 1级6例，端粒酶阳性2例，CIN 2级2例，均呈阴性，CIN 3级4例，端粒酶阳性3例；而8例原位癌中，端粒酶阳性6例。阳性率55%。22例宫颈癌中，全部呈端粒酶阳性，2例Ⅱb期患者呈强阳性。阳性率100%。3者之间阳性率比较，差异有显著性(P<0.05)。
三、讨论
1.端粒酶的活化在肿瘤形成中的意义：大多数人体正常的组织细胞中无端粒酶活性表达，而恶性肿瘤细胞则存在着有活性作用的端粒酶，能进行端粒DNA的从头合成，以补充因细胞分裂丢失的部分端粒，维持一定的端粒长度，保证遗传信息的完整复制，使细胞具有无限繁殖的能力。由于细胞的永生性是在端粒长度稳定化过程中获得的，且端粒的稳定是对端粒酶活性的反应，而恶性肿瘤是由大量的具有永生性的细胞组成，因此，端粒酶的活化自然成为恶性肿瘤的普遍现象。Rhysu[4]检测了100个具有永生性的肿瘤细胞株，端粒酶的阳性率为98%，而非永生性的肿瘤细胞株中，则端粒酶全部呈阴性，因此可见，端粒酶的活性表达与肿瘤的形成有着高度的相关性，是癌变过程诸多环节中的关键一环。
, 百拇医药
2.端粒酶活性的检测在肿瘤诊断中的意义： 测定端粒酶活性的方法是以PCR为基础的TRAP法，有高度的敏感性和可靠性，仅存在10个癌细胞即可检测到端粒酶活性[5]。本实验采用改良的银染显色方法，快速、准确，无放射性损伤，适于大量标本的检测。全部标本均检测2次，并设Hela细胞为阳性对照，正常的宫颈组织为阴性对照，结果重复性好，稳定可靠。本研究中，1例宫颈Ⅱ度糜烂的组织出现端粒酶阳性，有3种可能：(1)由于PCR方法的高度灵敏性，极少量癌细胞的污染也会产生阳性结果；(2)可能这例宫颈组织中已隐藏有病理组织学无法证实的癌前病变；(3)这种病变可能来自生发系细胞，故可呈阳性。本研究表明，在人类宫颈的恶性肿瘤形成过程中，端粒酶的活化是一种早期改变和普遍现象，并与肿瘤的发生和进展密切相关。因此，端粒酶活性的检测不仅可作为宫颈癌早期诊断的有效方法，而且是宫颈癌预后判定的重要手段。
作者单位：徐耀红(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
, 百拇医药
李守柔(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
崔满华(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
黄冰玉(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
马桂珍(吉林省妇幼保健院妇产科)
参考文献
1，Lundblad V, Szostak JW. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell, 1989, 57: 633-643.
2，Ferg JL, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995, 269: 1236-1241.
, http://www.100md.com
3，Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere lergth predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89: 10114-10118.
4，Rhysu MS. Telomeres, telomerase, and immortality. J Natl Cancer Inst, 1995, 87: 884-894.
5，Piatyszek MA, Kim NW, Weinrich SL, et al. Detection of telomere activity in human cells and tumors by a telomere repeat amplification protocol (TRAP). Methods Cell Sci, 1995, 17: 1-15., http://www.100md.com
徐耀红 马桂珍 李守柔 崔满华 黄冰玉
关键词：子宫颈；端粒酶 端粒是真核细胞染色体末端的一种重复片段，能够维持染色体的稳定和完整性[1]，避免其发生融合、降解或重组等变化，随着细胞分裂，端粒逐渐缩短，致使细胞衰老、死亡[2]。端粒酶是一种逆转录酶，能以自身的RNA为模板，指导合成端粒DNA。正常人体细胞中端粒酶的表达很低，或完全检测不到，而在恶性肿瘤细胞中，端粒酶常呈阳性表达，使端粒保持一定长度[3]，因而细胞具有无限生长和繁殖的能力。 本研究采用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplifi- cation protocol, TRAP)，对宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及宫颈癌中端粒酶活性进行检测，现报道如下。
一、资料与方法
, http://www.100md.com
1.研究对象：自1998年4月至1999年2月间来我院就诊的患者，伴有慢性宫颈炎症的子宫肌瘤患者30例，其中宫颈糜烂15例、宫颈肥大7例、宫颈息肉3例、宫颈腺囊肿5例；CIN患者20例，其中CIN 1级6例、CIN 2级2例、CIN 3级4例、宫颈原位癌8例；宫颈癌患者22例。年龄29～65岁(平均51岁)。于行子宫切除术时迅速切除部分宫颈组织置-80℃保存。标本同时行病理组织学检查。
2.方法：采用常规TRAP法及改良的银染显色方法检测端粒酶活性。取80～100 mg冻存的组织于0℃ 400 μl洗液(含10 mmol羟乙磺酸钾、1.5 mmol 氯化镁、10 mmol氯化钾、1.0 mmol二硫苏糖醇，pH 7.5)中充分洗涤，离心后加入200 μl裂解液[含0.5% 胆酰胺二甲基丙磺酸、10 mmol 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸、1 mmol 氯化镁、1 mmol 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、0.1 mmol 苯*****、10%甘油、5.0 mmol β-巯基乙醇，pH 7.5]，再加入前导引物、4种脱氧核苷酸混合物等，24℃水浴30 min，再加入逆转引物及Taq酶，前导引物及逆转引物的序列分别为：5′-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGG- GTTGGGGTTGGGGTTG-3′，5′-CACGAAACAGCTATGACCCCTAA- CCCTAACCCTAACCCT-3′(加拿大纽芬兰大学赠予)。然后进行聚合酶链反应(PCR)：热启动94℃ 3 min，以95℃ 30 s、50℃ 30 s、75℃ 45 s、循环30次。取40 μl 上述产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶、1×TBE缓冲液中，以150 V电压电泳3 h后，进行改良的银染显色，即将凝胶置固定液(含10.0%乙醇、0.5%乙酸)中振荡10 min，加入硝酸银至终浓度为0.2%，振荡10 min，超纯水洗涤后，加入显色液(3.0%氢氧化钠、0.4%甲醛)振荡至所有条带出现。以连续出现的6个碱基间隔的梯状条带为端粒酶阳性，同时设Hela细胞为阳性对照，正常宫颈组织为阴性对照。
, 百拇医药
3.统计学方法：采用χ2检验。
二、结果
30例慢性宫颈炎组织中，仅1例宫颈Ⅱ度糜烂者呈端粒酶阳性，阳性率3%。20例CIN中，宫颈不典型增生12例，其中CIN 1级6例，端粒酶阳性2例，CIN 2级2例，均呈阴性，CIN 3级4例，端粒酶阳性3例；而8例原位癌中，端粒酶阳性6例。阳性率55%。22例宫颈癌中，全部呈端粒酶阳性，2例Ⅱb期患者呈强阳性。阳性率100%。3者之间阳性率比较，差异有显著性(P<0.05)。
三、讨论
1.端粒酶的活化在肿瘤形成中的意义：大多数人体正常的组织细胞中无端粒酶活性表达，而恶性肿瘤细胞则存在着有活性作用的端粒酶，能进行端粒DNA的从头合成，以补充因细胞分裂丢失的部分端粒，维持一定的端粒长度，保证遗传信息的完整复制，使细胞具有无限繁殖的能力。由于细胞的永生性是在端粒长度稳定化过程中获得的，且端粒的稳定是对端粒酶活性的反应，而恶性肿瘤是由大量的具有永生性的细胞组成，因此，端粒酶的活化自然成为恶性肿瘤的普遍现象。Rhysu[4]检测了100个具有永生性的肿瘤细胞株，端粒酶的阳性率为98%，而非永生性的肿瘤细胞株中，则端粒酶全部呈阴性，因此可见，端粒酶的活性表达与肿瘤的形成有着高度的相关性，是癌变过程诸多环节中的关键一环。
, 百拇医药
2.端粒酶活性的检测在肿瘤诊断中的意义： 测定端粒酶活性的方法是以PCR为基础的TRAP法，有高度的敏感性和可靠性，仅存在10个癌细胞即可检测到端粒酶活性[5]。本实验采用改良的银染显色方法，快速、准确，无放射性损伤，适于大量标本的检测。全部标本均检测2次，并设Hela细胞为阳性对照，正常的宫颈组织为阴性对照，结果重复性好，稳定可靠。本研究中，1例宫颈Ⅱ度糜烂的组织出现端粒酶阳性，有3种可能：(1)由于PCR方法的高度灵敏性，极少量癌细胞的污染也会产生阳性结果；(2)可能这例宫颈组织中已隐藏有病理组织学无法证实的癌前病变；(3)这种病变可能来自生发系细胞，故可呈阳性。本研究表明，在人类宫颈的恶性肿瘤形成过程中，端粒酶的活化是一种早期改变和普遍现象，并与肿瘤的发生和进展密切相关。因此，端粒酶活性的检测不仅可作为宫颈癌早期诊断的有效方法，而且是宫颈癌预后判定的重要手段。
作者单位：徐耀红(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
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李守柔(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
崔满华(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
黄冰玉(130041 长春， 白求恩医科大学第二附属医院妇产科)
马桂珍(吉林省妇幼保健院妇产科)
参考文献
1，Lundblad V, Szostak JW. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell, 1989, 57: 633-643.
2，Ferg JL, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995, 269: 1236-1241.
, http://www.100md.com
3，Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere lergth predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89: 10114-10118.
4，Rhysu MS. Telomeres, telomerase, and immortality. J Natl Cancer Inst, 1995, 87: 884-894.
5，Piatyszek MA, Kim NW, Weinrich SL, et al. Detection of telomere activity in human cells and tumors by a telomere repeat amplification protocol (TRAP). Methods Cell Sci, 1995, 17: 1-15., http://www.100md.com