更生霉素抗氩绿激光诱导的鼠视网膜组织损伤的研究
更生霉素抗氩绿激光诱导的鼠视网膜组织损伤的研究
刘怡 何守志
摘 要 目的 探讨更生霉素对氩绿激光诱导的SD大鼠视网膜组织损伤的抑制作用。方法 大鼠双眼激光照射后即刻、8、20 h分别于玻璃体腔内注射不同浓度的更生霉素(10 g/L、5 g/L、2.5 g/L),对照眼注射生理盐水，激光后24 h取双眼眼球，视网膜组织切片行甲基绿-哌洛宁染色，计数每个激光斑皱缩细胞、正常细胞、总细胞数。结果 更生霉素可明显降低激光斑处的皱缩细胞及累及的总细胞数，实验组与对照组有显著差别，以用药后即刻及8h作用最明显，随给药时间的延后，药物浓度的增加并不能增强抗损伤作用。结论 更生霉素有抗激光损伤的作用，给药时间对抗激光损伤作用有重要影响。
, http://www.100md.com 关键词：更生霉素；激光；视网膜
我们以往曾观察激光在不同能量、不同取材时间对SD大鼠视网膜组织细胞的影响，实验结果表明，光斑大小为100 μm、光凝时间为0.2 s、能量为350 mW时，激光斑处受损伤细胞占总细胞数的50%，发生高峰期为激光作用后24～36 h[1]。本实验在上述结果的基础上，探讨和寻求对中、低能量激光眼损伤的防护措施。采用细胞转录水平的抑制剂即更生霉素作为实验材料，观察其抗激光诱导的视网膜组织损伤作用，现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.动物：SD大鼠18只(解放军总医院实验动物中心提供)，体重150～200 g，雌雄不限。
2.主要仪器及试剂：氩离子激光器(NOVAS 2000， 美国Coherent公司)，发射波长514 nm的绿色激光；光斑直径50～500 μm可调；最大输出功率为3.50 W(角膜表面聚焦)。日本Topcon OM-300 手术显微镜。 微量进样器0.5 μl(上海安亭微量进样器生产厂)。更生霉素(北京鼎国生物技术发展公司)。
, 百拇医药
二、方法
1.动物模型的制备：SD大鼠右眼为实验眼，左眼为对照眼。实验前30 min肌肉注射苯巴比妥钠20 mg/kg体重,使用浓度10 g/L，复方托品酰胺充分散瞳。于眼前放-53 D前置镜，每只眼在视乳头1.5～2.0 PD外，即中周部视网膜4个象限均匀光凝40个点。激光照射时间0.2 s，照射光斑100 μm，能量输出功率300 mW。激光照射后分别于即刻、8 h、20 h在手术显微镜下行大鼠睫状体平坦部穿刺,于玻璃体腔内注射0.25 μl更生霉素，浓度分别为10、5、2.5 g/L；对照眼分别注射0.25 μl生理盐水。并于激光照射后24 h取双眼眼球,10%甲醛液固定，沿角巩膜缘后1 mm冠状位切开眼球，取出眼内容物，眼球后半部分经脱水、透明、浸蜡、包埋等，制成石蜡切片，重复上述实验一次。切片规则:36只眼球冠状位均从视神经向周边视网膜方向切削0.5 mm,然后分别做30张5 μm厚连续切片。
2.甲基绿-哌洛宁染色(methyl green-Pyronin，MG-P染色)[2]：先将甲基绿水溶液用三氯甲烷提纯，置冰箱内保存。MG-P染液于使用前新鲜配制：2%甲基绿水溶液5 ml，5%哌洛宁水溶液1 ml, 蒸馏水12 ml, 0.2 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.8)18 ml混合即可得到甲基绿-哌洛宁染液, 样品片置甲基绿-哌洛宁溶液中染色15 min。不经水洗，用滤纸吸干多余染液，用95%酒精洗去多余染液，100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
, 百拇医药
3. 细胞计数方法与统计学处理：在显微镜下从每个样本的30张连续切片中，任意挑选4个不同位置的激光斑，分别选出该4个激光斑的最大剖面直径切片2张，即每个样本有8张切片计数，用方格测微器分别计数激光斑处外颗粒层感光细胞总数、细胞核被绿染的细胞(正常细胞)数及被紫红色染的细胞(皱缩细胞)数，2张切片的平均数为此激光斑最大剖面直径下的总细胞数、正常细胞数、皱缩细胞数。本实验采用自身对照设计及2个实验因素3个因素水平的析因设计，共9个实验组,每组2只SD大鼠,各8对实验数值,数据在SAS统计软件包下进行处理，分别进行t检验及F检验。
结果
一、激光照射后视网膜病理改变
激光斑处外颗粒层细胞的损伤细胞即皱缩细胞的细胞核被染成紫红色，正常细胞胞核被染成绿色，二者的界限分明。
二、应用更生霉素后激光斑改变
, 百拇医药
自身对照设计实验组与对照组比较差异有显著性，正常细胞t=2.324, P=0.04; 皱缩细胞t=4.223, P=0.000 3;总细胞t=4.879,P=0.000 3。各组除2.5 g/L，20 h组外，其余与对照组比较差异均有显著性。激光斑处皱缩细胞最多可减少74.5%，激光累及细胞总数减少63.9%。
三、析因设计统计结果
由表1，2可见总细胞数指标中时间因素为主要作用因素，药物浓度及两因素交互作用无统计学意义。在皱缩细胞数与正常细胞数两指标中2个实验因素及其交互作用均有统计学意义，在分别控制1个时间因素水平后对比药物组间差异发现给药时间为即刻时，3个药物浓度水平无组间差别，均为有效实验因素，随着给药时间的延后，低浓度2.5 g/L组显示与另2个高浓度组差异有显著性。同样在控制药物浓度水平后对比给药时间组间差别时发现，即刻和8 h组均与20 h组差异有显著性。
表1 SD大鼠视网膜各观察指标统计结果
, 百拇医药
观察指标
总效应
给药时间
药物浓度
交互作用
F值
P值
F值
P值
F值
P值
F值
P值
, 百拇医药 总细胞数
3.48
0.002
11.24
0.000
0.35
0.707
1.17
0.334
皱缩细胞
37.95
0.000
124.61
, 百拇医药
0.000
19.41
0.001
3.89
0.007
正常细胞
20.59
0.000
75.44
0.000
0.43
0.653
3.25
, 百拇医药
0.010
表2 SD大鼠视网膜皱缩细胞及正常细胞两实验因素控制于不同水平的组间差别
因素水平
皱缩细胞数
正常细胞数
F值
P值
组间差别
F值
P值
组间差别
时间
, http://www.100md.com
T1(即刻)
1.14
0.339
C1C2C3
6.49
0.006 4
C*1C2C*3
T2( 8 h)
, http://www.100md.com
13.73
0.000
C1C2C*3
3.70
0.060 0
C1C2C3
T3(20 h)
11.61
0.000
C1C2C*3
, 百拇医药
0.61
0.551 0
C1C2C3
浓度
C1(10 g/L)
3.10
0.000
T1T2T*3
23.26
, 百拇医药
0.000 0
T1T2T*3
C2( 5 g/L)
34.55
0.000
T1T2T*3
20.37
0.000 0
T1T2T*3
, 百拇医药
C3(2.5 g/L)
82.11
0.001
T1T2T*3
39.61
0.000 0
T*1T*2T*3
注：组间差别栏中有*组与无*组间差异有显著性，无*组组间差异无显著性，有*组组间差异有显著性
, http://www.100md.com
讨论
甲基绿-哌洛宁染色法(methyl green-Pyronin, MG-P染色法)是一种古老的染色方法，它是近百年前由Pappenhein和Unna提出的。已证实MG可特异性地着色细胞核的DNA，Pyronin特异性着色胞浆和核仁RNA，甲基绿染色为绿色，哌洛宁为红色，由于这种染色方法能良好地同时显示细胞的DNA和RNA，所以迄今这种染色方法在生物领域有着广泛的应用。细胞受损伤时细胞蛋白质合成增加，合成的蛋白质可进一步促进细胞的裂解，胞浆粗面内质网及游离核糖体和核仁区域内的RNA增多，在正常视网膜组织的外颗粒层细胞由于DNA多，细胞核被染成绿色，损伤的细胞核被染成紫红色。
更生霉素，可嵌入到DNA双螺旋链中相邻的鸟嘌呤和胞嘧啶碱基对之间，与DNA结合成复合体，阻碍RNA多聚酶(转录酶)的功能，阻止RNA尤其是mRNA和蛋白质的合成，裂解蛋白减少从而阻止受损细胞被破坏。
实验表明更生霉素有抗损伤作用，激光斑处皱缩细胞最多可减少74.5%，激光累及细胞总数减少63.9%，较文献[3]提及的作用率略低，可能与更生霉素的纯度以及观察的组织不同有关。值得注意的是，时间因素在本实验中起着重要的作用，药物在激光照射后即刻和8 h时最有效，时间越早，药物的组间差异越小，高浓度与低浓度药物药效相当，随着给药时间的延后，必须增加药物浓度以维持疗效；至20 h时，即使是高浓度药物的疗效也与前2个时间的疗效比较有显著差别，低浓度药物(2.5 g/L)在此时已完全无效。这说明细胞转录、蛋白质合成是需要时间的，只有在此时间之前给药，方可抑制细胞损伤，否则即使大量增加药物浓度也无济于事。在中等药物浓度(5 g/L)以上时，即刻与8 h时给药无组间差别；而在低药物浓度时，则给药时间越早越好。
, 百拇医药
基金项目：军队‘九五’医药卫生科研基金资助(96M143)
刘怡 研究生
作者单位：刘怡(解放军第三○六医院激光治疗中心，100101)
何守志(100853 北京，解放军总医院眼科)
参考文献
1.刘怡，何守志.氩绿激光致SD大鼠视网膜组织细胞凋亡的实验研究.眼科研究，1999，17：448-450.
2.朱曰林，赵崇德.甲基绿-哌洛宁染色法研究进展.中国组织化学与细胞化学杂志，1996，5：227-230.
3.Rabacchi SA,Bonfanti L,Liu XH,et al.Apoptotic cell death induced by optic nerve lesion in the neonatal rat.J Neurosci,1994,14:5292-5301., 百拇医药
刘怡 何守志
摘 要 目的 探讨更生霉素对氩绿激光诱导的SD大鼠视网膜组织损伤的抑制作用。方法 大鼠双眼激光照射后即刻、8、20 h分别于玻璃体腔内注射不同浓度的更生霉素(10 g/L、5 g/L、2.5 g/L),对照眼注射生理盐水，激光后24 h取双眼眼球，视网膜组织切片行甲基绿-哌洛宁染色，计数每个激光斑皱缩细胞、正常细胞、总细胞数。结果 更生霉素可明显降低激光斑处的皱缩细胞及累及的总细胞数，实验组与对照组有显著差别，以用药后即刻及8h作用最明显，随给药时间的延后，药物浓度的增加并不能增强抗损伤作用。结论 更生霉素有抗激光损伤的作用，给药时间对抗激光损伤作用有重要影响。
, http://www.100md.com 关键词：更生霉素；激光；视网膜
我们以往曾观察激光在不同能量、不同取材时间对SD大鼠视网膜组织细胞的影响，实验结果表明，光斑大小为100 μm、光凝时间为0.2 s、能量为350 mW时，激光斑处受损伤细胞占总细胞数的50%，发生高峰期为激光作用后24～36 h[1]。本实验在上述结果的基础上，探讨和寻求对中、低能量激光眼损伤的防护措施。采用细胞转录水平的抑制剂即更生霉素作为实验材料，观察其抗激光诱导的视网膜组织损伤作用，现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.动物：SD大鼠18只(解放军总医院实验动物中心提供)，体重150～200 g，雌雄不限。
2.主要仪器及试剂：氩离子激光器(NOVAS 2000， 美国Coherent公司)，发射波长514 nm的绿色激光；光斑直径50～500 μm可调；最大输出功率为3.50 W(角膜表面聚焦)。日本Topcon OM-300 手术显微镜。 微量进样器0.5 μl(上海安亭微量进样器生产厂)。更生霉素(北京鼎国生物技术发展公司)。
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二、方法
1.动物模型的制备：SD大鼠右眼为实验眼，左眼为对照眼。实验前30 min肌肉注射苯巴比妥钠20 mg/kg体重,使用浓度10 g/L，复方托品酰胺充分散瞳。于眼前放-53 D前置镜，每只眼在视乳头1.5～2.0 PD外，即中周部视网膜4个象限均匀光凝40个点。激光照射时间0.2 s，照射光斑100 μm，能量输出功率300 mW。激光照射后分别于即刻、8 h、20 h在手术显微镜下行大鼠睫状体平坦部穿刺,于玻璃体腔内注射0.25 μl更生霉素，浓度分别为10、5、2.5 g/L；对照眼分别注射0.25 μl生理盐水。并于激光照射后24 h取双眼眼球,10%甲醛液固定，沿角巩膜缘后1 mm冠状位切开眼球，取出眼内容物，眼球后半部分经脱水、透明、浸蜡、包埋等，制成石蜡切片，重复上述实验一次。切片规则:36只眼球冠状位均从视神经向周边视网膜方向切削0.5 mm,然后分别做30张5 μm厚连续切片。
2.甲基绿-哌洛宁染色(methyl green-Pyronin，MG-P染色)[2]：先将甲基绿水溶液用三氯甲烷提纯，置冰箱内保存。MG-P染液于使用前新鲜配制：2%甲基绿水溶液5 ml，5%哌洛宁水溶液1 ml, 蒸馏水12 ml, 0.2 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.8)18 ml混合即可得到甲基绿-哌洛宁染液, 样品片置甲基绿-哌洛宁溶液中染色15 min。不经水洗，用滤纸吸干多余染液，用95%酒精洗去多余染液，100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
, 百拇医药
3. 细胞计数方法与统计学处理：在显微镜下从每个样本的30张连续切片中，任意挑选4个不同位置的激光斑，分别选出该4个激光斑的最大剖面直径切片2张，即每个样本有8张切片计数，用方格测微器分别计数激光斑处外颗粒层感光细胞总数、细胞核被绿染的细胞(正常细胞)数及被紫红色染的细胞(皱缩细胞)数，2张切片的平均数为此激光斑最大剖面直径下的总细胞数、正常细胞数、皱缩细胞数。本实验采用自身对照设计及2个实验因素3个因素水平的析因设计，共9个实验组,每组2只SD大鼠,各8对实验数值,数据在SAS统计软件包下进行处理，分别进行t检验及F检验。
结果
一、激光照射后视网膜病理改变
激光斑处外颗粒层细胞的损伤细胞即皱缩细胞的细胞核被染成紫红色，正常细胞胞核被染成绿色，二者的界限分明。
二、应用更生霉素后激光斑改变
, 百拇医药
自身对照设计实验组与对照组比较差异有显著性，正常细胞t=2.324, P=0.04; 皱缩细胞t=4.223, P=0.000 3;总细胞t=4.879,P=0.000 3。各组除2.5 g/L，20 h组外，其余与对照组比较差异均有显著性。激光斑处皱缩细胞最多可减少74.5%，激光累及细胞总数减少63.9%。
三、析因设计统计结果
由表1，2可见总细胞数指标中时间因素为主要作用因素，药物浓度及两因素交互作用无统计学意义。在皱缩细胞数与正常细胞数两指标中2个实验因素及其交互作用均有统计学意义，在分别控制1个时间因素水平后对比药物组间差异发现给药时间为即刻时，3个药物浓度水平无组间差别，均为有效实验因素，随着给药时间的延后，低浓度2.5 g/L组显示与另2个高浓度组差异有显著性。同样在控制药物浓度水平后对比给药时间组间差别时发现，即刻和8 h组均与20 h组差异有显著性。
表1 SD大鼠视网膜各观察指标统计结果
, 百拇医药
观察指标
总效应
给药时间
药物浓度
交互作用
F值
P值
F值
P值
F值
P值
F值
P值
, 百拇医药 总细胞数
3.48
0.002
11.24
0.000
0.35
0.707
1.17
0.334
皱缩细胞
37.95
0.000
124.61
, 百拇医药
0.000
19.41
0.001
3.89
0.007
正常细胞
20.59
0.000
75.44
0.000
0.43
0.653
3.25
, 百拇医药
0.010
表2 SD大鼠视网膜皱缩细胞及正常细胞两实验因素控制于不同水平的组间差别
因素水平
皱缩细胞数
正常细胞数
F值
P值
组间差别
F值
P值
组间差别
时间
, http://www.100md.com
T1(即刻)
1.14
0.339
C1C2C3
6.49
0.006 4
C*1C2C*3
T2( 8 h)
, http://www.100md.com
13.73
0.000
C1C2C*3
3.70
0.060 0
C1C2C3
T3(20 h)
11.61
0.000
C1C2C*3
, 百拇医药
0.61
0.551 0
C1C2C3
浓度
C1(10 g/L)
3.10
0.000
T1T2T*3
23.26
, 百拇医药
0.000 0
T1T2T*3
C2( 5 g/L)
34.55
0.000
T1T2T*3
20.37
0.000 0
T1T2T*3
, 百拇医药
C3(2.5 g/L)
82.11
0.001
T1T2T*3
39.61
0.000 0
T*1T*2T*3
注：组间差别栏中有*组与无*组间差异有显著性，无*组组间差异无显著性，有*组组间差异有显著性
, http://www.100md.com
讨论
甲基绿-哌洛宁染色法(methyl green-Pyronin, MG-P染色法)是一种古老的染色方法，它是近百年前由Pappenhein和Unna提出的。已证实MG可特异性地着色细胞核的DNA，Pyronin特异性着色胞浆和核仁RNA，甲基绿染色为绿色，哌洛宁为红色，由于这种染色方法能良好地同时显示细胞的DNA和RNA，所以迄今这种染色方法在生物领域有着广泛的应用。细胞受损伤时细胞蛋白质合成增加，合成的蛋白质可进一步促进细胞的裂解，胞浆粗面内质网及游离核糖体和核仁区域内的RNA增多，在正常视网膜组织的外颗粒层细胞由于DNA多，细胞核被染成绿色，损伤的细胞核被染成紫红色。
更生霉素，可嵌入到DNA双螺旋链中相邻的鸟嘌呤和胞嘧啶碱基对之间，与DNA结合成复合体，阻碍RNA多聚酶(转录酶)的功能，阻止RNA尤其是mRNA和蛋白质的合成，裂解蛋白减少从而阻止受损细胞被破坏。
实验表明更生霉素有抗损伤作用，激光斑处皱缩细胞最多可减少74.5%，激光累及细胞总数减少63.9%，较文献[3]提及的作用率略低，可能与更生霉素的纯度以及观察的组织不同有关。值得注意的是，时间因素在本实验中起着重要的作用，药物在激光照射后即刻和8 h时最有效，时间越早，药物的组间差异越小，高浓度与低浓度药物药效相当，随着给药时间的延后，必须增加药物浓度以维持疗效；至20 h时，即使是高浓度药物的疗效也与前2个时间的疗效比较有显著差别，低浓度药物(2.5 g/L)在此时已完全无效。这说明细胞转录、蛋白质合成是需要时间的，只有在此时间之前给药，方可抑制细胞损伤，否则即使大量增加药物浓度也无济于事。在中等药物浓度(5 g/L)以上时，即刻与8 h时给药无组间差别；而在低药物浓度时，则给药时间越早越好。
, 百拇医药
基金项目：军队‘九五’医药卫生科研基金资助(96M143)
刘怡 研究生
作者单位：刘怡(解放军第三○六医院激光治疗中心，100101)
何守志(100853 北京，解放军总医院眼科)
参考文献
1.刘怡，何守志.氩绿激光致SD大鼠视网膜组织细胞凋亡的实验研究.眼科研究，1999，17：448-450.
2.朱曰林，赵崇德.甲基绿-哌洛宁染色法研究进展.中国组织化学与细胞化学杂志，1996，5：227-230.
3.Rabacchi SA,Bonfanti L,Liu XH,et al.Apoptotic cell death induced by optic nerve lesion in the neonatal rat.J Neurosci,1994,14:5292-5301., 百拇医药