卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞株的建立及其多药耐药蛋白的表达
卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞株的建立及其多药耐药蛋白的表达
陈建利 杨瑞芳 刘福生 江森 孙晓明
摘 要 目的 以较大剂量和反复间歇用药的方式建立卵巢上皮性癌顺铂(cDDP)耐药细胞株3AO/cDDP，并检测其肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和P-糖蛋白(P-gp)的表达。方法 以卵巢上皮性癌化学治疗用药的最低剂量换算终浓度，采用大剂量cDDP(10 μg/ml)反复间歇24 h暴露法建立3AO/cDDP细胞株;用流式细胞仪(FCM)检测LRP、MRP和P-gp的表达。结果 历时4.5个月建成3AO/cDDP细胞株，耐药性稳定，耐药指数为1.62，与临床耐药指数相近。FCM检测MRP、 P-gp的表达，3AO/cDDP与3AO相比，差异无显著性(P>0.05), LRP的表达明显升高(P<0.01)。结论 3AO/cDDP 是以不同的诱导方式建立起来的对cDDP耐药的卵巢上皮性癌细胞株模型；3AO/cDDP的cDDP耐药与LRP表达升高有关，而与MRP、P-gp表达无关。
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关键词：抗药性，多药；卵巢肿瘤；顺铂
耐药是严重制约卵巢上皮性癌患者化学治疗(化疗)疗效的重要因素[1]。目前，国内外对卵巢上皮性癌化疗耐药机理的认识主要来自体外实验的研究成果，多采用逐渐增加培养基中药物浓度的方法建立耐药细胞株来进行研究，但这些研究存在两个问题，一是诱导耐药所用的化疗药物并非卵巢上皮性癌患者化疗的首选药物[2]；二是逐渐增加培养基中药物浓度的方法与临床化疗反复间歇用药的特点相差甚远[3]。研究发现，同一种肿瘤细胞，用同一种药物诱导，诱导药物终浓度相同，不同的诱导方法可得到耐药机理不同的耐药细胞株[4]。因此，本研究采用临床化疗首选药物的对应剂量和反复间歇给药的方式建立顺铂(cDDP)耐药细胞株，并初步检测了一些耐药相关蛋白在耐药细胞株中的表达。
材料与方法
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一、材料来源
1. 实验药物：cDDP和卡铂(CBP)为山东齐鲁制药厂产品；紫杉醇(TAX)和鬼臼噻吩甙(VM26)为美国Bristol-Myers Squibb 公司产品；环磷酰胺(CTX)为上海华联制药有限公司产品；氟尿嘧啶(5-FU)为天津市氨基酸公司人民制药厂产品；甲氨蝶呤(MTX)为北京医科大学实验药厂产品；长春新碱(VCR)为广州明星制药厂产品；阿霉素(ADM)为浙江海门制药厂产品；鬼臼乙叉甙(VP16)为中外合资益侨(湖南)制药有限公司产品。
2.单克隆抗体(单抗)：鼠抗人P-糖蛋白(P-gp)单抗(JSB-1)购于武汉博士德生物公司；多药耐药相关蛋白(MRP)单抗(QCR-1)：由加拿大Queen Univ- ersity Cole 教授惠赠；肺耐药蛋白(LRP)单抗(LRP-56)：由荷兰Free University Scheper教授惠赠。
3.细胞株：人卵巢上皮性粘液性囊腺癌细胞株3AO购于中国科学院上海细胞生物研究所。细胞生长于含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中传代培养。
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二、cDDP耐药细胞株3AO/cDDP的建立
1.3AO/cDDP细胞株的诱导：为使培养体系中cDDP终浓度与体内有效血浆浓度相接近，按如下公式[5]换算：培养体系中cDDP终浓度为[(60×D)/(5 000)]×2×103。其中60为平均成人体重(kg)，D为临床用药剂量(mg*kg-1*d-1),5 000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50%，103将mg换算成μg。以临床卵巢上皮性癌患者每个化疗周期cDDP用量的低线(30 mg)求得终浓度约为10 μg/ml。于对数生长期3AO细胞的培养液中加入cDDP至终浓度为10 μg/ml，作用24 h，弃去培养液，用磷酸缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.4)洗3遍，换新鲜培养液，待细胞恢复生长，反复作用6次，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法测半数抑制浓度(IC50)逐渐稳定，撤药培养1个月，复测IC50不变，表明耐药性稳定。细胞在浓度为0.5 μg/ml的 cDDP培养液中维持培养，用10%的二甲基亚砜培养液冻存复苏后测IC50不变，所有耐药性实验均在无药培养两周后进行。
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2.3AO及3AO/cDDP细胞株的生物学特性测定：(1)对数生长期细胞群体倍增时间测定：采用细胞计数法[6]，重复3遍取平均值。(2)细胞周期分布及DNA、RNA含量分析：3AO及3AO/cDDP单细胞悬液各12份，采用流式细胞仪(FCM)检测。(3)染色体制备及分析：秋水仙素法[6]。(4)克隆形成率实验：该实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。方法参见文献[6]，克隆形成率为(克隆数/接种细胞数)×100%。(5)肿瘤标志物CA125、CA19.9、癌胚抗原(CEA)分析：在同等培养条件下取培养上清液以酶联免疫吸附(ELISA)法测定。(6)耐药谱分析：MTT比色法，以3AO/cDDP细胞株的IC50和3AO细胞株的IC50的比值表示耐药指数(resistance factor,RF)。
三、3AO及3AO/cDDP细胞LRP、MRP和P-gp表达的检测
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采用FCM法，上机前以标准化荧光微球调整仪器，使其变异系数稳定在2%以内，每次检测10 000个细胞，共检测12组细胞，用Cell Quest Plot软件分析数据。
四、统计学方法
采用t检验和χ2检验。
结果
一、3AO/cDDP耐药细胞株的建立
1.3AO/cDDP的诱导：本研究采用大剂量(10 μg/ml)cDDP 24 h反复间歇暴露法，历时4.5个月建成耐药细胞株3AO/cDDP，测得3AO/cDDP的IC50为226.41±0.02， 3AO的IC50为139.53±0.01，RF为1.62(P<0.01)，建株后维持培养9个月，耐药性稳定。用浓度为10 μg/ml 的cDDP 作用24 h，反复作用6次，从撤药至下次克隆形成间隔时间分别为25、23、16、11、4、3 d，呈逐渐缩短的趋势。
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2.3AO/cDDP生物学特性：(1)倍增时间：3AO/cDDP倍增时间为(23.76±0.28)h，3AO倍增时间为(24.96±0.09)h(P>0.05)。(2)细胞周期分布及DNA、RNA相对含量分析：见表1。3AO/cDDP及3AO细胞周期分布差异显著, 3AO/cDDP细胞G0+G1期比例减少(P<0.01), G2+M期及S期比例增加(P<0.01，0.05)。 3AO/cDDP细胞中DNA、RNA含量变化与S期、G2+M期的细胞周期分布一致。(3)染色体分析：3AO/cDDP及3AO细胞各计数100个典型核型。每个核型中A～G各组染色体增减紊乱，无一定规律。3AO细胞染色体众数分布集中于36～40 条，以亚二倍体居多。每个核型中类似D组的中着丝粒或近中着丝粒巨大染色体数目比正常细胞增多，多为6～9条，且每个核型中均有至少1～2条类似D组的近端着丝粒巨大标记染色体。3AO/cDDP细胞染色体众数分布集中于40～42条，也以亚二倍体居多。与3AO相比，类似D组的近端着丝粒染色体数目增多，为6～12条。另外，两种细胞核型中均可见假二倍体、超二倍体、亚三倍体、假三倍体及超三倍体以及三射体、环状染色体、双着丝粒染色体、染色体断裂、双微小体等异常现象，但和3AO相比，3AO/cDDP细胞中较为少见。(4)克隆形成率实验：分别接种100、200个3AO及3AO/cDDP细胞，计数3AO克隆形成率分别为20%、55%；3AO/cDDP克隆形成率分别为27%、62%。两种细胞克隆形成率比较，差异无显著性(P>0.05)。(5)肿瘤标志物CA125、CA19.9、CEA分析：经用ELISA法检测3AO/cDDP和3AO细胞株培养上清液各12份, CA125水平分别为(8.24±0.24)U/ml、(9.01±0.64)U/ml；CA19.9分别为(5.59±0.59)U/ml、(6.17±0.73 )U/ml；CEA分别为(1.37±0.30)ng/ml、(2.51±0.26)ng/ml，两种细胞株之间比较，差异均无显著性(P>0.05)。(6)耐药谱分析：3AO/cDDP不仅对cDDP耐药，对另外临床常用的9种化疗药物即CBP、TAX、MTX、VCR、VP16、VM26、ADM、5-FU和CTX也具有不同程度的耐药性见表2。
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表1 3AO及3AO/cDDP细胞周期分布及DNA、RNA相对含量分析(X±s)
细胞株
G0+G1期(%)
G2+M期(%)
S期(%)
DNA
RNA
3AO
47.20±1.12
15.11±1.49
39.91±1.95
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46.89±1.47
30.38±0.98
3AO/cDDP
38.35±1.37
24.09±1.85
42.01±1.67
55.06±0.66
49.53±0.47
表2 10种常用化疗药物作用于3AO/cDDP后的RF
药物
IC50(μg/ml)
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RF
3AO
3AO/cDDP
cDDP
139.53±0.01
226.40±0.02
1.62
CBP
101.41±0.02
210.26±0.01
2.07
TAX
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64.79±0.70
101.08±0.61
1.56
MTX
1 013.00±0.13
3 500.00±0.71
3.45
VCR
222.40±0.27
449.92±0.93
2.02
VP16
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905.33±0.02
2 193.02±0.04
2.42
VM26
965.10±0.06
1 216.03±0.04
1.26
ADM
950.20±0.03
1 881.60±0.02
1.98
5-FU
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764.11±0.31
10 875.11±0.75
14.21
CTX
281.25±0.24
1 612.01±0.47
5.73
二、3AO/cDDP细胞中LRP、MRP和P-gp的表达
3AO/cDDP细胞中LRP、MRP和P-gp的表达情况见表3。与3AO 细胞相比，3AO/cDDP细胞中LRP表达明显升高(P<0.01), MRP和P-gp表达无明显变化(P>0.05)。
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表3 LRP、MRP和P-gp在3AO、3AO/cDDP细胞中的
表达情况(X±s)
类别
细胞
组数
3AO表达阳性率
(%)
3AO/cDDP表达阳性率
(%)
P-gp
12
2.50±0.31
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2.92±0.51
MRP
12
7.76±0.55
8.57±0.26
LRP
12
9.43±0.89
30.06±0.14
讨论
一、卵巢上皮性癌化疗药物铂类耐药研究意义
化疗是卵巢上皮性癌患者术后主要的辅助治疗手段，化疗的持续有效性是大家所普遍关心的问题。随着化疗药物的不断更新和化疗方案的不断改进，患者的临床完全缓解率和中位生存时间得到明显提高，但对总体生存率却没有太大的影响。化疗耐药性是造成这种状况的重要原因。耐药现象在临床上非常普遍，目前，铂类药物(如cDDP)仍是临床患者化疗的首选药物，阐明其化疗耐药机理，对逆转耐药以保证化疗持续有效和患者长期生存，具有重要意义。
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二、 卵巢上皮性癌cDDP耐药细胞株建立意义
建立耐药细胞株是研究耐药的重要步骤。目前，国内外绝大多数耐药细胞株的诱导方式与体内用药特点相差甚远[2，3]。有研究表明，诱导方式的不同可导致不同的耐药机理[4]。本研究考虑到临床化疗反复间歇用药的特点，以3AO细胞株为实验对象，采用大剂量反复间歇24 h暴露法，历时4.5个月建成cDDP耐药细胞株3AO/cDDP，对cDDP的耐药指数是1.62倍，与临床耐药指数相近[7]；耐药谱分析表明，3AO/cDDP具有多药耐药性。3AO/cDDP的建立是研究cDDP耐药机理及筛选逆转剂的理想模型。在多次大剂量间歇用药过程中，细胞从药物作用24 h后到恢复生长，这段间歇期呈逐渐缩短的趋势。目前，国内外绝大多数耐药细胞株都是采用逐渐增加培养基中药物浓度的方法建立起来的，实验过程中未观察到生长间歇逐渐缩短的趋势。临床上卵巢上皮性癌患者化疗习惯上3～4周为1个疗程，这种给药周期的确定，是考虑到铂类半衰期、避免其毒性累积以及使受抑制骨髓有足够时间恢复正常造血功能等因素的。体外模拟实验中生长间歇逐渐缩短的现象，提示从避免和预防耐药的角度需重新审视临床化疗周期固定的做法是否与肿瘤细胞生物学增殖特性相符合的问题。在临床实践中，在化疗毒性基本能够克服的前提下，根据一次次化疗后肿瘤细胞的增殖特性，能否在其受抑制、生长恢复之前尽早再次化疗，值得考虑。根据肿瘤细胞的这种基本生物学增殖特性，临床上化疗周期似应采取逐渐缩短的方式。但目前确定体内肿瘤细胞倍增时间及化疗后增殖规律较为困难，临床上是否应该及如何实施逐渐缩短的化疗周期模式还有诸多问题尚待研究。
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三、卵巢上皮性癌cDDP耐药细胞株作用机理
国内外对P-gp与铂类耐药关系的研究尚有争议，但越来越多的资料表明，P-gp可能与铂类耐药无关，本研究FCM检测结果证实了此观点。MRP、LRP与卵巢上皮性癌铂类化疗耐药的关系国内尚未见报道，MRP是由Cole等[8]发现的一种耐药相关蛋白，MRP引起耐药的机理与P-gp相似但又不尽相同，MRP可使细胞内药物外排增加、细胞内药物浓度下降，但这种转运作用是可以饱和的；MRP还可以引起细胞内药物分布发生改变，使接触靶位点的药物减少。我们研究发现，3AO/cDDP的cDDP耐药与MRP 无关。但值得一提的是，尽管研究表明铂类耐药与P-gp、MRP表达无关，但目前对P-gp、MRP介导药物外排作用机理并不十分明了，今后的研究仍有必要。尤其是一些植物碱类新型药物如喜树碱、拓扑特肯、TAX、紫杉特尔等的问世及应用，使今后对P-gp、MRP与耐药关系的研究意义更为重大。LRP是新近发现的一种胞浆蛋白，相对分子质量为110 000，实际上是人的穹窿体主蛋白(major vault protein,MVP)[9]。LRP大部分位于细胞浆中，约5%与细胞核膜相连，参与核孔复合物的构成。LRP引起耐药可能通过两种机理发挥作用，其一，可使以细胞核DNA为靶点的药物(如铂类、烷化剂等)不能通过核孔进入细胞核；其二，使细胞浆中的药物进入运输囊泡，通过胞吐机理排出细胞外。本研究发现，3AO/cDDP细胞LRP表达较3AO明显升高(P<0.01)，说明，3AO/cDDP的cDDP耐药与LRP明显相关。Izquierdo等[10]研究发现，LRP表达与化疗反应性及预后明显相关，但因目前相关资料甚少，还不能就此肯定其临床意义，有待进一步研究证实。本研究以不同诱导方式建立cDDP耐药细胞株，并初步检测了LRP、MRP和P-gp在耐药细胞株中的表达。但体内与体外结果是否一致，还不能就此肯定，对此，我们将作进一步研究。
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作者单位：杨瑞芳、江森(250012 济南，山东医科大学附属医院妇产科)
刘福生(首都医科大学神经外科研究所)
孙晓明(解放军济南军区总医院流式细胞室)
陈建利(现在上海医科大学妇产科医院妇科)
参考文献
1，Coukos G,Rubin S.Chemotherapy resistance in ovarian cancer:new molecular perspectives.Obstet Gynecol,1998, 91:783-792.
2，Moran E, Cleary I, Larkin AM,et al. Co-expression of MDR-associated markers, including P-170, MRP and LRP and cytoskeletal proteins, in three resistant variants of the human ovarian carcinoma cell line, OAW42. Eur J Cancer,1997, 33: 652-660.
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4，Yang LY,Trujillo JM.Biological characterization of multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two methods.Cancer Res,1990,50:3218-3225.
5，郭和清，鲁功成，熊旭林,等.人膀胱癌耐药细胞亚株BIU-87/ADM 抗药性逆转的研究. 中华实验外科杂志，1997，14：306-307.
6，鄂征,主编.组织培养和分子细胞学技术. 第2版.北京:北京出版社,1997.156-157.
7，杨纯正.肿瘤耐药研究进展.中华血液学杂志,1997，18：1-2.
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8，Cole SPC,Bhardunj G,Gerlach JH,et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line.Science,1992,258:1650-1654.
9，Scheffer GL, Wijngaard PL, Flens MJ,et al. The drug resistance-related protein LRP is the human major vault protein. Nat Med,1995,1:578-582.
10，Izquierdo MA,van-der-Zee AG,Vermorken JB,et al.Drug resistance-associated marker lrp for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma.J Natl Cancer Inst,1995,87:1230-1237., 百拇医药
陈建利 杨瑞芳 刘福生 江森 孙晓明
摘 要 目的 以较大剂量和反复间歇用药的方式建立卵巢上皮性癌顺铂(cDDP)耐药细胞株3AO/cDDP，并检测其肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和P-糖蛋白(P-gp)的表达。方法 以卵巢上皮性癌化学治疗用药的最低剂量换算终浓度，采用大剂量cDDP(10 μg/ml)反复间歇24 h暴露法建立3AO/cDDP细胞株;用流式细胞仪(FCM)检测LRP、MRP和P-gp的表达。结果 历时4.5个月建成3AO/cDDP细胞株，耐药性稳定，耐药指数为1.62，与临床耐药指数相近。FCM检测MRP、 P-gp的表达，3AO/cDDP与3AO相比，差异无显著性(P>0.05), LRP的表达明显升高(P<0.01)。结论 3AO/cDDP 是以不同的诱导方式建立起来的对cDDP耐药的卵巢上皮性癌细胞株模型；3AO/cDDP的cDDP耐药与LRP表达升高有关，而与MRP、P-gp表达无关。
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关键词：抗药性，多药；卵巢肿瘤；顺铂
耐药是严重制约卵巢上皮性癌患者化学治疗(化疗)疗效的重要因素[1]。目前，国内外对卵巢上皮性癌化疗耐药机理的认识主要来自体外实验的研究成果，多采用逐渐增加培养基中药物浓度的方法建立耐药细胞株来进行研究，但这些研究存在两个问题，一是诱导耐药所用的化疗药物并非卵巢上皮性癌患者化疗的首选药物[2]；二是逐渐增加培养基中药物浓度的方法与临床化疗反复间歇用药的特点相差甚远[3]。研究发现，同一种肿瘤细胞，用同一种药物诱导，诱导药物终浓度相同，不同的诱导方法可得到耐药机理不同的耐药细胞株[4]。因此，本研究采用临床化疗首选药物的对应剂量和反复间歇给药的方式建立顺铂(cDDP)耐药细胞株，并初步检测了一些耐药相关蛋白在耐药细胞株中的表达。
材料与方法
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一、材料来源
1. 实验药物：cDDP和卡铂(CBP)为山东齐鲁制药厂产品；紫杉醇(TAX)和鬼臼噻吩甙(VM26)为美国Bristol-Myers Squibb 公司产品；环磷酰胺(CTX)为上海华联制药有限公司产品；氟尿嘧啶(5-FU)为天津市氨基酸公司人民制药厂产品；甲氨蝶呤(MTX)为北京医科大学实验药厂产品；长春新碱(VCR)为广州明星制药厂产品；阿霉素(ADM)为浙江海门制药厂产品；鬼臼乙叉甙(VP16)为中外合资益侨(湖南)制药有限公司产品。
2.单克隆抗体(单抗)：鼠抗人P-糖蛋白(P-gp)单抗(JSB-1)购于武汉博士德生物公司；多药耐药相关蛋白(MRP)单抗(QCR-1)：由加拿大Queen Univ- ersity Cole 教授惠赠；肺耐药蛋白(LRP)单抗(LRP-56)：由荷兰Free University Scheper教授惠赠。
3.细胞株：人卵巢上皮性粘液性囊腺癌细胞株3AO购于中国科学院上海细胞生物研究所。细胞生长于含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中传代培养。
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二、cDDP耐药细胞株3AO/cDDP的建立
1.3AO/cDDP细胞株的诱导：为使培养体系中cDDP终浓度与体内有效血浆浓度相接近，按如下公式[5]换算：培养体系中cDDP终浓度为[(60×D)/(5 000)]×2×103。其中60为平均成人体重(kg)，D为临床用药剂量(mg*kg-1*d-1),5 000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50%，103将mg换算成μg。以临床卵巢上皮性癌患者每个化疗周期cDDP用量的低线(30 mg)求得终浓度约为10 μg/ml。于对数生长期3AO细胞的培养液中加入cDDP至终浓度为10 μg/ml，作用24 h，弃去培养液，用磷酸缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.4)洗3遍，换新鲜培养液，待细胞恢复生长，反复作用6次，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法测半数抑制浓度(IC50)逐渐稳定，撤药培养1个月，复测IC50不变，表明耐药性稳定。细胞在浓度为0.5 μg/ml的 cDDP培养液中维持培养，用10%的二甲基亚砜培养液冻存复苏后测IC50不变，所有耐药性实验均在无药培养两周后进行。
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2.3AO及3AO/cDDP细胞株的生物学特性测定：(1)对数生长期细胞群体倍增时间测定：采用细胞计数法[6]，重复3遍取平均值。(2)细胞周期分布及DNA、RNA含量分析：3AO及3AO/cDDP单细胞悬液各12份，采用流式细胞仪(FCM)检测。(3)染色体制备及分析：秋水仙素法[6]。(4)克隆形成率实验：该实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。方法参见文献[6]，克隆形成率为(克隆数/接种细胞数)×100%。(5)肿瘤标志物CA125、CA19.9、癌胚抗原(CEA)分析：在同等培养条件下取培养上清液以酶联免疫吸附(ELISA)法测定。(6)耐药谱分析：MTT比色法，以3AO/cDDP细胞株的IC50和3AO细胞株的IC50的比值表示耐药指数(resistance factor,RF)。
三、3AO及3AO/cDDP细胞LRP、MRP和P-gp表达的检测
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采用FCM法，上机前以标准化荧光微球调整仪器，使其变异系数稳定在2%以内，每次检测10 000个细胞，共检测12组细胞，用Cell Quest Plot软件分析数据。
四、统计学方法
采用t检验和χ2检验。
结果
一、3AO/cDDP耐药细胞株的建立
1.3AO/cDDP的诱导：本研究采用大剂量(10 μg/ml)cDDP 24 h反复间歇暴露法，历时4.5个月建成耐药细胞株3AO/cDDP，测得3AO/cDDP的IC50为226.41±0.02， 3AO的IC50为139.53±0.01，RF为1.62(P<0.01)，建株后维持培养9个月，耐药性稳定。用浓度为10 μg/ml 的cDDP 作用24 h，反复作用6次，从撤药至下次克隆形成间隔时间分别为25、23、16、11、4、3 d，呈逐渐缩短的趋势。
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2.3AO/cDDP生物学特性：(1)倍增时间：3AO/cDDP倍增时间为(23.76±0.28)h，3AO倍增时间为(24.96±0.09)h(P>0.05)。(2)细胞周期分布及DNA、RNA相对含量分析：见表1。3AO/cDDP及3AO细胞周期分布差异显著, 3AO/cDDP细胞G0+G1期比例减少(P<0.01), G2+M期及S期比例增加(P<0.01，0.05)。 3AO/cDDP细胞中DNA、RNA含量变化与S期、G2+M期的细胞周期分布一致。(3)染色体分析：3AO/cDDP及3AO细胞各计数100个典型核型。每个核型中A～G各组染色体增减紊乱，无一定规律。3AO细胞染色体众数分布集中于36～40 条，以亚二倍体居多。每个核型中类似D组的中着丝粒或近中着丝粒巨大染色体数目比正常细胞增多，多为6～9条，且每个核型中均有至少1～2条类似D组的近端着丝粒巨大标记染色体。3AO/cDDP细胞染色体众数分布集中于40～42条，也以亚二倍体居多。与3AO相比，类似D组的近端着丝粒染色体数目增多，为6～12条。另外，两种细胞核型中均可见假二倍体、超二倍体、亚三倍体、假三倍体及超三倍体以及三射体、环状染色体、双着丝粒染色体、染色体断裂、双微小体等异常现象，但和3AO相比，3AO/cDDP细胞中较为少见。(4)克隆形成率实验：分别接种100、200个3AO及3AO/cDDP细胞，计数3AO克隆形成率分别为20%、55%；3AO/cDDP克隆形成率分别为27%、62%。两种细胞克隆形成率比较，差异无显著性(P>0.05)。(5)肿瘤标志物CA125、CA19.9、CEA分析：经用ELISA法检测3AO/cDDP和3AO细胞株培养上清液各12份, CA125水平分别为(8.24±0.24)U/ml、(9.01±0.64)U/ml；CA19.9分别为(5.59±0.59)U/ml、(6.17±0.73 )U/ml；CEA分别为(1.37±0.30)ng/ml、(2.51±0.26)ng/ml，两种细胞株之间比较，差异均无显著性(P>0.05)。(6)耐药谱分析：3AO/cDDP不仅对cDDP耐药，对另外临床常用的9种化疗药物即CBP、TAX、MTX、VCR、VP16、VM26、ADM、5-FU和CTX也具有不同程度的耐药性见表2。
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表1 3AO及3AO/cDDP细胞周期分布及DNA、RNA相对含量分析(X±s)
细胞株
G0+G1期(%)
G2+M期(%)
S期(%)
DNA
RNA
3AO
47.20±1.12
15.11±1.49
39.91±1.95
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46.89±1.47
30.38±0.98
3AO/cDDP
38.35±1.37
24.09±1.85
42.01±1.67
55.06±0.66
49.53±0.47
表2 10种常用化疗药物作用于3AO/cDDP后的RF
药物
IC50(μg/ml)
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RF
3AO
3AO/cDDP
cDDP
139.53±0.01
226.40±0.02
1.62
CBP
101.41±0.02
210.26±0.01
2.07
TAX
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64.79±0.70
101.08±0.61
1.56
MTX
1 013.00±0.13
3 500.00±0.71
3.45
VCR
222.40±0.27
449.92±0.93
2.02
VP16
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905.33±0.02
2 193.02±0.04
2.42
VM26
965.10±0.06
1 216.03±0.04
1.26
ADM
950.20±0.03
1 881.60±0.02
1.98
5-FU
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764.11±0.31
10 875.11±0.75
14.21
CTX
281.25±0.24
1 612.01±0.47
5.73
二、3AO/cDDP细胞中LRP、MRP和P-gp的表达
3AO/cDDP细胞中LRP、MRP和P-gp的表达情况见表3。与3AO 细胞相比，3AO/cDDP细胞中LRP表达明显升高(P<0.01), MRP和P-gp表达无明显变化(P>0.05)。
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表3 LRP、MRP和P-gp在3AO、3AO/cDDP细胞中的
表达情况(X±s)
类别
细胞
组数
3AO表达阳性率
(%)
3AO/cDDP表达阳性率
(%)
P-gp
12
2.50±0.31
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2.92±0.51
MRP
12
7.76±0.55
8.57±0.26
LRP
12
9.43±0.89
30.06±0.14
讨论
一、卵巢上皮性癌化疗药物铂类耐药研究意义
化疗是卵巢上皮性癌患者术后主要的辅助治疗手段，化疗的持续有效性是大家所普遍关心的问题。随着化疗药物的不断更新和化疗方案的不断改进，患者的临床完全缓解率和中位生存时间得到明显提高，但对总体生存率却没有太大的影响。化疗耐药性是造成这种状况的重要原因。耐药现象在临床上非常普遍，目前，铂类药物(如cDDP)仍是临床患者化疗的首选药物，阐明其化疗耐药机理，对逆转耐药以保证化疗持续有效和患者长期生存，具有重要意义。
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二、 卵巢上皮性癌cDDP耐药细胞株建立意义
建立耐药细胞株是研究耐药的重要步骤。目前，国内外绝大多数耐药细胞株的诱导方式与体内用药特点相差甚远[2，3]。有研究表明，诱导方式的不同可导致不同的耐药机理[4]。本研究考虑到临床化疗反复间歇用药的特点，以3AO细胞株为实验对象，采用大剂量反复间歇24 h暴露法，历时4.5个月建成cDDP耐药细胞株3AO/cDDP，对cDDP的耐药指数是1.62倍，与临床耐药指数相近[7]；耐药谱分析表明，3AO/cDDP具有多药耐药性。3AO/cDDP的建立是研究cDDP耐药机理及筛选逆转剂的理想模型。在多次大剂量间歇用药过程中，细胞从药物作用24 h后到恢复生长，这段间歇期呈逐渐缩短的趋势。目前，国内外绝大多数耐药细胞株都是采用逐渐增加培养基中药物浓度的方法建立起来的，实验过程中未观察到生长间歇逐渐缩短的趋势。临床上卵巢上皮性癌患者化疗习惯上3～4周为1个疗程，这种给药周期的确定，是考虑到铂类半衰期、避免其毒性累积以及使受抑制骨髓有足够时间恢复正常造血功能等因素的。体外模拟实验中生长间歇逐渐缩短的现象，提示从避免和预防耐药的角度需重新审视临床化疗周期固定的做法是否与肿瘤细胞生物学增殖特性相符合的问题。在临床实践中，在化疗毒性基本能够克服的前提下，根据一次次化疗后肿瘤细胞的增殖特性，能否在其受抑制、生长恢复之前尽早再次化疗，值得考虑。根据肿瘤细胞的这种基本生物学增殖特性，临床上化疗周期似应采取逐渐缩短的方式。但目前确定体内肿瘤细胞倍增时间及化疗后增殖规律较为困难，临床上是否应该及如何实施逐渐缩短的化疗周期模式还有诸多问题尚待研究。
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三、卵巢上皮性癌cDDP耐药细胞株作用机理
国内外对P-gp与铂类耐药关系的研究尚有争议，但越来越多的资料表明，P-gp可能与铂类耐药无关，本研究FCM检测结果证实了此观点。MRP、LRP与卵巢上皮性癌铂类化疗耐药的关系国内尚未见报道，MRP是由Cole等[8]发现的一种耐药相关蛋白，MRP引起耐药的机理与P-gp相似但又不尽相同，MRP可使细胞内药物外排增加、细胞内药物浓度下降，但这种转运作用是可以饱和的；MRP还可以引起细胞内药物分布发生改变，使接触靶位点的药物减少。我们研究发现，3AO/cDDP的cDDP耐药与MRP 无关。但值得一提的是，尽管研究表明铂类耐药与P-gp、MRP表达无关，但目前对P-gp、MRP介导药物外排作用机理并不十分明了，今后的研究仍有必要。尤其是一些植物碱类新型药物如喜树碱、拓扑特肯、TAX、紫杉特尔等的问世及应用，使今后对P-gp、MRP与耐药关系的研究意义更为重大。LRP是新近发现的一种胞浆蛋白，相对分子质量为110 000，实际上是人的穹窿体主蛋白(major vault protein,MVP)[9]。LRP大部分位于细胞浆中，约5%与细胞核膜相连，参与核孔复合物的构成。LRP引起耐药可能通过两种机理发挥作用，其一，可使以细胞核DNA为靶点的药物(如铂类、烷化剂等)不能通过核孔进入细胞核；其二，使细胞浆中的药物进入运输囊泡，通过胞吐机理排出细胞外。本研究发现，3AO/cDDP细胞LRP表达较3AO明显升高(P<0.01)，说明，3AO/cDDP的cDDP耐药与LRP明显相关。Izquierdo等[10]研究发现，LRP表达与化疗反应性及预后明显相关，但因目前相关资料甚少，还不能就此肯定其临床意义，有待进一步研究证实。本研究以不同诱导方式建立cDDP耐药细胞株，并初步检测了LRP、MRP和P-gp在耐药细胞株中的表达。但体内与体外结果是否一致，还不能就此肯定，对此，我们将作进一步研究。
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作者单位：杨瑞芳、江森(250012 济南，山东医科大学附属医院妇产科)
刘福生(首都医科大学神经外科研究所)
孙晓明(解放军济南军区总医院流式细胞室)
陈建利(现在上海医科大学妇产科医院妇科)
参考文献
1，Coukos G,Rubin S.Chemotherapy resistance in ovarian cancer:new molecular perspectives.Obstet Gynecol,1998, 91:783-792.
2，Moran E, Cleary I, Larkin AM,et al. Co-expression of MDR-associated markers, including P-170, MRP and LRP and cytoskeletal proteins, in three resistant variants of the human ovarian carcinoma cell line, OAW42. Eur J Cancer,1997, 33: 652-660.
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3，梁正东，卞度宏.卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究. 中华妇产科杂志，1996，31：75-78.
4，Yang LY,Trujillo JM.Biological characterization of multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two methods.Cancer Res,1990,50:3218-3225.
5，郭和清，鲁功成，熊旭林,等.人膀胱癌耐药细胞亚株BIU-87/ADM 抗药性逆转的研究. 中华实验外科杂志，1997，14：306-307.
6，鄂征,主编.组织培养和分子细胞学技术. 第2版.北京:北京出版社,1997.156-157.
7，杨纯正.肿瘤耐药研究进展.中华血液学杂志,1997，18：1-2.
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8，Cole SPC,Bhardunj G,Gerlach JH,et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line.Science,1992,258:1650-1654.
9，Scheffer GL, Wijngaard PL, Flens MJ,et al. The drug resistance-related protein LRP is the human major vault protein. Nat Med,1995,1:578-582.
10，Izquierdo MA,van-der-Zee AG,Vermorken JB,et al.Drug resistance-associated marker lrp for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma.J Natl Cancer Inst,1995,87:1230-1237., 百拇医药