兔实验性急性高眼压模型视网膜谷氨酸的变化
兔实验性急性高眼压模型视网膜谷氨酸的变化
王平宝 蒋幼芹 黄佩刚 陈主初
摘 要 目的 研究兔实验性急性高眼压状态下视网膜谷氨酸含量的变化，探讨谷氨酸在青光眼视神经损害中的作用。方法 应用邻苯二甲醛衍生法、高效液相色谱仪测定视网膜谷氨酸的含量。将18只大白兔分成3组，其中2个实验组，1个正常对照组，每组均6只兔(6只眼)。实验1组：每只兔随机选取1只眼行生理盐水前房内高压灌注，60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)持续4 h。另1只眼生理盐水前房内灌注，方法同前，但压力为20 mm Hg作自身对照。实验2组：每只兔随机选1只眼用30 mm Hg压力前房生理盐水灌注，另1只眼20 mm Hg灌注作自身对照，持续4 h。正常对照组不做前房灌注，每只兔任选1只眼。以上各组均在摘除眼球后做视网膜谷氨酸测定。结果 实验1、2组兔的高眼压眼(60 mm Hg，30 mm Hg)均较对侧眼(20 mm Hg)谷氨酸水平明显增高(P<0.05)。结论 急性高眼压可导致视网膜谷氨酸水平增高，谷氨酸可能参与了高眼压对视网膜的损伤。
, 百拇医药
关键词：谷氨酸；视网膜；青光眼
兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs)主要包括谷氨酸与天门冬氨酸，是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，也是视网膜神经元的主要兴奋性递质[1]。EAAs作用于氨基酸受体，介导了中枢神经系统的信息传递。若EAAs过量，将导致兴奋毒性作用，引起神经元的死亡 。已有许多研究证实，EAAs在视网膜缺血及视神经损伤中，起着重要作用[2,3]。
目前，EAAs与视网膜关系的探讨主要在视网膜缺血的研究上，而与青光眼关系的研究尚少。我们拟通过兔急性高眼压模型，了解高眼压模型视网膜谷氨酸的含量变化，为阐明谷氨酸在青光眼性视神经损伤中的作用提供实验依据。
材料与方法
一、实验动物
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成年健康大白兔(中国家兔)18只，雌雄不限，体重1.4～2.1 kg(由湖南医科大学湘雅医院动物室提供)。术前眼压7～22 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，平均(12.56±3.37)mm Hg (日本Kowa公司Perkins眼压计测量)。
二、方法
1. 分组：大白兔18只，共分3组，每组间术前眼压无差异。实验1组：6只兔。采用生理盐水前房内持续灌注法，将每只兔的1只眼眼压升高至60 mm Hg；另1只眼作为对照，维持灌注眼压20 mm Hg。实验2组：6只兔。每只兔的1只眼维持灌注眼压30 mm Hg，对侧眼维持眼压20 mm Hg作为对照，处理方法同实验1组。正常对照组：6只兔(6只眼)。
2. 动物模型制备：动物称重，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(约1 ml/kg),随机选1只眼作为高眼压灌注眼，用5号静脉输液针头行前房穿刺，输液器接生理盐水，血压计加压维持所需眼压，持续4 h。正常对照组作为空白对照，不作前房灌注，也不需麻醉。
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3. 检测样品制备：击头处死动物，迅速取出眼球置培养皿中，于放大镜下冰上操作，沿角膜缘切开眼球，去晶状体及玻璃体；无水酒精固定0.5 min，轻轻剥取视网膜，滤纸吸干酒精，称重，置匀浆器内，加1 ml无水酒精，冰上匀浆，至乳糜状。转入eppendrof管，4℃，15 000 r/min离心30 min。取上清，-20℃保存备用。
4. 检测方法：采用邻苯二甲醛柱前衍生法[4],高效液相色谱仪与荧光光度检测器测定样品中的氨基酸。通过标准品的测定,采用外算法根据氨基酸的色谱峰面积计算样品中的谷氨酸含量。
三、统计学处理：采用t检验。
结果
一、实验1组
视网膜谷氨酸含量测定(表1)：60 mm Hg灌注眼为(65.51±18.45)10-5mmol/g，20 mm Hg灌注眼为(42.02±22.45)10-5mmol/g,二者差异有显著性(P<0.05)。
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表1 3组兔视网膜谷氨酸含量比较
组别
灌注压
(mm Hg)
谷氨酸
(±s,10-5mmol/g)
t值
P值
实验1组
60
65.51±18.45*
4.31
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0.007 6
20
42.02±22.45
实验2组
30
68.67±32.65*
3.13
0.025 0
20
38.38±13.42
正常对照组
未灌注
, 百拇医药
45.87±13.40
*组内比较，P<0.05
二、实验2组
视网膜谷氨酸含量测定(表1)：30 mm Hg灌注眼为(68.67±32.65)10-5mmol/g，20 mm Hg灌注眼为(38.38±13.42)10-5mmol/g，二者差异亦有显著性(P<0.05)。讨论
人体内主要的兴奋性氨基酸(EAAs)是谷氨酸及天门冬氨酸，尤其是谷氨酸的生理作用已被人们所肯定。谷氨酸是视网膜内大多数神经元的兴奋性递质[1]。其在视网膜内核层及节细胞层具有较高浓度[5]，说明它在视网膜的生理与病理情况下起着重要作用。
大量的文献说明，青光眼的视网膜神经节细胞损伤以细胞凋亡为特征[6]，因而有关细胞凋亡的许多研究也被引入高眼压所致视网膜损伤的研究。EAAs作用于受体，导致细胞内钙离子浓度上升，是细胞凋亡途径之一。Dreyer等[7]比较白内障患者及白内障伴青光眼患者中玻璃体谷氨酸浓度，说明伴有青光眼的白内障患者玻璃体内谷氨酸浓度较高。同样方法测定猴实验性青光眼，亦说明实验性青光眼较对照组玻璃体内具有较高的谷氨酸浓度。体内、体外的研究均已充分说明，高浓度的谷氨酸将对视网膜神经节细胞产生损害，导致细胞死亡，而且有研究证实，EAAs所致的神经节细胞死亡，首先累及的是体积大的神经元，这与青光眼所致视网膜神经节细胞损伤的结果一致，因而说明青光眼的视网膜损伤可能是EAAs作用的结果[8]。另外有研究证实，一些EAAs受体阻滞剂如MK-801明显保护了视网膜神经节细胞的损伤[9]。
, 百拇医药
由于目前无合适的眼压计能较准确地测量兔的眼压，而Perkins眼压计测量的结果偏低，我们采用Perkins眼压计测量18只兔双眼的结果为(12.56±3.37)mm Hg，且不稳定。根据贾丽君等[10]报道采用前房穿刺测量兔眼压的结果(2.61±0.52)kPa，相当于(19.58±3.90)mm Hg。因此，我们采用20 mm Hg作为实验对照组(内对照)的眼压。另外，设正常对照以排除麻醉、眼部穿刺损伤等因素的影响。
本研究结果显示，在灌注眼压为60 mm Hg和30 mm Hg时，视网膜的谷氨酸含量明显高于对侧自身对照眼(20 mm Hg压力灌注)，直接说明兔急性高眼压模型视网膜谷氨酸水平明显增高，证实谷氨酸参与了高眼压对视网膜的损伤。尽管眼压仅30 mm Hg左右, EAAs水平仍处于上升状态，对视网膜仍有可能造成兴奋性毒素作用，从而导致视网膜神经细胞的死亡。在60 mm Hg和30 mm Hg组之间未见显著差异，说明其量效关系不明显。但30 mm Hg显然是引起视网膜谷氨酸升高的阈上值。有研究说明，即使低剂量的谷氨酸长期作用，对视网膜神经节细胞仍是有害的[11]。我们认为，兴奋毒性可能在急性与慢性青光眼的视神经损害机制中起着重要的作用。高眼压状态下，谷氨酸水平增高的原因及时效关系尚有待于进一步研究。
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作者单位：王平宝(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院眼科)
黄佩刚(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院眼科)
蒋幼芹(湖南医科大学附属第二医院眼科)
陈主初(湖南医科大学肿瘤研究所)
参考文献
1，Dowling JE. 视网膜. 吴淼鑫，杨雄里，译.上海：上海医科大学出版社, 1989.73-96.
2，Ulshafer RJ, Sherry DM, Dawson R Jr, et al. Excitatory amino acid involvement in retinal degeneration. Brain Res, 1990, 531:350-354.
, http://www.100md.com
3，Sucher NJ, Lipton SA, Dreyer EB. Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells. Vision Res, 1997,37:3483-3493.
4，叶惟泠.邻苯二甲醛衍生化高效液相色谱法分析脑氨基酸. 生理学报， 1988,40:308-313.
5，Ross CD, Parli JA, Godfrey DA. Quantitative distribution of six amino acids in rat retinal layers. Vision Res, 1989, 29:1079-1084.
6，Caprioli J. Neuroprotection of the optic nerve in glaucoma. Acta Ophthalmol Scand，1997, 75:364-367.
, 百拇医药
7，Dreyer EB, Zurakowski D, Schumer RA, et al. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol，1996,114:299-305.
8，Dreyer EB, Pan ZH, Storm S, et al. Greater sensitivity of larger retinal ganglion cells to NMDA-mediated cell death. Neuroreport，1994, 5: 629-631.
9，Lam TT, Siew E, Chu R, et al. Ameliorative effect of MK-801 on retinal ischemia. J Ocul Pharmacol Ther, 1997, 13:129-137.
10，贾丽君，蒋幼芹，吴振中. 兔眼压正常值与前房穿刺直接测量法. 眼科研究，1994，12：267-268.
11，Vorwerk CK, Lipton SA, Zurakowski D, et al. Chronic low-dose glutamate is toxic to retinal ganglion cells. Toxicity blocked by memantine. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996, 37:1618-1624., http://www.100md.com
王平宝 蒋幼芹 黄佩刚 陈主初
摘 要 目的 研究兔实验性急性高眼压状态下视网膜谷氨酸含量的变化，探讨谷氨酸在青光眼视神经损害中的作用。方法 应用邻苯二甲醛衍生法、高效液相色谱仪测定视网膜谷氨酸的含量。将18只大白兔分成3组，其中2个实验组，1个正常对照组，每组均6只兔(6只眼)。实验1组：每只兔随机选取1只眼行生理盐水前房内高压灌注，60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)持续4 h。另1只眼生理盐水前房内灌注，方法同前，但压力为20 mm Hg作自身对照。实验2组：每只兔随机选1只眼用30 mm Hg压力前房生理盐水灌注，另1只眼20 mm Hg灌注作自身对照，持续4 h。正常对照组不做前房灌注，每只兔任选1只眼。以上各组均在摘除眼球后做视网膜谷氨酸测定。结果 实验1、2组兔的高眼压眼(60 mm Hg，30 mm Hg)均较对侧眼(20 mm Hg)谷氨酸水平明显增高(P<0.05)。结论 急性高眼压可导致视网膜谷氨酸水平增高，谷氨酸可能参与了高眼压对视网膜的损伤。
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关键词：谷氨酸；视网膜；青光眼
兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs)主要包括谷氨酸与天门冬氨酸，是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，也是视网膜神经元的主要兴奋性递质[1]。EAAs作用于氨基酸受体，介导了中枢神经系统的信息传递。若EAAs过量，将导致兴奋毒性作用，引起神经元的死亡 。已有许多研究证实，EAAs在视网膜缺血及视神经损伤中，起着重要作用[2,3]。
目前，EAAs与视网膜关系的探讨主要在视网膜缺血的研究上，而与青光眼关系的研究尚少。我们拟通过兔急性高眼压模型，了解高眼压模型视网膜谷氨酸的含量变化，为阐明谷氨酸在青光眼性视神经损伤中的作用提供实验依据。
材料与方法
一、实验动物
, 百拇医药
成年健康大白兔(中国家兔)18只，雌雄不限，体重1.4～2.1 kg(由湖南医科大学湘雅医院动物室提供)。术前眼压7～22 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，平均(12.56±3.37)mm Hg (日本Kowa公司Perkins眼压计测量)。
二、方法
1. 分组：大白兔18只，共分3组，每组间术前眼压无差异。实验1组：6只兔。采用生理盐水前房内持续灌注法，将每只兔的1只眼眼压升高至60 mm Hg；另1只眼作为对照，维持灌注眼压20 mm Hg。实验2组：6只兔。每只兔的1只眼维持灌注眼压30 mm Hg，对侧眼维持眼压20 mm Hg作为对照，处理方法同实验1组。正常对照组：6只兔(6只眼)。
2. 动物模型制备：动物称重，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(约1 ml/kg),随机选1只眼作为高眼压灌注眼，用5号静脉输液针头行前房穿刺，输液器接生理盐水，血压计加压维持所需眼压，持续4 h。正常对照组作为空白对照，不作前房灌注，也不需麻醉。
, http://www.100md.com
3. 检测样品制备：击头处死动物，迅速取出眼球置培养皿中，于放大镜下冰上操作，沿角膜缘切开眼球，去晶状体及玻璃体；无水酒精固定0.5 min，轻轻剥取视网膜，滤纸吸干酒精，称重，置匀浆器内，加1 ml无水酒精，冰上匀浆，至乳糜状。转入eppendrof管，4℃，15 000 r/min离心30 min。取上清，-20℃保存备用。
4. 检测方法：采用邻苯二甲醛柱前衍生法[4],高效液相色谱仪与荧光光度检测器测定样品中的氨基酸。通过标准品的测定,采用外算法根据氨基酸的色谱峰面积计算样品中的谷氨酸含量。
三、统计学处理：采用t检验。
结果
一、实验1组
视网膜谷氨酸含量测定(表1)：60 mm Hg灌注眼为(65.51±18.45)10-5mmol/g，20 mm Hg灌注眼为(42.02±22.45)10-5mmol/g,二者差异有显著性(P<0.05)。
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表1 3组兔视网膜谷氨酸含量比较
组别
灌注压
(mm Hg)
谷氨酸
(±s,10-5mmol/g)
t值
P值
实验1组
60
65.51±18.45*
4.31
, http://www.100md.com
0.007 6
20
42.02±22.45
实验2组
30
68.67±32.65*
3.13
0.025 0
20
38.38±13.42
正常对照组
未灌注
, 百拇医药
45.87±13.40
*组内比较，P<0.05
二、实验2组
视网膜谷氨酸含量测定(表1)：30 mm Hg灌注眼为(68.67±32.65)10-5mmol/g，20 mm Hg灌注眼为(38.38±13.42)10-5mmol/g，二者差异亦有显著性(P<0.05)。讨论
人体内主要的兴奋性氨基酸(EAAs)是谷氨酸及天门冬氨酸，尤其是谷氨酸的生理作用已被人们所肯定。谷氨酸是视网膜内大多数神经元的兴奋性递质[1]。其在视网膜内核层及节细胞层具有较高浓度[5]，说明它在视网膜的生理与病理情况下起着重要作用。
大量的文献说明，青光眼的视网膜神经节细胞损伤以细胞凋亡为特征[6]，因而有关细胞凋亡的许多研究也被引入高眼压所致视网膜损伤的研究。EAAs作用于受体，导致细胞内钙离子浓度上升，是细胞凋亡途径之一。Dreyer等[7]比较白内障患者及白内障伴青光眼患者中玻璃体谷氨酸浓度，说明伴有青光眼的白内障患者玻璃体内谷氨酸浓度较高。同样方法测定猴实验性青光眼，亦说明实验性青光眼较对照组玻璃体内具有较高的谷氨酸浓度。体内、体外的研究均已充分说明，高浓度的谷氨酸将对视网膜神经节细胞产生损害，导致细胞死亡，而且有研究证实，EAAs所致的神经节细胞死亡，首先累及的是体积大的神经元，这与青光眼所致视网膜神经节细胞损伤的结果一致，因而说明青光眼的视网膜损伤可能是EAAs作用的结果[8]。另外有研究证实，一些EAAs受体阻滞剂如MK-801明显保护了视网膜神经节细胞的损伤[9]。
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由于目前无合适的眼压计能较准确地测量兔的眼压，而Perkins眼压计测量的结果偏低，我们采用Perkins眼压计测量18只兔双眼的结果为(12.56±3.37)mm Hg，且不稳定。根据贾丽君等[10]报道采用前房穿刺测量兔眼压的结果(2.61±0.52)kPa，相当于(19.58±3.90)mm Hg。因此，我们采用20 mm Hg作为实验对照组(内对照)的眼压。另外，设正常对照以排除麻醉、眼部穿刺损伤等因素的影响。
本研究结果显示，在灌注眼压为60 mm Hg和30 mm Hg时，视网膜的谷氨酸含量明显高于对侧自身对照眼(20 mm Hg压力灌注)，直接说明兔急性高眼压模型视网膜谷氨酸水平明显增高，证实谷氨酸参与了高眼压对视网膜的损伤。尽管眼压仅30 mm Hg左右, EAAs水平仍处于上升状态，对视网膜仍有可能造成兴奋性毒素作用，从而导致视网膜神经细胞的死亡。在60 mm Hg和30 mm Hg组之间未见显著差异，说明其量效关系不明显。但30 mm Hg显然是引起视网膜谷氨酸升高的阈上值。有研究说明，即使低剂量的谷氨酸长期作用，对视网膜神经节细胞仍是有害的[11]。我们认为，兴奋毒性可能在急性与慢性青光眼的视神经损害机制中起着重要的作用。高眼压状态下，谷氨酸水平增高的原因及时效关系尚有待于进一步研究。
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作者单位：王平宝(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院眼科)
黄佩刚(410008 长沙，湖南医科大学湘雅医院眼科)
蒋幼芹(湖南医科大学附属第二医院眼科)
陈主初(湖南医科大学肿瘤研究所)
参考文献
1，Dowling JE. 视网膜. 吴淼鑫，杨雄里，译.上海：上海医科大学出版社, 1989.73-96.
2，Ulshafer RJ, Sherry DM, Dawson R Jr, et al. Excitatory amino acid involvement in retinal degeneration. Brain Res, 1990, 531:350-354.
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3，Sucher NJ, Lipton SA, Dreyer EB. Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells. Vision Res, 1997,37:3483-3493.
4，叶惟泠.邻苯二甲醛衍生化高效液相色谱法分析脑氨基酸. 生理学报， 1988,40:308-313.
5，Ross CD, Parli JA, Godfrey DA. Quantitative distribution of six amino acids in rat retinal layers. Vision Res, 1989, 29:1079-1084.
6，Caprioli J. Neuroprotection of the optic nerve in glaucoma. Acta Ophthalmol Scand，1997, 75:364-367.
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7，Dreyer EB, Zurakowski D, Schumer RA, et al. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol，1996,114:299-305.
8，Dreyer EB, Pan ZH, Storm S, et al. Greater sensitivity of larger retinal ganglion cells to NMDA-mediated cell death. Neuroreport，1994, 5: 629-631.
9，Lam TT, Siew E, Chu R, et al. Ameliorative effect of MK-801 on retinal ischemia. J Ocul Pharmacol Ther, 1997, 13:129-137.
10，贾丽君，蒋幼芹，吴振中. 兔眼压正常值与前房穿刺直接测量法. 眼科研究，1994，12：267-268.
11，Vorwerk CK, Lipton SA, Zurakowski D, et al. Chronic low-dose glutamate is toxic to retinal ganglion cells. Toxicity blocked by memantine. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996, 37:1618-1624., http://www.100md.com