卵巢上皮性癌组织中p15、p16基因突变及其临床意义
卵巢上皮性癌组织中p15、p16基因突变及其临床意义
李红霞 江森 李文军
关键词：p15；p16；卵巢上皮性癌 p15、p16基因是近年来发现和分离的两个抑癌基因。研究表明，p15、p16基因突变与人类肿瘤的发生有关，在多种原发性肿瘤及其肿瘤细胞系中均存在p15、p16基因纯合性缺失与点突变[1]。本研究旨在通过检测卵巢上皮性癌(OEC)中p15、p16基因纯合性缺失与点突变，探讨其在OEC发生、发展中的作用，并评价其可否作为肿瘤标记物应用于OEC的诊断、监测及预后的判断。
一、资料与方法
1.研究对象：43例OEC、11例卵巢良性上皮性瘤及4例卵巢交界性上皮性瘤取自山东医科大学附属医院、山东省立医院及解放军第九○医院妇产科1995～1997年住院的手术患者。OEC患者平均年龄53岁(29～74岁)；病理类型包括，浆液性囊腺癌23例、粘液性囊腺癌12例、未分类癌6例及子宫内膜样癌2例；按国际妇产科联盟1988年手术病理分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)12例、晚期(Ⅲ～Ⅳ期)31例；按世界卫生组织标准，病理分级为G1～G2级32例、G3级11例；同时伴有腹膜、邻近器官或淋巴结等转移者29例。患者均为初次手术，术前均未予化学治疗(化疗)和放射治疗(放疗)。卵巢良性上皮性瘤患者平均年龄46 岁(29～72岁)，其中浆液性囊腺瘤6例，粘液性囊腺瘤5例。卵巢交界性上皮瘤患者平均年龄34岁(21～59岁)，其中浆液性及粘液性肿瘤各2例。
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2.方法：(1)标本制备及DNA提取：取患者肿瘤及瘤旁组织(有转移者同时取转移灶组织)共145份，以组织包埋剂包埋，立即置于液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存。使用时先制成5 μm厚的冰冻切片，行显微分离肿瘤组织，对照苏木素伊红染色，于光学显微镜下观察，选择肿瘤细胞富集区(肿瘤细胞与间质细胞比例≥70%)，以手术刀片分离、刮取肿瘤细胞并提取DNA。(2)p15、p16基因纯合性缺失和点突变的检测及判断标准[2]：采用多聚酶链反应及琼脂糖凝胶电泳方法检测p15、p16基因纯合性缺失，以多聚酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测p15、p16基因点突变。判断标准：p15、p16基因纯合性缺失的标准为肿瘤组织p15(或16)与正常组织p15(或16)的比值≤0.25 ；PCR-SSCP分析p15、p16基因点突变， 则是与自体正常组织对比,肿瘤组织出现异常迁移带者表示有基因点突变。
3.统计学处理：采用SAS软件作χ2检验(四格表确切概率法)及相关分析。
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二、结果
1. 卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及OEC癌旁组织中p15、p16基因纯合性缺失和点突变的检测：卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及OEC癌旁组织中未检测到p15、p16基因纯合性缺失和点突变，OEC组织中p15基因纯合性缺失率为46.5%(20/43)，与良性肿瘤比较，差异有显著性(P<0.01)。OEC组织中p15基因纯合性缺失包括E1、E2共同缺失4例，占缺失总数的20.0%;仅E1缺失10例;仅E2缺失者6例。PCR-SSCP检测未发现p15基因点突变。OEC组织中p16基因纯合性缺失率及点突变率分别为16.0%(7/43)及7.0%(3/43)，其中E1缺失者5例，E1、E2、E3完全缺失者1例，E2、E3共同缺失者1例。p16基因发生点突变的3例均位于E2，且表现为杂合性。p16基因的纯合性缺失及点突变率，OEC组织与良性、交界性肿瘤组织比较，差异均无显著性(P>0.05)。OEC组织中p15、p16基因总变异率(包括纯合性缺失率及点突变率)为70.0%。在p16基因突变(包括纯合性缺失与点突变)的10例中，9例同时存在p15基因的纯合性缺失；而在p16基因正常的33例中，仅有1例有p15基因的纯合性缺失，两者比较，差异有显著性(P<0.01)。p15、p16基因突变之间存在正相关性(r=0.48)。
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2. p15、p16基因突变与临床病理：病理分级G3级中p15基因的纯合性缺失率为63.6%，较G1、G2级的40.0%有升高趋势，但两者比较,差异无显著性(P>0.05)。p15、p16基因变异多发生于浆液性囊腺癌，与其他类型OEC比较，差异也无显著性(P>0.05)。见表1。肿瘤转移灶组织中p15、 p16基因纯合性缺失率分别为64.0%及38.5%,与原发灶比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1 p15、p16 基因突变与临床病理参数的关系
类别
总
例数
p15基因缺失
P值
, 百拇医药
p16基因突变
P值
例数
百分率
(%)
例数
百分率
(%)
手术病理分期
早期
12
5
41.7
, 百拇医药
2
16.6
晚期
31
15
48.4
8
18.6
>0.05
病理分级
32
13
40.6
, http://www.100md.com
7
21.9
G1～G2级
32
15
48.4
>0.05
8
18.6
G3级
11
7
, 百拇医药 63.6
>0.05
3
27.3
>0.05
淋巴结转移
有
29
12
41.3
7
24.1
无
, http://www.100md.com 14
8
57.1
>0.05
3
21.4
>0.05
病理类型
浆液性囊腺癌
23
13
56.5
6
, 百拇医药 26.0
粘液性囊腺癌
12
3
25.0
3
25.0
未分类癌
6
4
4/6*
1
1/6*
, 百拇医药
子宫内膜样癌
2
0
0/2*
>0.05
0
0/2*
>0.05
*例数少于10，不计百分率
三、讨论
1.p15、p16基因突变与OEC形成和发展的关系：本研究结果显示，OEC组织中p15、p16基因总突变率高达70.0%，且p15、p16基因突变之间存在正相关，提示，p15、p16基因突变是OEC形成中的一个普遍现象，两者共同参与了OEC发生、发展。本研究发现，p15基因变异的形式为纯合性缺失而非点突变，表明纯合性缺失为该基因失活的主要方式，与其他作者的报道一致[3]。值得注意的是，本组资料中的3例p16基因点突变均为杂合性，其他作者亦有类似报道，提示，p16的1个等位基因是因突变而失活，而另外1个等位基因失活可能是由于其他机理，如甲基化作用、杂合性缺失；或如p53基因一样，p16亦为显性基因，其中1个等位基因突变，即引起细胞周期正常演进的紊乱[4]，其确切机理尚有待于进一步的探讨。
, 百拇医药
2.p15、p16基因突变的临床意义：本研究结果显示，在卵巢良性及交界性上皮性肿瘤中未检测到p15、p16基因纯合性缺失和点突变，提示，p15、p16基因变异是恶性肿瘤的特征性改变，有望作为肿瘤标记物用于OEC的诊断及与良性肿瘤的鉴别诊断中。因p15、p16基因突变率在患者各预后影响因素如临床分期、病理分级以及有无肿瘤转移等之间的差异无显著性，故其价值尚有待于进一步探讨。
作者单位：李红霞(现在北京铁路总医院妇产科)
江森(250021 济南，山东医科大学附属医院妇产科)
李文军(重庆第三军医大学妇产科)
参考文献
1，Fujita M, Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 gene and p15 genes in human epihtelial ovarian tumors. Int J Cancer,1997, 74:148-155.
, http://www.100md.com
2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. P16INK4A and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol，1997, 65:319-324.
3，Roesler JM, Livignston EH, Strivatsan E, et al. Deletion of p15(MTS2) in head ang neck squamous cell carcinomas. J Surg Res, 1998, 77:50-54.
4，Pinyol M, Francese C, Bea S, et al. P16INK4A gene inactivation by deletions, mutations, and hypermethylation is associated with transformed and aggressive variants of non-Hodgkin′s lymphomas. Blood, 1998, 91:2977-2984., 百拇医药
李红霞 江森 李文军
关键词：p15；p16；卵巢上皮性癌 p15、p16基因是近年来发现和分离的两个抑癌基因。研究表明，p15、p16基因突变与人类肿瘤的发生有关，在多种原发性肿瘤及其肿瘤细胞系中均存在p15、p16基因纯合性缺失与点突变[1]。本研究旨在通过检测卵巢上皮性癌(OEC)中p15、p16基因纯合性缺失与点突变，探讨其在OEC发生、发展中的作用，并评价其可否作为肿瘤标记物应用于OEC的诊断、监测及预后的判断。
一、资料与方法
1.研究对象：43例OEC、11例卵巢良性上皮性瘤及4例卵巢交界性上皮性瘤取自山东医科大学附属医院、山东省立医院及解放军第九○医院妇产科1995～1997年住院的手术患者。OEC患者平均年龄53岁(29～74岁)；病理类型包括，浆液性囊腺癌23例、粘液性囊腺癌12例、未分类癌6例及子宫内膜样癌2例；按国际妇产科联盟1988年手术病理分期，早期(Ⅰ～Ⅱ期)12例、晚期(Ⅲ～Ⅳ期)31例；按世界卫生组织标准，病理分级为G1～G2级32例、G3级11例；同时伴有腹膜、邻近器官或淋巴结等转移者29例。患者均为初次手术，术前均未予化学治疗(化疗)和放射治疗(放疗)。卵巢良性上皮性瘤患者平均年龄46 岁(29～72岁)，其中浆液性囊腺瘤6例，粘液性囊腺瘤5例。卵巢交界性上皮瘤患者平均年龄34岁(21～59岁)，其中浆液性及粘液性肿瘤各2例。
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2.方法：(1)标本制备及DNA提取：取患者肿瘤及瘤旁组织(有转移者同时取转移灶组织)共145份，以组织包埋剂包埋，立即置于液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存。使用时先制成5 μm厚的冰冻切片，行显微分离肿瘤组织，对照苏木素伊红染色，于光学显微镜下观察，选择肿瘤细胞富集区(肿瘤细胞与间质细胞比例≥70%)，以手术刀片分离、刮取肿瘤细胞并提取DNA。(2)p15、p16基因纯合性缺失和点突变的检测及判断标准[2]：采用多聚酶链反应及琼脂糖凝胶电泳方法检测p15、p16基因纯合性缺失，以多聚酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测p15、p16基因点突变。判断标准：p15、p16基因纯合性缺失的标准为肿瘤组织p15(或16)与正常组织p15(或16)的比值≤0.25 ；PCR-SSCP分析p15、p16基因点突变， 则是与自体正常组织对比,肿瘤组织出现异常迁移带者表示有基因点突变。
3.统计学处理：采用SAS软件作χ2检验(四格表确切概率法)及相关分析。
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二、结果
1. 卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及OEC癌旁组织中p15、p16基因纯合性缺失和点突变的检测：卵巢良性、交界性上皮性肿瘤及OEC癌旁组织中未检测到p15、p16基因纯合性缺失和点突变，OEC组织中p15基因纯合性缺失率为46.5%(20/43)，与良性肿瘤比较，差异有显著性(P<0.01)。OEC组织中p15基因纯合性缺失包括E1、E2共同缺失4例，占缺失总数的20.0%;仅E1缺失10例;仅E2缺失者6例。PCR-SSCP检测未发现p15基因点突变。OEC组织中p16基因纯合性缺失率及点突变率分别为16.0%(7/43)及7.0%(3/43)，其中E1缺失者5例，E1、E2、E3完全缺失者1例，E2、E3共同缺失者1例。p16基因发生点突变的3例均位于E2，且表现为杂合性。p16基因的纯合性缺失及点突变率，OEC组织与良性、交界性肿瘤组织比较，差异均无显著性(P>0.05)。OEC组织中p15、p16基因总变异率(包括纯合性缺失率及点突变率)为70.0%。在p16基因突变(包括纯合性缺失与点突变)的10例中，9例同时存在p15基因的纯合性缺失；而在p16基因正常的33例中，仅有1例有p15基因的纯合性缺失，两者比较，差异有显著性(P<0.01)。p15、p16基因突变之间存在正相关性(r=0.48)。
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2. p15、p16基因突变与临床病理：病理分级G3级中p15基因的纯合性缺失率为63.6%，较G1、G2级的40.0%有升高趋势，但两者比较,差异无显著性(P>0.05)。p15、p16基因变异多发生于浆液性囊腺癌，与其他类型OEC比较，差异也无显著性(P>0.05)。见表1。肿瘤转移灶组织中p15、 p16基因纯合性缺失率分别为64.0%及38.5%,与原发灶比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1 p15、p16 基因突变与临床病理参数的关系
类别
总
例数
p15基因缺失
P值
, 百拇医药
p16基因突变
P值
例数
百分率
(%)
例数
百分率
(%)
手术病理分期
早期
12
5
41.7
, 百拇医药
2
16.6
晚期
31
15
48.4
8
18.6
>0.05
病理分级
32
13
40.6
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7
21.9
G1～G2级
32
15
48.4
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G3级
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3
27.3
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淋巴结转移
有
29
12
41.3
7
24.1
无
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8
57.1
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3
21.4
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病理类型
浆液性囊腺癌
23
13
56.5
6
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粘液性囊腺癌
12
3
25.0
3
25.0
未分类癌
6
4
4/6*
1
1/6*
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子宫内膜样癌
2
0
0/2*
>0.05
0
0/2*
>0.05
*例数少于10，不计百分率
三、讨论
1.p15、p16基因突变与OEC形成和发展的关系：本研究结果显示，OEC组织中p15、p16基因总突变率高达70.0%，且p15、p16基因突变之间存在正相关，提示，p15、p16基因突变是OEC形成中的一个普遍现象，两者共同参与了OEC发生、发展。本研究发现，p15基因变异的形式为纯合性缺失而非点突变，表明纯合性缺失为该基因失活的主要方式，与其他作者的报道一致[3]。值得注意的是，本组资料中的3例p16基因点突变均为杂合性，其他作者亦有类似报道，提示，p16的1个等位基因是因突变而失活，而另外1个等位基因失活可能是由于其他机理，如甲基化作用、杂合性缺失；或如p53基因一样，p16亦为显性基因，其中1个等位基因突变，即引起细胞周期正常演进的紊乱[4]，其确切机理尚有待于进一步的探讨。
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2.p15、p16基因突变的临床意义：本研究结果显示，在卵巢良性及交界性上皮性肿瘤中未检测到p15、p16基因纯合性缺失和点突变，提示，p15、p16基因变异是恶性肿瘤的特征性改变，有望作为肿瘤标记物用于OEC的诊断及与良性肿瘤的鉴别诊断中。因p15、p16基因突变率在患者各预后影响因素如临床分期、病理分级以及有无肿瘤转移等之间的差异无显著性，故其价值尚有待于进一步探讨。
作者单位：李红霞(现在北京铁路总医院妇产科)
江森(250021 济南，山东医科大学附属医院妇产科)
李文军(重庆第三军医大学妇产科)
参考文献
1，Fujita M, Enomoto T, Haba T, et al. Alteration of p16 gene and p15 genes in human epihtelial ovarian tumors. Int J Cancer,1997, 74:148-155.
, http://www.100md.com
2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. P16INK4A and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol，1997, 65:319-324.
3，Roesler JM, Livignston EH, Strivatsan E, et al. Deletion of p15(MTS2) in head ang neck squamous cell carcinomas. J Surg Res, 1998, 77:50-54.
4，Pinyol M, Francese C, Bea S, et al. P16INK4A gene inactivation by deletions, mutations, and hypermethylation is associated with transformed and aggressive variants of non-Hodgkin′s lymphomas. Blood, 1998, 91:2977-2984., 百拇医药