压力对牛眼小梁细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达及蛋白质合成的影响
压力对牛眼小梁细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达及蛋白质合成的影响
薛蔚 杜蜀华 李勇 黄恺
摘 要 目的 研究牛眼小梁细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在不同压力下的mRNA表达及蛋白质合成的变化，探讨一氧化氮(nitric oxide，NO)在青光眼发病中的作用。方法 培养新生牛眼小梁细胞，并分别给予20、40、60及80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)的压力，以不加压组为对照组，用原位杂交和还原型辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)组织化学染色技术对小梁细胞iNOS的mRNA和蛋白质含量变化进行定性及定量观察。结果 牛眼小梁细胞中iNOS mRNA 及蛋白质含量均随压力增高而增高。对照组与压力20 mm Hg组比较，两组iNOS mRNA均为弱表达，组间差异无显著性(t=0.950 1,P>0.05)；压力40 mm Hg和60 mm Hg组与对照组相比差异有显著性(t值分别为0.038 1和0.032 4,P<0.05)；压力80 mm Hg组与对照组相比差异有非常显著性(t=0.000 16,P<0.01)；压力40 mm Hg组与60 mm Hg组相比，组间差异无显著性(t=0.112 3,P>0.05)，而与80 mm Hg组相比差异有非常显著性(t值分别为0.002 9和0.004 5,P<0.01)。NADPH组织化学染色结果与原位杂交结果基本相同，仅显示40 mm Hg组与60 mm Hg组的组间差异有显著性(t=0.042 0,P<0.05)。结论 压力可激活iNOS mRNA表达，由此产生过量的NO可损伤小梁细胞，成为导致或加重青光眼的因素之一。
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关键词：小梁网；一氧化氮；原位杂交；免疫组织化学
一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来受到广泛重视的小分子物质，人们在研究过程中发现，它具有十分复杂的双重性，既是不可缺少的神经递质、免疫活性物质，又具有细胞毒性作用。NO在眼球内广泛分布并参与多种病理生理过程。以往的青光眼研究结果提示在不抑制房水生成的情况下，NO能改善房水流畅系数，以降低眼压；NO神经元广泛分布于房角及视网膜神经纤维层，而青光眼患者小梁网和睫状体处的NO神经纤维比正常人明显减少；NO可通过多种途径，如增加自由基和细胞内Ca2+浓度，对视网膜神经节细胞产生直接毒性作用。因此，我们以体外培养的牛眼小梁细胞为模型，用原位杂交及组织化学染色方法，研究压力对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)mRNA的表达及蛋白质合成的影响，并初步探讨其与青光眼发病的关系。
材料与方法
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一、小梁细胞的培养
新生小牛宰杀后立即取出眼球，在6 h内按王林等[1]及Hernandez等[2]的培养方法进行小梁细胞培养。于角膜后缘5 mm处环形剪开眼球，去除玻璃体、晶状体及葡萄膜，在解剖显微镜下找到小梁网，用眼科镊顺其方向撕下海绵状小梁网(撕下小梁网后，在角巩膜交界处可见位置很浅的巩膜内沟)，将小梁网剪成细小的碎块，放入含20%小牛血清的RPIM-1640培养基中进行小梁细胞培养。将第3～5代细胞消化后，传代于铺满小盖玻片的培养瓶中，待细胞长满80%后，用于制备高眼压模型。
二、波形蛋白免疫组化染色
一抗为小鼠抗人和小鼠抗动物波形蛋白多克隆抗体，二抗为与生物素结合的兔抗小鼠抗体，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。免疫组化染色的主要操作步骤：用3% H2O2室温孵育培养的小梁细胞5～10 min，以灭活细胞中内源性酶，蒸馏水洗3次。复合消化酶消化5～10 min后，再用蒸馏水洗3次，滴加正常小牛血清封闭液，室温放置20 min。滴加1∶100稀释的特异性一抗工作液，37℃下孵育30～60 min或4℃下过夜。PBS洗3次后，滴加生物素标记的二抗工作液，37℃下孵育20 min。DAB(dimethylaminoazobenzene)室温显色。最后以酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
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三、高眼压模型
密闭培养瓶，用空针从培养瓶塞中注入无菌空气加压，同时从与培养瓶相通的压力表中直接读取压力值。压力分别为20、40、60及80 mm Hg。在37℃恒温下培养24 h。
四、原位杂交
iNOS探针购自德国Beohringer Mannheim公司。探针的标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。主要操作步骤：细胞标本用4%多聚甲醛固定后，依次用PBS浸洗、0.2 mol/L HCl处理、4 mg/L蛋白酶K消化、甘氨酸浸洗后，37℃预杂交1～2 h，以2 mg/L的探针浓度配成杂交液，在42℃恒温水浴中杂交36 h，其后分别经梯度递减的系列标准柠檬酸盐溶液漂洗，再置入地高辛抗体工作液(1∶1 000)中，37℃下1 h，分别依次用PBS、缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅲ漂洗，加入新鲜配制的显色液，室温避光显色1～2 h，用缓冲液Ⅲ终止反应，最后用酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
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1.原位杂交阴性对照：在杂交前需用RNA酶(105 U/L)于37℃下预处理细胞标本30 min，杂交液中不加标记探针。
2.原位杂交阳性对照：杂交前不用RNA酶处理标本，杂交探针用β-actin。
五、还原型辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)组织化学染色方法：将新鲜牛眼小梁细胞标本用4%多聚甲醛固定，以0.01 mol/L PBS漂洗5 min，共2次；在下列配置的新鲜工作液中反应1 h：1.5 mg NADPH(上海生物制品研究所产品)，0.375 mg四硝基唑蓝(nitroblue tetrazolium, NBT，美国Sigma公司产品)，1.5 Tris-HCl缓冲液(含0.25% Triton X-100)；双蒸馏水终止反应；明胶玻片贴片，晾干；常规脱水、透明、封片。
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六、图像分析及统计学方法
将各组原位杂交和免疫组化染色标本置显微镜下取20个细胞，用TJTY-300型全自动医学图像分析系统测吸光度A值，以SAS软件分别对测得的数据进行统计学处理。
结果
一、小梁细胞形态特点
小梁组织块接种5～7 d后，小梁细胞开始从组织块周围长出，贴壁并向远处移行。原代细胞形态大小不一，传代后细胞形态逐渐趋于一致。小梁细胞核仁明显，细胞表面有长短不一的突起，有绒毛状皱褶，有些细胞呈扇形散开(图1)。随着细胞传代次数增多，小梁细胞形态逐渐紊乱，甚至重叠生长。
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图1 相差显微镜下活的小梁细胞 ×200
二、波形蛋白免疫组化染色结果
小梁细胞波形蛋白染色为阳性，胞浆呈棕黄色(图3)。
图2 小梁细胞波形蛋白免疫组化染色阳性 ×100
三、原位杂交检测iNOS mRNA的表达
iNOS mRNA的表达呈蓝色颗粒，主要分布于胞浆及核仁。对照组小梁细胞有较弱的杂交信号(图3)；加压组iNOS mRNA表达呈随压力增高而逐渐增高的趋势(图4，5)。全自动图像分析结果(以吸光度A值表示)：对照组为0.110 8±0.010 9,加压20 mm Hg组为0.111 0±0.005 7,加压40 mm Hg组为0.157 0±0.007 2,加压60 mm Hg组为0.162 5±0.007 6,加压80 mm Hg组为0.189 4±0.010 8。对照组与加压20 mm Hg组相比，吸光度A值差异无显著性(t=0.095 1,P>0.05)；与加压40、60 mm Hg组相比，A值差异均有显著性(t值分别为0.038 1和0.032 4,P<0.05)；与80 mm Hg组相比，A值差异有非常显著性(t=0.000 16,P<0.01)；40 mm Hg组与60 mm Hg组相比，A值差异无显著性(t=0.112 3,P>0.05)；而60 mm Hg组与80 mm Hg组相比，A值差异有非常显著性(t=0.004 5,P<0.01)。
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图3 不加压组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交，呈弱阳性 ×200
图4 压力为60 mm Hg组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交 ×200
图5 压力为80 mm Hg组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交 ×200
四、NOS蛋白质NADPH染色
NOS蛋白质NADPH染色阳性颗粒呈蓝色，仅分布于胞浆中(图6)。对照组亦有一定量的表达，加压组的蛋白质含量随着压力的增高而增高。图像分析结果(以吸光度A值表示)基本与mRNA表达相同：对照组为0.141 2±0.001 3,加压20 mm Hg组为0.147 9±0.005 5,加压40 mm Hg组为0.171 0±0.006 2,加压60 mm Hg组为0.182 4±0.007 0,加压80 mm Hg组为0.200 6±0.008 9。仅加压40 mm Hg组与60 mm Hg组吸光度A值差异有显著性(t=0.042 0,P<0.05)。结果提示压力可刺激小梁细胞合成NOS，并在压力逐渐增高时表达增强。
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图6 压力为40 mm Hg组，小梁细胞NADPH组织化学染色 ×200
讨论
一、采用体外培养的小梁细胞模型进行青光眼研究的意义
以体外培养的小梁细胞为模型，进行病理、生理及药理学等方面的研究是目前国内外青光眼实验性研究的重要手段之一。我们参照王林等[1]及Hernandez等[2]的组织块培养方法进行牛眼小梁细胞培养，其细胞的生长周期、形态学特点及波形蛋白免疫组织化学阳性染色的表达特点均与其他作者报道的相似[1，3]。因此，我们采用此细胞系为模型，研究压力对iNOS mRNA的表达及其对蛋白质合成的影响。
二、NO的生化代谢特点及其生物学效应
NO是近十余年来新发现的小分子活性物质，其在循环、呼吸、消化、内分泌、神经及免疫系统中的生理、生化、病理及药理学意义已成为近几年研究的热点之一。内源性NO的半衰期很短(约10～20 s)，其代谢途径主要是：L-精氨酸、分子氧、NADPH和ATP在NOS催化下，转化为L-胍氨酸，然后进一步氧化生成稳定的NO和代谢终产物而失去活性。已知NO通过兴奋鸟苷酸环化酶使环磷酸鸟苷(cGMP)增加，通过依赖cGMP的蛋白激酶调节磷酸二酯酶和离子通道，以产生多种生物学效应[4]。
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三、NOS的分型及其病理、生理作用
一般将NOS分为结构型酶(constitutive nitric oxide sythase , cNOS)和iNOS。cNOS本身以无活性形式存在于细胞内，依赖Ca2+激活后，仅产生少量的NO(10-12 mol/L)以维持正常的生理功能[5]；而iNOS在正常的生理情况下并不存在，在细胞因子等刺激因素作用下，可诱导iNOS mRNA的表达，并合成iNOS。我们采用的加压方法也可达到同样目的。iNOS的特点是不需Ca2+和钙调节蛋白的参与，即可产生大量的NO(10-9 mol/L)[5]。在眼内NO具有极为复杂的双重性：(1)cNOS催化的NO主要参与维持眼的正常生理功能，如调节血管的张力，增加血液供应；扩张小梁网，影响房水动力学，增加房水流畅系数和降低眼内压；作为神经递质参与光的传导等[6，7]。(2)iNOS催化产生的NO远远高于生理含量，通过增加细胞内Ca2+浓度，作为强自由基破坏细胞的呼吸链，耗竭细胞的ATP，挫伤DNA，产生细胞毒性作用，最终导致细胞凋亡[8]。本实验中发现小梁细胞中的iNOS mRNA表达量及蛋白质合成量均随压力的逐渐增高而增大，且iNOS mRNA的含量与蛋白质合成量NO的产生变化基本平行。实验结果提示眼压因素在青光眼的发生、发展中起着重要作用，可单独成为激活iNOS的刺激因素。对照组和压力为20 mm Hg组小梁细胞的iNOS mRNA呈弱表达，同时免疫组化染色也呈弱阳性，这可能与iNOS和cNOS的基因序列有一定的同源性有关。已有研究表明生理状态下小梁网上含有cNOS[9]。
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四、iNOS与青光眼的关系
高眼压激活iNOS，可能与视网膜神经纤维的损伤有关。NO为嗜脂性物质，易于穿透细胞膜直接扩散或进入靶细胞[10]，高眼压激活并产生过量的NO,不仅以其较强的细胞毒性作用损伤小梁细胞，引起小梁网功能缺失，房水流出阻力增加，而且将损伤小梁网周围的组织，如葡萄膜和视网膜。已有研究表明，NO在扩张血管的同时增加了血管的通透性，使细胞及蛋白质渗出增加。由此推测虹膜睫状体的血管扩张导致了房水的分泌量增大，继而房水中的细胞及蛋白质增多，又加大了房水流出的阻力。Neufeld等[11]用NOS多克隆抗体检测开角型青光眼患者视乳头的NOS含量时发现，青光眼患者的各型NOS含量明显高于正常人，并认为iNOS加速了视网膜神经节细胞的退行性变，而cNOS则有扩张血管、增加组织血液供应和保护视神经的积极作用。
综上所述，压力可以单独激活小梁细胞iNOS mRNA的表达，增加细胞内iNOS含量，由此产生超生理作用的NO可能成为损伤小梁细胞、导致或加重青光眼的因素之一。因此，研究NO在青光眼发病机制中的作用，旨在从新的角度防治青光眼。
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作者单位：薛蔚(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院眼科)
杜蜀华(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院眼科)
李勇(同济医科大学附属协和医院普外科)
黄恺(同济医科大学附属协和医院心血管内科)
参考文献
1.王林，魏厚仁，曾水清，等. 人眼小梁细胞组织培养及超微结构观察. 中华眼科杂志, 1989,25: 97-99.
2.Hernandez MR, Weinstein BI, Schwartz J. et al. Human trabecular meshwork cells in culture: morphology and extracellular matrix components. Invest Ophthalmol Vis Sci,1987, 28: 1655-1660.
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3.贺翔鸽，李美玉.人眼小梁细胞培养及免疫组化特性研究.中华眼科杂志，1998,34:280-282.
4.Garthwaite J, Garthwaite G, Palmer RM, et al. NMDA recerptor activation induces nitric oxide synthase from arginine in rat brain slice. Eur J Pharmacol,1989,172:413-417.
5.Wang R, Ghahary A, Shen YJ, et al. Nitric oxide synthase expression and nitric oxide production are reduced in hypertrophic scar tissue and fibroblasts. J Invest Dermatol, 1997,108:438-444.
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6.Wiederholt M, Sturm A, Lespple-Wienhue A, et al. Relaxation of trabecular meshwork and ciliary muscle by nitric release of oxide. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35:2515-2520.
7.Savchenko A, Barnes S, Kramer RH. Cyclic-nucleotide-gated channels mediate synaptic feedback by nitric oxide. Nature, 1997,390:694-698.
8.Sparapani M, Dall′Olio R, Gandolfi O, et al. Neurotoxicity of polyamines and pharmacological neuroprotection in cultures of rat cerebellar granule cells. Exp Neurol, 1997,148:157-166.
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9.Nathanson JA, McKee M. Identification of an extensive system of nitric oxide-producing cells in the ciliary muscle and outflow pathway of the human eye. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1995,36:1765-1773.
10.余跃， 陈新加. 一氧化氮与疾病.武汉：科学出版社，1998.12-24.
11.Neufeld AH, Hernandez MR, Gonzalez M. Nitric oxide synthase in the human glaucomatous optic nerve head. Arch Ophthalmol, 1997,115:497-503., 百拇医药
薛蔚 杜蜀华 李勇 黄恺
摘 要 目的 研究牛眼小梁细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在不同压力下的mRNA表达及蛋白质合成的变化，探讨一氧化氮(nitric oxide，NO)在青光眼发病中的作用。方法 培养新生牛眼小梁细胞，并分别给予20、40、60及80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)的压力，以不加压组为对照组，用原位杂交和还原型辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)组织化学染色技术对小梁细胞iNOS的mRNA和蛋白质含量变化进行定性及定量观察。结果 牛眼小梁细胞中iNOS mRNA 及蛋白质含量均随压力增高而增高。对照组与压力20 mm Hg组比较，两组iNOS mRNA均为弱表达，组间差异无显著性(t=0.950 1,P>0.05)；压力40 mm Hg和60 mm Hg组与对照组相比差异有显著性(t值分别为0.038 1和0.032 4,P<0.05)；压力80 mm Hg组与对照组相比差异有非常显著性(t=0.000 16,P<0.01)；压力40 mm Hg组与60 mm Hg组相比，组间差异无显著性(t=0.112 3,P>0.05)，而与80 mm Hg组相比差异有非常显著性(t值分别为0.002 9和0.004 5,P<0.01)。NADPH组织化学染色结果与原位杂交结果基本相同，仅显示40 mm Hg组与60 mm Hg组的组间差异有显著性(t=0.042 0,P<0.05)。结论 压力可激活iNOS mRNA表达，由此产生过量的NO可损伤小梁细胞，成为导致或加重青光眼的因素之一。
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关键词：小梁网；一氧化氮；原位杂交；免疫组织化学
一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来受到广泛重视的小分子物质，人们在研究过程中发现，它具有十分复杂的双重性，既是不可缺少的神经递质、免疫活性物质，又具有细胞毒性作用。NO在眼球内广泛分布并参与多种病理生理过程。以往的青光眼研究结果提示在不抑制房水生成的情况下，NO能改善房水流畅系数，以降低眼压；NO神经元广泛分布于房角及视网膜神经纤维层，而青光眼患者小梁网和睫状体处的NO神经纤维比正常人明显减少；NO可通过多种途径，如增加自由基和细胞内Ca2+浓度，对视网膜神经节细胞产生直接毒性作用。因此，我们以体外培养的牛眼小梁细胞为模型，用原位杂交及组织化学染色方法，研究压力对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)mRNA的表达及蛋白质合成的影响，并初步探讨其与青光眼发病的关系。
材料与方法
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一、小梁细胞的培养
新生小牛宰杀后立即取出眼球，在6 h内按王林等[1]及Hernandez等[2]的培养方法进行小梁细胞培养。于角膜后缘5 mm处环形剪开眼球，去除玻璃体、晶状体及葡萄膜，在解剖显微镜下找到小梁网，用眼科镊顺其方向撕下海绵状小梁网(撕下小梁网后，在角巩膜交界处可见位置很浅的巩膜内沟)，将小梁网剪成细小的碎块，放入含20%小牛血清的RPIM-1640培养基中进行小梁细胞培养。将第3～5代细胞消化后，传代于铺满小盖玻片的培养瓶中，待细胞长满80%后，用于制备高眼压模型。
二、波形蛋白免疫组化染色
一抗为小鼠抗人和小鼠抗动物波形蛋白多克隆抗体，二抗为与生物素结合的兔抗小鼠抗体，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。免疫组化染色的主要操作步骤：用3% H2O2室温孵育培养的小梁细胞5～10 min，以灭活细胞中内源性酶，蒸馏水洗3次。复合消化酶消化5～10 min后，再用蒸馏水洗3次，滴加正常小牛血清封闭液，室温放置20 min。滴加1∶100稀释的特异性一抗工作液，37℃下孵育30～60 min或4℃下过夜。PBS洗3次后，滴加生物素标记的二抗工作液，37℃下孵育20 min。DAB(dimethylaminoazobenzene)室温显色。最后以酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
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三、高眼压模型
密闭培养瓶，用空针从培养瓶塞中注入无菌空气加压，同时从与培养瓶相通的压力表中直接读取压力值。压力分别为20、40、60及80 mm Hg。在37℃恒温下培养24 h。
四、原位杂交
iNOS探针购自德国Beohringer Mannheim公司。探针的标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。主要操作步骤：细胞标本用4%多聚甲醛固定后，依次用PBS浸洗、0.2 mol/L HCl处理、4 mg/L蛋白酶K消化、甘氨酸浸洗后，37℃预杂交1～2 h，以2 mg/L的探针浓度配成杂交液，在42℃恒温水浴中杂交36 h，其后分别经梯度递减的系列标准柠檬酸盐溶液漂洗，再置入地高辛抗体工作液(1∶1 000)中，37℃下1 h，分别依次用PBS、缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅲ漂洗，加入新鲜配制的显色液，室温避光显色1～2 h，用缓冲液Ⅲ终止反应，最后用酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
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1.原位杂交阴性对照：在杂交前需用RNA酶(105 U/L)于37℃下预处理细胞标本30 min，杂交液中不加标记探针。
2.原位杂交阳性对照：杂交前不用RNA酶处理标本，杂交探针用β-actin。
五、还原型辅酶Ⅱ硫辛酰胺脱氢酶(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)组织化学染色方法：将新鲜牛眼小梁细胞标本用4%多聚甲醛固定，以0.01 mol/L PBS漂洗5 min，共2次；在下列配置的新鲜工作液中反应1 h：1.5 mg NADPH(上海生物制品研究所产品)，0.375 mg四硝基唑蓝(nitroblue tetrazolium, NBT，美国Sigma公司产品)，1.5 Tris-HCl缓冲液(含0.25% Triton X-100)；双蒸馏水终止反应；明胶玻片贴片，晾干；常规脱水、透明、封片。
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六、图像分析及统计学方法
将各组原位杂交和免疫组化染色标本置显微镜下取20个细胞，用TJTY-300型全自动医学图像分析系统测吸光度A值，以SAS软件分别对测得的数据进行统计学处理。
结果
一、小梁细胞形态特点
小梁组织块接种5～7 d后，小梁细胞开始从组织块周围长出，贴壁并向远处移行。原代细胞形态大小不一，传代后细胞形态逐渐趋于一致。小梁细胞核仁明显，细胞表面有长短不一的突起，有绒毛状皱褶，有些细胞呈扇形散开(图1)。随着细胞传代次数增多，小梁细胞形态逐渐紊乱，甚至重叠生长。
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图1 相差显微镜下活的小梁细胞 ×200
二、波形蛋白免疫组化染色结果
小梁细胞波形蛋白染色为阳性，胞浆呈棕黄色(图3)。
图2 小梁细胞波形蛋白免疫组化染色阳性 ×100
三、原位杂交检测iNOS mRNA的表达
iNOS mRNA的表达呈蓝色颗粒，主要分布于胞浆及核仁。对照组小梁细胞有较弱的杂交信号(图3)；加压组iNOS mRNA表达呈随压力增高而逐渐增高的趋势(图4，5)。全自动图像分析结果(以吸光度A值表示)：对照组为0.110 8±0.010 9,加压20 mm Hg组为0.111 0±0.005 7,加压40 mm Hg组为0.157 0±0.007 2,加压60 mm Hg组为0.162 5±0.007 6,加压80 mm Hg组为0.189 4±0.010 8。对照组与加压20 mm Hg组相比，吸光度A值差异无显著性(t=0.095 1,P>0.05)；与加压40、60 mm Hg组相比，A值差异均有显著性(t值分别为0.038 1和0.032 4,P<0.05)；与80 mm Hg组相比，A值差异有非常显著性(t=0.000 16,P<0.01)；40 mm Hg组与60 mm Hg组相比，A值差异无显著性(t=0.112 3,P>0.05)；而60 mm Hg组与80 mm Hg组相比，A值差异有非常显著性(t=0.004 5,P<0.01)。
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图3 不加压组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交，呈弱阳性 ×200
图4 压力为60 mm Hg组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交 ×200
图5 压力为80 mm Hg组，小梁细胞iNOS mRNA原位杂交 ×200
四、NOS蛋白质NADPH染色
NOS蛋白质NADPH染色阳性颗粒呈蓝色，仅分布于胞浆中(图6)。对照组亦有一定量的表达，加压组的蛋白质含量随着压力的增高而增高。图像分析结果(以吸光度A值表示)基本与mRNA表达相同：对照组为0.141 2±0.001 3,加压20 mm Hg组为0.147 9±0.005 5,加压40 mm Hg组为0.171 0±0.006 2,加压60 mm Hg组为0.182 4±0.007 0,加压80 mm Hg组为0.200 6±0.008 9。仅加压40 mm Hg组与60 mm Hg组吸光度A值差异有显著性(t=0.042 0,P<0.05)。结果提示压力可刺激小梁细胞合成NOS，并在压力逐渐增高时表达增强。
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图6 压力为40 mm Hg组，小梁细胞NADPH组织化学染色 ×200
讨论
一、采用体外培养的小梁细胞模型进行青光眼研究的意义
以体外培养的小梁细胞为模型，进行病理、生理及药理学等方面的研究是目前国内外青光眼实验性研究的重要手段之一。我们参照王林等[1]及Hernandez等[2]的组织块培养方法进行牛眼小梁细胞培养，其细胞的生长周期、形态学特点及波形蛋白免疫组织化学阳性染色的表达特点均与其他作者报道的相似[1，3]。因此，我们采用此细胞系为模型，研究压力对iNOS mRNA的表达及其对蛋白质合成的影响。
二、NO的生化代谢特点及其生物学效应
NO是近十余年来新发现的小分子活性物质，其在循环、呼吸、消化、内分泌、神经及免疫系统中的生理、生化、病理及药理学意义已成为近几年研究的热点之一。内源性NO的半衰期很短(约10～20 s)，其代谢途径主要是：L-精氨酸、分子氧、NADPH和ATP在NOS催化下，转化为L-胍氨酸，然后进一步氧化生成稳定的NO和代谢终产物而失去活性。已知NO通过兴奋鸟苷酸环化酶使环磷酸鸟苷(cGMP)增加，通过依赖cGMP的蛋白激酶调节磷酸二酯酶和离子通道，以产生多种生物学效应[4]。
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三、NOS的分型及其病理、生理作用
一般将NOS分为结构型酶(constitutive nitric oxide sythase , cNOS)和iNOS。cNOS本身以无活性形式存在于细胞内，依赖Ca2+激活后，仅产生少量的NO(10-12 mol/L)以维持正常的生理功能[5]；而iNOS在正常的生理情况下并不存在，在细胞因子等刺激因素作用下，可诱导iNOS mRNA的表达，并合成iNOS。我们采用的加压方法也可达到同样目的。iNOS的特点是不需Ca2+和钙调节蛋白的参与，即可产生大量的NO(10-9 mol/L)[5]。在眼内NO具有极为复杂的双重性：(1)cNOS催化的NO主要参与维持眼的正常生理功能，如调节血管的张力，增加血液供应；扩张小梁网，影响房水动力学，增加房水流畅系数和降低眼内压；作为神经递质参与光的传导等[6，7]。(2)iNOS催化产生的NO远远高于生理含量，通过增加细胞内Ca2+浓度，作为强自由基破坏细胞的呼吸链，耗竭细胞的ATP，挫伤DNA，产生细胞毒性作用，最终导致细胞凋亡[8]。本实验中发现小梁细胞中的iNOS mRNA表达量及蛋白质合成量均随压力的逐渐增高而增大，且iNOS mRNA的含量与蛋白质合成量NO的产生变化基本平行。实验结果提示眼压因素在青光眼的发生、发展中起着重要作用，可单独成为激活iNOS的刺激因素。对照组和压力为20 mm Hg组小梁细胞的iNOS mRNA呈弱表达，同时免疫组化染色也呈弱阳性，这可能与iNOS和cNOS的基因序列有一定的同源性有关。已有研究表明生理状态下小梁网上含有cNOS[9]。
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四、iNOS与青光眼的关系
高眼压激活iNOS，可能与视网膜神经纤维的损伤有关。NO为嗜脂性物质，易于穿透细胞膜直接扩散或进入靶细胞[10]，高眼压激活并产生过量的NO,不仅以其较强的细胞毒性作用损伤小梁细胞，引起小梁网功能缺失，房水流出阻力增加，而且将损伤小梁网周围的组织，如葡萄膜和视网膜。已有研究表明，NO在扩张血管的同时增加了血管的通透性，使细胞及蛋白质渗出增加。由此推测虹膜睫状体的血管扩张导致了房水的分泌量增大，继而房水中的细胞及蛋白质增多，又加大了房水流出的阻力。Neufeld等[11]用NOS多克隆抗体检测开角型青光眼患者视乳头的NOS含量时发现，青光眼患者的各型NOS含量明显高于正常人，并认为iNOS加速了视网膜神经节细胞的退行性变，而cNOS则有扩张血管、增加组织血液供应和保护视神经的积极作用。
综上所述，压力可以单独激活小梁细胞iNOS mRNA的表达，增加细胞内iNOS含量，由此产生超生理作用的NO可能成为损伤小梁细胞、导致或加重青光眼的因素之一。因此，研究NO在青光眼发病机制中的作用，旨在从新的角度防治青光眼。
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作者单位：薛蔚(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院眼科)
杜蜀华(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院眼科)
李勇(同济医科大学附属协和医院普外科)
黄恺(同济医科大学附属协和医院心血管内科)
参考文献
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10.余跃， 陈新加. 一氧化氮与疾病.武汉：科学出版社，1998.12-24.
11.Neufeld AH, Hernandez MR, Gonzalez M. Nitric oxide synthase in the human glaucomatous optic nerve head. Arch Ophthalmol, 1997,115:497-503., 百拇医药