灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响
灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响
朱益华 蒋幼芹 刘忠浩 罗学港 吴振中
摘 要 目的 探讨灯盏细辛注射液是否对急性实验性高眼压大鼠视神经轴浆运输阻滞有促进恢复作用。方法 健康SD大鼠30只，右眼制作成急性高眼压模型后，随机分成3组。A组6只鼠，做经左侧上丘逆行辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记，并行视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)计数。B组12只鼠，再分为灯盏细辛腹腔注射治疗组与对照组，每组各6只鼠，高眼压20d后做逆行标记RGCs计数。C组12只鼠，再分为治疗组与对照组，每组各6只鼠，高眼压40 d后做逆行标记RGCs计数。结果 A组视网膜未见标记的RGCs。B组治疗组及对照组标记的RGCs密度均数分别为(749±294)个/mm2和(423±220)个/mm2，两组间差异有显著性(P<0.01)。C组治疗组及对照组标记的RGCs密度均数分别为(1 048±393)个/mm2及(610±315)个/mm2，两组间差异有显著性(P<0.01)。结论 B组及C组治疗组的RGCs密度明显增高，显示灯盏细辛注射液具有改善大鼠实验性高眼压后视神经轴浆运输的作用。
, 百拇医药
关键词：灯盏细辛；视神经；视网膜神经节细胞；上丘；辣根过氧化物酶
灯盏细辛注射液对大鼠高眼压状态下造成的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞色素氧化酶活性的改变具有恢复作用，其机制可能是通过改善视网膜的微循环和(或)使已受损但仍存活的RGCs轴浆运输功能部分恢复[1]。临床研究显示灯盏细辛对眼压已控制的原发性青光眼患者的视野有一定的保护作用，但其作用机制尚不十分清楚[2,3]。为了进一步探讨灯盏细辛对高眼压损伤后RGCs的影响及机制，我们采用直接经上丘以辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)对RGCs做逆行标记的方法，观察大鼠实验性高眼压损伤后视神经轴浆运输的情况，以探讨灯盏细辛是否对RGCs损伤具有保护作用。
材料与方法
一、动物来源
, 百拇医药
由湖南医科大学附属第二医院实验动物室提供的SD健康雄性大鼠30只，体重200～250 g。
二、动物分组：右眼制作成急性高眼压模型后，随机分成A、B、C 3组。A组6只鼠，立即经左侧上丘用HRP逆行标记RGCs并计数。B组12只鼠，再分为治疗组与对照组，每组各6只鼠，治疗组每日腹腔注射6%灯盏细辛注射液1次，剂量15 mg/100 g体重；对照组每日腹腔注射生理盐水1次，剂量为0.5 ml；20 d后行左侧上丘HRP逆行标记RGCs并计数。C组12只鼠，分组及每日用药剂量同B组，40 d后行左侧上丘HRP逆行标记RGCs并计数。
三、实验仪器及试剂
1.MIAS-300图像分析系统。
2.HRP-VI型。
3. 3,3＇ —二氨基联苯胺(3,3＇diaminobenzoidin，DAB)。
, http://www.100md.com
4.其它仪器及试剂：立体定位仪，明胶海绵等。
四、实验方法
1.制作实验性高眼压模型：自制加压装置，将乳酸钠液灌入右眼前房，使眼压高达110 mm Hg (1 mm Hg＝0.133 kPa)，持续45 min。
2.经上丘HRP逆行标记RGCs：大鼠左侧顶骨上制成0.5 cm×0.5 cm骨孔，吸出部分大脑皮质后暴露左上丘，以针灸针在左上丘表面刺孔10余个，将饱含30% HRP的明胶海绵片贴附于左上丘表面。
3.HRP组织化学反应：大鼠存活24 h后，用4%甲醛从升主动脉灌注以固定眼球，剥取视网膜放入0.5%DAB液中，加入0.01%双氧水0.5 ml，进行组织化学反应，终止反应后，将视网膜平铺在明胶玻片上。
4.计算机图像分析：采用MAIS-300图像分析系统，在视网膜每一象限的分区内随机取3个点，每个点面积为8 200 μm2，计数每个点的细胞数，以3个点的细胞均数定为该区的细胞数，最后换算成细胞数/mm2。
, 百拇医药
5.统计学处理方法：采用Windows环境下SPSS统计软件包处理，统计方法为t检验。
结果
一、高眼压状态下鼠眼部表现
眼压达110 mm Hg时，可见角膜水肿、瞳孔散大、眼球变硬等青光眼征象，眼底检查视网膜呈苍白色。停止前房加压灌注后，瞳孔仍然保持明显扩大状态，而眼底颜色基本恢复正常。
二、HRP逆行标记RGCs密度
1.A组RGCs密度：未发现被标记的RGCs，可见视网膜明显水肿，有大量红细胞覆盖于视网膜的玻璃体表面。
2.B组RGCs密度(图1～3)：治疗组RGCs密度为(749±294)个/mm2，对照组RGCs密度为(423±220)个/mm2，治疗组RGCs密度明显高于对照组(t=7.54，P<0.01)。
, 百拇医药
图1 高眼压后20 d治疗组HRP标记的RGCs密度 ×200
图2 高眼压后20 d对照组HRP标记的RGCs密度 ×200
图3 高倍镜下放大的单个RGC ×1 000
3.C组RGCs密度(图4，5)：治疗组RGCs密度为(1 048±393)个/mm2，对照组RGCs密度为(610±315)个/mm2，治疗组RGCs密度明显高于对照组(t=7.38，P<0.01)。
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图4 高眼压后40 d治疗组HRP标记的RGCs密度 ×200
图5 高眼压后40 d对照组HRP标记的RGCs密度 ×200
讨论
高眼压导致视神经轴浆运输阻滞已有较多报道。笔者采用前房灌注乳酸钠液将大鼠眼压升高到110 mm Hg，并持续45 min，此种实验性高眼压模型既可造成视神经轴浆运输的阻滞，又能导致视网膜缺血，其目的在于制作一个视网膜及视神经损伤比较严重的模型，然后观察灯盏细辛的治疗作用。据报道，SD大鼠体循环收缩压为110 mm Hg[4]时，若眼压也处于此种状态下，完全能造成视网膜血流阻断。
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一、视神经的轴浆运输及标记法
视神经轴索的轴浆运输具有两种形式，即顺行运输与逆行运输。逆行运输的主要物质为神经细胞内物质的再循环及从轴索吸收的营养因子等[5]。研究逆行轴浆运输的方法常用HRP逆行标记法，将HRP置于外侧膝状体或上丘，可观察到不同水平上视神经轴浆运输的状态。笔者采用手术显微镜下经上丘HRP明胶海绵贴附法逆行标记RGCs，由于HRP缓慢持续地释放后被上丘组织吸收，故具有定位直观准确，全视网膜各象限标记满意等优点。
二、高眼压对视神经轴浆运输的影响
猫及哺乳类动物的实验研究发现视神经轴浆运输阻滞部位在视乳头筛板区[6] ，当眼压升高时(55～70 mm Hg)，轴浆运输在筛板处部分受阻；若眼压高达90～100 mm Hg，轴浆运输阻滞明显加重。我们在本研究中，观察110 mm Hg的高眼压维持45 min，24 h后未见被标记的RGCs，说明视神经轴浆运输已完全阻断。
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三、灯盏细辛对大鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响
近年来临床研究表明灯盏细辛治疗眼压已控制的青光眼可保存或扩大视野[2,3]。贾莉君等[1]采用改良细胞色素氧化酶组织化学法研究灯盏细辛注射液对大鼠急性实验性高眼压视网膜代谢机能的影响，结果表明灯盏细辛具有提高和改善急性高眼压后大鼠视网膜神经节细胞的活性及活性节细胞密度的作用。
我们观察110 mm Hg的高眼压持续45 min，视神经轴浆运输完全阻断后，经用灯盏细辛注射液治疗20 d，轴浆运输已部分恢复，40 d后恢复明显，表现为被标记的RGCs数明显增多，灯盏细辛可能使某些濒临死亡的RGCs轴索恢复轴浆运输，从脑内靶细胞传出的神经营养信号或靶组织分泌的神经营养因子能顺利到达RGCs胞体，从而避免了部分RGCs的死亡。根据多年来的实验研究，我们认为灯盏细辛对RGCs或视神经的保护作用通过多种途径实现。
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朱益华(博士研究生)
作者单位：朱益华(福建医科大学附属第一医院眼科，350005)
蒋幼芹(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院眼科)
吴振中(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院眼科)
刘忠浩(湖南医科大学神经生物学研究室)
罗学港(湖南医科大学神经生物学研究室)
参考文献
1.贾莉君，刘忠浩，罗学港，等.青光康注射液对急性实验性高眼压大鼠视网膜神经节细胞代谢作用.中华眼科杂志，1995，31：129-132.
, 百拇医药
2.贾莉君，蒋幼芹，吴振中.青光康片对眼压已控制的晚期青光眼临床疗效观察.实用眼科杂志，1994，12：269-273.
3.蒋幼芹，吴振中，莫杏君，等.眼压已控制的晚期青光眼治疗的探讨.眼科研究，1991，9：229-232.
4.Buchi ER , Suivaizdis I, Fu J. Pressure-induced retinal ischemia in rat: an experimental model for quantitative study. Ophthalmologica , 1991,203:138-147.
5.Griffin JW, Watson DF. Axonal transport in neurological disease.Ann Neurol,1988,23:3-13.
6.Radius RL, Bade B. Pressure-induced optic nerve axonal transport interruption in cat eyes. Arch Ophthalmol,1981,99:2163-2165., 百拇医药
朱益华 蒋幼芹 刘忠浩 罗学港 吴振中
摘 要 目的 探讨灯盏细辛注射液是否对急性实验性高眼压大鼠视神经轴浆运输阻滞有促进恢复作用。方法 健康SD大鼠30只，右眼制作成急性高眼压模型后，随机分成3组。A组6只鼠，做经左侧上丘逆行辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记，并行视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)计数。B组12只鼠，再分为灯盏细辛腹腔注射治疗组与对照组，每组各6只鼠，高眼压20d后做逆行标记RGCs计数。C组12只鼠，再分为治疗组与对照组，每组各6只鼠，高眼压40 d后做逆行标记RGCs计数。结果 A组视网膜未见标记的RGCs。B组治疗组及对照组标记的RGCs密度均数分别为(749±294)个/mm2和(423±220)个/mm2，两组间差异有显著性(P<0.01)。C组治疗组及对照组标记的RGCs密度均数分别为(1 048±393)个/mm2及(610±315)个/mm2，两组间差异有显著性(P<0.01)。结论 B组及C组治疗组的RGCs密度明显增高，显示灯盏细辛注射液具有改善大鼠实验性高眼压后视神经轴浆运输的作用。
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关键词：灯盏细辛；视神经；视网膜神经节细胞；上丘；辣根过氧化物酶
灯盏细辛注射液对大鼠高眼压状态下造成的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)细胞色素氧化酶活性的改变具有恢复作用，其机制可能是通过改善视网膜的微循环和(或)使已受损但仍存活的RGCs轴浆运输功能部分恢复[1]。临床研究显示灯盏细辛对眼压已控制的原发性青光眼患者的视野有一定的保护作用，但其作用机制尚不十分清楚[2,3]。为了进一步探讨灯盏细辛对高眼压损伤后RGCs的影响及机制，我们采用直接经上丘以辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)对RGCs做逆行标记的方法，观察大鼠实验性高眼压损伤后视神经轴浆运输的情况，以探讨灯盏细辛是否对RGCs损伤具有保护作用。
材料与方法
一、动物来源
, 百拇医药
由湖南医科大学附属第二医院实验动物室提供的SD健康雄性大鼠30只，体重200～250 g。
二、动物分组：右眼制作成急性高眼压模型后，随机分成A、B、C 3组。A组6只鼠，立即经左侧上丘用HRP逆行标记RGCs并计数。B组12只鼠，再分为治疗组与对照组，每组各6只鼠，治疗组每日腹腔注射6%灯盏细辛注射液1次，剂量15 mg/100 g体重；对照组每日腹腔注射生理盐水1次，剂量为0.5 ml；20 d后行左侧上丘HRP逆行标记RGCs并计数。C组12只鼠，分组及每日用药剂量同B组，40 d后行左侧上丘HRP逆行标记RGCs并计数。
三、实验仪器及试剂
1.MIAS-300图像分析系统。
2.HRP-VI型。
3. 3,3＇ —二氨基联苯胺(3,3＇diaminobenzoidin，DAB)。
, http://www.100md.com
4.其它仪器及试剂：立体定位仪，明胶海绵等。
四、实验方法
1.制作实验性高眼压模型：自制加压装置，将乳酸钠液灌入右眼前房，使眼压高达110 mm Hg (1 mm Hg＝0.133 kPa)，持续45 min。
2.经上丘HRP逆行标记RGCs：大鼠左侧顶骨上制成0.5 cm×0.5 cm骨孔，吸出部分大脑皮质后暴露左上丘，以针灸针在左上丘表面刺孔10余个，将饱含30% HRP的明胶海绵片贴附于左上丘表面。
3.HRP组织化学反应：大鼠存活24 h后，用4%甲醛从升主动脉灌注以固定眼球，剥取视网膜放入0.5%DAB液中，加入0.01%双氧水0.5 ml，进行组织化学反应，终止反应后，将视网膜平铺在明胶玻片上。
4.计算机图像分析：采用MAIS-300图像分析系统，在视网膜每一象限的分区内随机取3个点，每个点面积为8 200 μm2，计数每个点的细胞数，以3个点的细胞均数定为该区的细胞数，最后换算成细胞数/mm2。
, 百拇医药
5.统计学处理方法：采用Windows环境下SPSS统计软件包处理，统计方法为t检验。
结果
一、高眼压状态下鼠眼部表现
眼压达110 mm Hg时，可见角膜水肿、瞳孔散大、眼球变硬等青光眼征象，眼底检查视网膜呈苍白色。停止前房加压灌注后，瞳孔仍然保持明显扩大状态，而眼底颜色基本恢复正常。
二、HRP逆行标记RGCs密度
1.A组RGCs密度：未发现被标记的RGCs，可见视网膜明显水肿，有大量红细胞覆盖于视网膜的玻璃体表面。
2.B组RGCs密度(图1～3)：治疗组RGCs密度为(749±294)个/mm2，对照组RGCs密度为(423±220)个/mm2，治疗组RGCs密度明显高于对照组(t=7.54，P<0.01)。
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图1 高眼压后20 d治疗组HRP标记的RGCs密度 ×200
图2 高眼压后20 d对照组HRP标记的RGCs密度 ×200
图3 高倍镜下放大的单个RGC ×1 000
3.C组RGCs密度(图4，5)：治疗组RGCs密度为(1 048±393)个/mm2，对照组RGCs密度为(610±315)个/mm2，治疗组RGCs密度明显高于对照组(t=7.38，P<0.01)。
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图4 高眼压后40 d治疗组HRP标记的RGCs密度 ×200
图5 高眼压后40 d对照组HRP标记的RGCs密度 ×200
讨论
高眼压导致视神经轴浆运输阻滞已有较多报道。笔者采用前房灌注乳酸钠液将大鼠眼压升高到110 mm Hg，并持续45 min，此种实验性高眼压模型既可造成视神经轴浆运输的阻滞，又能导致视网膜缺血，其目的在于制作一个视网膜及视神经损伤比较严重的模型，然后观察灯盏细辛的治疗作用。据报道，SD大鼠体循环收缩压为110 mm Hg[4]时，若眼压也处于此种状态下，完全能造成视网膜血流阻断。
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一、视神经的轴浆运输及标记法
视神经轴索的轴浆运输具有两种形式，即顺行运输与逆行运输。逆行运输的主要物质为神经细胞内物质的再循环及从轴索吸收的营养因子等[5]。研究逆行轴浆运输的方法常用HRP逆行标记法，将HRP置于外侧膝状体或上丘，可观察到不同水平上视神经轴浆运输的状态。笔者采用手术显微镜下经上丘HRP明胶海绵贴附法逆行标记RGCs，由于HRP缓慢持续地释放后被上丘组织吸收，故具有定位直观准确，全视网膜各象限标记满意等优点。
二、高眼压对视神经轴浆运输的影响
猫及哺乳类动物的实验研究发现视神经轴浆运输阻滞部位在视乳头筛板区[6] ，当眼压升高时(55～70 mm Hg)，轴浆运输在筛板处部分受阻；若眼压高达90～100 mm Hg，轴浆运输阻滞明显加重。我们在本研究中，观察110 mm Hg的高眼压维持45 min，24 h后未见被标记的RGCs，说明视神经轴浆运输已完全阻断。
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三、灯盏细辛对大鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响
近年来临床研究表明灯盏细辛治疗眼压已控制的青光眼可保存或扩大视野[2,3]。贾莉君等[1]采用改良细胞色素氧化酶组织化学法研究灯盏细辛注射液对大鼠急性实验性高眼压视网膜代谢机能的影响，结果表明灯盏细辛具有提高和改善急性高眼压后大鼠视网膜神经节细胞的活性及活性节细胞密度的作用。
我们观察110 mm Hg的高眼压持续45 min，视神经轴浆运输完全阻断后，经用灯盏细辛注射液治疗20 d，轴浆运输已部分恢复，40 d后恢复明显，表现为被标记的RGCs数明显增多，灯盏细辛可能使某些濒临死亡的RGCs轴索恢复轴浆运输，从脑内靶细胞传出的神经营养信号或靶组织分泌的神经营养因子能顺利到达RGCs胞体，从而避免了部分RGCs的死亡。根据多年来的实验研究，我们认为灯盏细辛对RGCs或视神经的保护作用通过多种途径实现。
, 百拇医药
朱益华(博士研究生)
作者单位：朱益华(福建医科大学附属第一医院眼科，350005)
蒋幼芹(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院眼科)
吴振中(410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院眼科)
刘忠浩(湖南医科大学神经生物学研究室)
罗学港(湖南医科大学神经生物学研究室)
参考文献
1.贾莉君，刘忠浩，罗学港，等.青光康注射液对急性实验性高眼压大鼠视网膜神经节细胞代谢作用.中华眼科杂志，1995，31：129-132.
, 百拇医药
2.贾莉君，蒋幼芹，吴振中.青光康片对眼压已控制的晚期青光眼临床疗效观察.实用眼科杂志，1994，12：269-273.
3.蒋幼芹，吴振中，莫杏君，等.眼压已控制的晚期青光眼治疗的探讨.眼科研究，1991，9：229-232.
4.Buchi ER , Suivaizdis I, Fu J. Pressure-induced retinal ischemia in rat: an experimental model for quantitative study. Ophthalmologica , 1991,203:138-147.
5.Griffin JW, Watson DF. Axonal transport in neurological disease.Ann Neurol,1988,23:3-13.
6.Radius RL, Bade B. Pressure-induced optic nerve axonal transport interruption in cat eyes. Arch Ophthalmol,1981,99:2163-2165., 百拇医药