p16 和bcl-2蛋白在眼睑恶性肿瘤中的表达及其意义
p16 和bcl-2蛋白在眼睑恶性肿瘤中的表达及其意义
牛膺筠 刘夫玲 孟旭霞 王红云 林红
摘 要 目的 探讨肿瘤抑制基因p16和细胞凋亡抑制基因bcl-2与眼睑恶性肿瘤发生、发展的关系。方法 应用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化法检测96例常见眼睑恶性肿瘤组织中p16和bcl-2蛋白的表达。结果 在96例眼睑恶性肿瘤组织中，p16蛋白阳性表达均为细胞核染色，其阳性表达率分别为基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)70.0%(28/40)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)54.6 %(18/33)，眼睑皮脂腺癌56.5 %(13/23)；p16蛋白的阳性表达与肿瘤分化程度呈负相关，高分化癌与低分化癌间比较差异有显著性(χ2=5.19，P<0.05)。bcl-2蛋白的阳性表达均为细胞浆染色，40例BCC中，bcl-2蛋白的阳性表达率为100.0%；33例SCC 中，仅有1例呈局灶性阳性反应，32例染色较弱；23例眼睑皮脂腺癌者均未见bcl-2蛋白的阳性表达。结论 p16蛋白的表达与眼睑恶性肿瘤的发生及分化程度有关。bcl-2蛋白在BCC中为普遍过度表达，提示细胞凋亡抑制作用可能是BCC发病的分子生物学机制之一。
, 百拇医药
关键词：眼睑肿瘤；癌基因；免疫组织化学
近年来研究发现，细胞增殖和凋亡的失衡是肿瘤的重要发病机制。p16基因是1994年发现的一种抑癌基因，又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)。Kamb等[1]研究表明，约75%的癌细胞株有p16基因的缺失和突变，其翻译产物p16蛋白可直接抑制细胞周期的关键环节，对细胞的增殖起负向调节作用。抗凋亡基因bcl-2是最先发现于B细胞型淋巴瘤的一种癌基因，定位于人染色体18q21[2]，其蛋白产物可通过抑制细胞凋亡干扰正常情况下细胞增殖与死亡的平衡，从而参与肿瘤的发生[3]。有关细胞周期调控基因p16及细胞凋亡抑制基因bcl-2在眼睑恶性肿瘤发生中的作用，目前尚未见报道。为此，笔者应用免疫组织化学技术对96例眼睑恶性肿瘤标本进行p16及bcl-2蛋白检测，以期探讨p16及bcl-2蛋白在眼睑恶性肿瘤发生和发展过程中的作用。
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材料与方法
一、标本来源
取本院眼科病理研究室1985～1997年间手术切除及活检眼睑恶性肿瘤标本96例，其中基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)40例、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)33例、眼睑皮脂腺癌23例。男性51例，女性45例；年龄19～87岁，平均62岁。组织分类见表1。所有标本均经4%甲醛液固定，HE染色后行病理检查确诊。
二、试剂
鼠抗人p16单克隆抗体(F-12，美国Santa Cruz生物技术公司)，鼠抗人bcl-2单克隆抗体(Clone-124，美国Dako公司)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)即用型试剂盒(武汉Boster生物工程公司)。
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三、方法
1.SABC免疫组织化学法：石蜡切片脱蜡,酒精梯度水化至蒸馏水，H2O2室温10 min以灭活内源性酶,微波炉修复抗原(温度在92～98℃)10 min，滴加抗原修复液, 置室温10 min，然后按SABC方法进行染色。用已知阳性对照片做阳性对照，PBS为代替第1抗作为阴性对照。
2.结果判断标准：细胞核呈清晰棕黄色和(或)伴有细胞质淡棕色着色者为p16蛋白阳性瘤细胞，间质细胞核着色为阳性内对照。细胞浆内及细胞核膜呈黄色或棕黄色物质沉着者为bcl-2蛋白阳性瘤细胞。阳性细胞数<10%为阴性表达(-)，≥10%为阳性表达，其中≤25%(+)、>50%(++)、>75%(+++)。
四、统计学处理
本文数据统计学处理采用卡方检验和四格表确切概率法，以P<0.05作为差异有显著性标准。
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结果
一、p16、bcl-2蛋白的阳性染色定位及分布特点
1.p16蛋白阳性染色主要定位于细胞核，呈棕黄色，细胞浆亦可有较淡的染色。间质中成纤维细胞核也呈棕黄色。肿瘤邻近正常组织上皮细胞出现胞浆深染而核空的现象，显色细胞以棘细胞和基底细胞为主,也有少数颗粒细胞。其中BCC(图1)中阳性染色呈均匀一致的弥漫性分布，胞浆呈阴性反应，p16阳性细胞数较多且密集，阳性表达强度为++～+++。在SCC(图2)和眼睑皮脂腺癌(图3)中，阳性细胞数相对较少，阳性表达强度为+～++，细胞核染色的同时有时可见胞浆着色，有的瘤组织细胞染色强度不均匀，染色阳性者并非所有癌巢均为阳性，而呈局限性阳性。
图1 p16蛋白在BCC中的阳性表达 SABC×400
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图2 p16蛋白在SCC中的阳性表达 SABC×400
图3 p16蛋白在眼睑皮脂腺癌中的阳性表达 SABC×400
2.bcl-2蛋白阳性反应主要定位于肿瘤细胞细胞浆内。40例BCC均出现bcl-2蛋白阳性细胞，多数肿瘤细胞呈较均匀一致胞浆染色，弥漫分布于肿瘤全层，瘤细胞团边缘层细胞和瘤细胞团中央区染色强度一致(图4)。瘤细胞团上方的表皮基底层细胞染色呈阳性，但着色较瘤细胞团浅。33例SCC中，1例呈局灶性阳性反应，且染色较弱(+)；32例(97.0 %)均未见阳性反应(图5)。23例腺癌的癌细胞未见bcl-2蛋白阳性细胞，其周围浸润的淋巴细胞有明显棕黄色着色，可作为阳性内对照(图6)。
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图4 bcl-2蛋白在BCC中的阳性表达 SABC×400
图5 bcl-2蛋白在SCC中的阴性表达 SABC×200
图6 bcl-2蛋白在眼睑皮脂腺癌中的阴性表达 SABC×200
二、p16蛋白表达与眼睑恶性肿瘤发生及分化程度的关系
1.p16蛋白表达与眼睑恶性肿瘤发生的关系：96例眼睑恶性肿瘤组织中，59例为p16蛋白阳性表达,表达率为61.5%；在HE切片上，31例可见肿瘤边缘有相应的癌旁组织，其p16蛋白阳性表达率为100.0%，明显高于癌组织,二者比较差异有非常显著性(χ2=16.86，P<0.01)。见表1。
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表1 96例眼睑肿瘤组织类型的p16蛋白阳性表达率
组织类型
标本
例数
p16蛋白
阳性例数
阳性率
(%)
χ2值
P值
BCC
40
, 百拇医药 28
70.0
分化
21
18
85.7
5.19
<0.05
未分化
19
10
52.6
SCC
, 百拇医药 33
18
54.5
高分化
13
10
76.9
0.286 0
中分化
12
7
58.3
0.054 2
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低分化
8
1
12.5
0.006 9
皮脂腺癌
23
13
56.5
高分化
8
7
87.5
, 百拇医药
0.183 3
中分化
9
5
55.6
0.167 8
低分化
6
1
16.7
0.016 3
癌组织
96
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59
61.4
16.86
<0.01
癌旁组织
31
31
100.0
2.p16蛋白表达与眼睑恶性肿瘤组织分化程度的关系：BCC 、SCC及眼睑皮脂腺癌的不同分化类型之间p16蛋白阳性表达率不同，随肿瘤分化程度的降低而下降, 高分化型与低分化型p16蛋白阳性表达率差异有显著性(P<0.05)。见表1。
三、p16蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤的生长部位、有无复发的关系(表2)表2 96例眼睑肿瘤标本p16蛋白的阳性表达率
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项目
标本例数
p16蛋白
阳性例数
阳性率(%)
性别
女
45
25
55.6
男
51
34
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66.7
年龄
≤60岁
48
33
68.8
>60岁
48
26
54.2
生长部位
下睑
52
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33
63.5
上睑
21
13
61.9
上下睑
2
1
50.0
睑缘
13
7
53.8
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眦部
8
5
62.5
复发
有
17
9
52.9
无
79
50
63.3
注：性别、年龄、肿瘤生长部位及复发情况各组间比较，差异均无显著性，P>0.05
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讨论
一、p16蛋白与眼睑恶性肿瘤的关系
眼睑恶性肿瘤是眼科常见肿瘤,其中BCC、SCC及眼睑皮脂腺癌发病率占眼睑恶性肿瘤的88.4%[4]。这些肿瘤不仅破坏眼睑本身，影响美容，严重者可发生转移，危及生命。目前的研究表明，肿瘤的主要发病机制在于细胞增殖和凋亡的失衡。
1994年4月Kamb等[1]首次发现p16基因，定位于9 p21上，全长约8 500碱基对(bp),由3个外显子和2个内含子组成。p16基因编码产物即p16蛋白的相对分子质量为15 845，由307个氨基酸残基组成，具有一个4个回钩状重叠的空间构型蛋白。这一构型蛋白是维持p16基因活性所必需的[5]。p16蛋白是细胞周期素依赖激酶(cyclin dependent kinase 4，CDK4)的抑制因子,主要功能是与细胞周期蛋白D1竞争性结合CDK4，抑制CDK4/cyclin D1复合物的催化活性，阻止细胞G1～S期的转变和DNA合成的启动，对细胞增殖起负向调节作用，从而抑制细胞增生及恶性转化。
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Nobori等[6]研究发现，来源于肺、乳腺、脑、膀胱、肾、卵巢及食管等部位的癌细胞株中有75%的p16基因缺失或突变，同时伴有p16蛋白表达水平的下降甚至缺失，提示p16基因失活与多种肿瘤的发生有关。本研究结果表明，p16蛋白在96例眼睑恶性肿瘤组织中的阳性表达率为61.4%,而在癌旁组织的阳性表达率为100.0%，明显高于癌组织的阳性表达率(P<0.01)，说明在眼睑恶性肿瘤中存在p16蛋白表达的缺失，从蛋白水平上p16基因失活与眼睑恶性肿瘤发生有关。
许多研究表明，p16蛋白表达不仅与肿瘤发生有关，而且与肿瘤分化程度有关。从表1看出，在基底细胞癌分化型的p16蛋白阳性表达率为85.7%，未分化型为52.6%，后者明显低于前者(χ2=5.19，P<0.05)。同样，在SCC的高分化型和低分化型的组织标本中，p16蛋白阳性表达率分别为76.9 %和12.5 %。在眼睑皮脂腺癌中，高分化型和低分化型的p16蛋白阳性表达率分别为87.5 %和16.7%(χ2=16.86，P<0.01)，说明在3种眼睑恶性肿瘤中，肿瘤的分化程度愈低，其p16蛋白的阳性表达率愈低，提示p16蛋白的阳性表达与眼睑肿瘤的恶性程度呈负相关，其阳性表达率与分化程度密切相关。同时BCC的p16蛋白阳性表达率为70.0 %，也明显高于SCC(54.5 %)和眼睑皮脂腺癌(56.5%)，尽管BCC的分化型p16蛋白的阳性表达率略低于眼睑皮脂腺的高分化型p16阳性表达率，其原因可能是实验中眼睑皮脂腺癌标本例数少，且部分标本又掺有较多正常的细胞，致使假阳性结果。在临床上偶见BCC转移，但预后好；而SCC和眼睑皮脂腺癌则相对恶性程度高，易转移，预后差。因此，p16蛋白的阳性表达可作为判断肿瘤分化程度的参考指标，有助于对肿瘤的预后进行评价。此外,本研究还发现,p16蛋白的阳性表达与3种眼睑恶性肿瘤的生长部位、复发、患者性别及年龄均无关(P>0.05)。Nishikawa等[7]报道细胞分化程度的增高，p16蛋白阳性表达呈增加趋势。田辉等[8]曾选用兔抗人p16多克隆抗体采用免疫组织化学SABC法观察63例食管癌组织中p16蛋白的表达，可随肿瘤的分化程度降低而下降，并与肿瘤临床分期呈明显负相关，与患者生存时间呈明显正相关。本结果与文献结果基本一致。
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二、bcl-2蛋白与眼睑恶性肿瘤的关系
抗凋亡基因bcl-2是由Tsujimoto等[9]在人类滤泡性淋巴瘤研究中发现而命名，定位于人染色体18q21，长约230 000 bp。它是通过染色体内的转位活化而致其编码的蛋白产物过度表达。bcl-2基因产物-bcl-2蛋白是一种跨膜蛋白，含239个氨基酸，相对分子质量约26 000，-COOH端有19个疏水氨基酸组成的跨膜片段。bcl-2蛋白在核膜、内质网和线粒体膜上呈斑片状分布。在成人组织内bcl-2蛋白的阳性表达仅限于部分能够连续不断“自我更新”组织内的少数“不成熟细胞”，如皮肤的基底细胞、骨髓的造血细胞以及小肠粘膜细胞等[10]。bcl-2蛋白在正常上皮组织中的表达，通常局限于皮肤基底层、肠道粘膜陷窝和外分泌腺(胰腺、唾液腺和汗腺)的导管细胞。研究还发现，人胎儿皮肤参与构建毛囊的基底细胞和形成中的乳腺胚芽细胞中可见大量bcl-2蛋白聚集，提示bcl-2蛋白参与了上皮细胞的分化过程。
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BCC是一种很少发生转移的肿瘤，其发生机制可能是由于细胞生存时间过度延长造成细胞聚集，形成的肿瘤。本研究发现，40 例BCC中均有bcl-2蛋白的阳性表达，且肿瘤细胞均呈均匀一致的阳性反应，这与国外文献报道一致[11]。因此，bcl-2蛋白在BCC中的普遍过度表达，表明BCC中存在肿瘤细胞凋亡抑制机制，这使肿瘤细胞因寿命延长而过度积聚，使肿瘤组织不断发展、扩大，而并非细胞分裂增殖所致。结合p16蛋白阳性高表达，说明bcl-2蛋白过度表达而导致的细胞凋亡抑制和低增殖活性可能是BCC临床生长缓慢、且极少转移等生物学行为的分子病理学基础之一。此外，本研究还发现，40例BCC全层癌细胞均有bcl-2蛋白的阳性表达，瘤细胞团上方的表皮基底层细胞也可见bcl-2蛋白，因此，支持BCC来源于表皮基底细胞的理论。
目前研究结果显示，bcl-2蛋白的阳性表达高的肿瘤，恶性程度低，生存率高，预后好。在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、软骨肉瘤、卵巢癌等肿瘤的研究均可见bcl-2蛋白阳性表达的患者较无bcl-2蛋白阳性表达的患者预后好。本研究结果中，40例BCC均表达bcl-2，这与BCC很少转移、预后较好等临床特点相符。
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SCC与BCC不同，是来源于表皮基底细胞层上方的角元细胞(即棘细胞)的恶性肿瘤。它生长速度较快，且容易发生转移。本研究所检测的33例SCC中，除1例有局灶性阳性反应外，32例未见bcl-2蛋白的阳性表达，23例眼睑皮脂腺癌中亦未见有bcl-2蛋白的阳性表达，这与bcl-2在BCC普遍过度表达的实验结果形成鲜明对比，但二者有不同程度的p16蛋白阳性表达，提示SCC、眼睑皮脂腺癌的发生、发展与凋亡抑制基因bcl-2无直接关系，而p16蛋白在调控SCC、眼睑皮脂腺癌的生长中起到一定作用。
综上所述，p16蛋白的表达与眼睑恶性肿瘤的发生及分化程度有关；BCC中的bcl-2 蛋白的普遍过度表达现象，提示凋亡抑制作用可能是BCC发病的分子生物学机制之一；临床检测眼睑恶性肿瘤的p16蛋白和bcl-2蛋白的阳性表达，有助于评价眼睑恶性肿瘤的恶性程度和预后。
作者单位:牛膺筠(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
, 百拇医药
刘夫玲(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
孟旭霞(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
王红云(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
林红(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
参考文献
1.Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J,et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264(5157):436-440.
2.Tsujimoto Y, Finger L. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cell with the t(14;18) chromosome translocation. Science, 1984,226(4678): 1097-1099.
, http://www.100md.com
3.Reed JC. bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol,1994,124:1-6.
4.倪逴.3 510例眼睑肿瘤的组织病理学分类.中华眼科杂志,1996,32:435-437.
5.Grigorian M, Tulchinsky E,Burrone O,et al. Modulation of mtsl expression in mouse and human normal and tumor cells. Electrophoresis,1994,15: 463-468.
6.Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature, 1994,368(6473):753-756.
, 百拇医药
7.Nishikawa R, Furnari FB, Lin H, et al. Loss of p16INK4 expression is frequent in high grade gliomas. Cancer Res,1995，55:1941-1945.
8.田辉,王善政，陈明菊，等.食管癌p16基因表达及其临床意义.实用癌症杂志，1998,13：11-12.
9.Tsujimoto Y, Cossman J, Taffe E,et al. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science, 1985,228(4706):1440-1443.
10.Hockenbery DM, Zutter M, Hickey W, et al. bcl-2 protein is topographically restricted in tissues characterized by apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991,88:6961-6965.
11.Verhaegh ME, Sanders CJ, Arends JW, et al. Expression of the apoptosis-suppressing protein bcl-2 in non-melanoma skin cancer. Br J Dermatol，1995,132:740-744., 百拇医药
牛膺筠 刘夫玲 孟旭霞 王红云 林红
摘 要 目的 探讨肿瘤抑制基因p16和细胞凋亡抑制基因bcl-2与眼睑恶性肿瘤发生、发展的关系。方法 应用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化法检测96例常见眼睑恶性肿瘤组织中p16和bcl-2蛋白的表达。结果 在96例眼睑恶性肿瘤组织中，p16蛋白阳性表达均为细胞核染色，其阳性表达率分别为基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)70.0%(28/40)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)54.6 %(18/33)，眼睑皮脂腺癌56.5 %(13/23)；p16蛋白的阳性表达与肿瘤分化程度呈负相关，高分化癌与低分化癌间比较差异有显著性(χ2=5.19，P<0.05)。bcl-2蛋白的阳性表达均为细胞浆染色，40例BCC中，bcl-2蛋白的阳性表达率为100.0%；33例SCC 中，仅有1例呈局灶性阳性反应，32例染色较弱；23例眼睑皮脂腺癌者均未见bcl-2蛋白的阳性表达。结论 p16蛋白的表达与眼睑恶性肿瘤的发生及分化程度有关。bcl-2蛋白在BCC中为普遍过度表达，提示细胞凋亡抑制作用可能是BCC发病的分子生物学机制之一。
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关键词：眼睑肿瘤；癌基因；免疫组织化学
近年来研究发现，细胞增殖和凋亡的失衡是肿瘤的重要发病机制。p16基因是1994年发现的一种抑癌基因，又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)。Kamb等[1]研究表明，约75%的癌细胞株有p16基因的缺失和突变，其翻译产物p16蛋白可直接抑制细胞周期的关键环节，对细胞的增殖起负向调节作用。抗凋亡基因bcl-2是最先发现于B细胞型淋巴瘤的一种癌基因，定位于人染色体18q21[2]，其蛋白产物可通过抑制细胞凋亡干扰正常情况下细胞增殖与死亡的平衡，从而参与肿瘤的发生[3]。有关细胞周期调控基因p16及细胞凋亡抑制基因bcl-2在眼睑恶性肿瘤发生中的作用，目前尚未见报道。为此，笔者应用免疫组织化学技术对96例眼睑恶性肿瘤标本进行p16及bcl-2蛋白检测，以期探讨p16及bcl-2蛋白在眼睑恶性肿瘤发生和发展过程中的作用。
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材料与方法
一、标本来源
取本院眼科病理研究室1985～1997年间手术切除及活检眼睑恶性肿瘤标本96例，其中基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)40例、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)33例、眼睑皮脂腺癌23例。男性51例，女性45例；年龄19～87岁，平均62岁。组织分类见表1。所有标本均经4%甲醛液固定，HE染色后行病理检查确诊。
二、试剂
鼠抗人p16单克隆抗体(F-12，美国Santa Cruz生物技术公司)，鼠抗人bcl-2单克隆抗体(Clone-124，美国Dako公司)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)即用型试剂盒(武汉Boster生物工程公司)。
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三、方法
1.SABC免疫组织化学法：石蜡切片脱蜡,酒精梯度水化至蒸馏水，H2O2室温10 min以灭活内源性酶,微波炉修复抗原(温度在92～98℃)10 min，滴加抗原修复液, 置室温10 min，然后按SABC方法进行染色。用已知阳性对照片做阳性对照，PBS为代替第1抗作为阴性对照。
2.结果判断标准：细胞核呈清晰棕黄色和(或)伴有细胞质淡棕色着色者为p16蛋白阳性瘤细胞，间质细胞核着色为阳性内对照。细胞浆内及细胞核膜呈黄色或棕黄色物质沉着者为bcl-2蛋白阳性瘤细胞。阳性细胞数<10%为阴性表达(-)，≥10%为阳性表达，其中≤25%(+)、>50%(++)、>75%(+++)。
四、统计学处理
本文数据统计学处理采用卡方检验和四格表确切概率法，以P<0.05作为差异有显著性标准。
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结果
一、p16、bcl-2蛋白的阳性染色定位及分布特点
1.p16蛋白阳性染色主要定位于细胞核，呈棕黄色，细胞浆亦可有较淡的染色。间质中成纤维细胞核也呈棕黄色。肿瘤邻近正常组织上皮细胞出现胞浆深染而核空的现象，显色细胞以棘细胞和基底细胞为主,也有少数颗粒细胞。其中BCC(图1)中阳性染色呈均匀一致的弥漫性分布，胞浆呈阴性反应，p16阳性细胞数较多且密集，阳性表达强度为++～+++。在SCC(图2)和眼睑皮脂腺癌(图3)中，阳性细胞数相对较少，阳性表达强度为+～++，细胞核染色的同时有时可见胞浆着色，有的瘤组织细胞染色强度不均匀，染色阳性者并非所有癌巢均为阳性，而呈局限性阳性。
图1 p16蛋白在BCC中的阳性表达 SABC×400
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图2 p16蛋白在SCC中的阳性表达 SABC×400
图3 p16蛋白在眼睑皮脂腺癌中的阳性表达 SABC×400
2.bcl-2蛋白阳性反应主要定位于肿瘤细胞细胞浆内。40例BCC均出现bcl-2蛋白阳性细胞，多数肿瘤细胞呈较均匀一致胞浆染色，弥漫分布于肿瘤全层，瘤细胞团边缘层细胞和瘤细胞团中央区染色强度一致(图4)。瘤细胞团上方的表皮基底层细胞染色呈阳性，但着色较瘤细胞团浅。33例SCC中，1例呈局灶性阳性反应，且染色较弱(+)；32例(97.0 %)均未见阳性反应(图5)。23例腺癌的癌细胞未见bcl-2蛋白阳性细胞，其周围浸润的淋巴细胞有明显棕黄色着色，可作为阳性内对照(图6)。
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图4 bcl-2蛋白在BCC中的阳性表达 SABC×400
图5 bcl-2蛋白在SCC中的阴性表达 SABC×200
图6 bcl-2蛋白在眼睑皮脂腺癌中的阴性表达 SABC×200
二、p16蛋白表达与眼睑恶性肿瘤发生及分化程度的关系
1.p16蛋白表达与眼睑恶性肿瘤发生的关系：96例眼睑恶性肿瘤组织中，59例为p16蛋白阳性表达,表达率为61.5%；在HE切片上，31例可见肿瘤边缘有相应的癌旁组织，其p16蛋白阳性表达率为100.0%，明显高于癌组织,二者比较差异有非常显著性(χ2=16.86，P<0.01)。见表1。
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表1 96例眼睑肿瘤组织类型的p16蛋白阳性表达率
组织类型
标本
例数
p16蛋白
阳性例数
阳性率
(%)
χ2值
P值
BCC
40
, 百拇医药 28
70.0
分化
21
18
85.7
5.19
<0.05
未分化
19
10
52.6
SCC
, 百拇医药 33
18
54.5
高分化
13
10
76.9
0.286 0
中分化
12
7
58.3
0.054 2
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低分化
8
1
12.5
0.006 9
皮脂腺癌
23
13
56.5
高分化
8
7
87.5
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0.183 3
中分化
9
5
55.6
0.167 8
低分化
6
1
16.7
0.016 3
癌组织
96
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59
61.4
16.86
<0.01
癌旁组织
31
31
100.0
2.p16蛋白表达与眼睑恶性肿瘤组织分化程度的关系：BCC 、SCC及眼睑皮脂腺癌的不同分化类型之间p16蛋白阳性表达率不同，随肿瘤分化程度的降低而下降, 高分化型与低分化型p16蛋白阳性表达率差异有显著性(P<0.05)。见表1。
三、p16蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤的生长部位、有无复发的关系(表2)表2 96例眼睑肿瘤标本p16蛋白的阳性表达率
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项目
标本例数
p16蛋白
阳性例数
阳性率(%)
性别
女
45
25
55.6
男
51
34
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66.7
年龄
≤60岁
48
33
68.8
>60岁
48
26
54.2
生长部位
下睑
52
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33
63.5
上睑
21
13
61.9
上下睑
2
1
50.0
睑缘
13
7
53.8
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眦部
8
5
62.5
复发
有
17
9
52.9
无
79
50
63.3
注：性别、年龄、肿瘤生长部位及复发情况各组间比较，差异均无显著性，P>0.05
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讨论
一、p16蛋白与眼睑恶性肿瘤的关系
眼睑恶性肿瘤是眼科常见肿瘤,其中BCC、SCC及眼睑皮脂腺癌发病率占眼睑恶性肿瘤的88.4%[4]。这些肿瘤不仅破坏眼睑本身，影响美容，严重者可发生转移，危及生命。目前的研究表明，肿瘤的主要发病机制在于细胞增殖和凋亡的失衡。
1994年4月Kamb等[1]首次发现p16基因，定位于9 p21上，全长约8 500碱基对(bp),由3个外显子和2个内含子组成。p16基因编码产物即p16蛋白的相对分子质量为15 845，由307个氨基酸残基组成，具有一个4个回钩状重叠的空间构型蛋白。这一构型蛋白是维持p16基因活性所必需的[5]。p16蛋白是细胞周期素依赖激酶(cyclin dependent kinase 4，CDK4)的抑制因子,主要功能是与细胞周期蛋白D1竞争性结合CDK4，抑制CDK4/cyclin D1复合物的催化活性，阻止细胞G1～S期的转变和DNA合成的启动，对细胞增殖起负向调节作用，从而抑制细胞增生及恶性转化。
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Nobori等[6]研究发现，来源于肺、乳腺、脑、膀胱、肾、卵巢及食管等部位的癌细胞株中有75%的p16基因缺失或突变，同时伴有p16蛋白表达水平的下降甚至缺失，提示p16基因失活与多种肿瘤的发生有关。本研究结果表明，p16蛋白在96例眼睑恶性肿瘤组织中的阳性表达率为61.4%,而在癌旁组织的阳性表达率为100.0%，明显高于癌组织的阳性表达率(P<0.01)，说明在眼睑恶性肿瘤中存在p16蛋白表达的缺失，从蛋白水平上p16基因失活与眼睑恶性肿瘤发生有关。
许多研究表明，p16蛋白表达不仅与肿瘤发生有关，而且与肿瘤分化程度有关。从表1看出，在基底细胞癌分化型的p16蛋白阳性表达率为85.7%，未分化型为52.6%，后者明显低于前者(χ2=5.19，P<0.05)。同样，在SCC的高分化型和低分化型的组织标本中，p16蛋白阳性表达率分别为76.9 %和12.5 %。在眼睑皮脂腺癌中，高分化型和低分化型的p16蛋白阳性表达率分别为87.5 %和16.7%(χ2=16.86，P<0.01)，说明在3种眼睑恶性肿瘤中，肿瘤的分化程度愈低，其p16蛋白的阳性表达率愈低，提示p16蛋白的阳性表达与眼睑肿瘤的恶性程度呈负相关，其阳性表达率与分化程度密切相关。同时BCC的p16蛋白阳性表达率为70.0 %，也明显高于SCC(54.5 %)和眼睑皮脂腺癌(56.5%)，尽管BCC的分化型p16蛋白的阳性表达率略低于眼睑皮脂腺的高分化型p16阳性表达率，其原因可能是实验中眼睑皮脂腺癌标本例数少，且部分标本又掺有较多正常的细胞，致使假阳性结果。在临床上偶见BCC转移，但预后好；而SCC和眼睑皮脂腺癌则相对恶性程度高，易转移，预后差。因此，p16蛋白的阳性表达可作为判断肿瘤分化程度的参考指标，有助于对肿瘤的预后进行评价。此外,本研究还发现,p16蛋白的阳性表达与3种眼睑恶性肿瘤的生长部位、复发、患者性别及年龄均无关(P>0.05)。Nishikawa等[7]报道细胞分化程度的增高，p16蛋白阳性表达呈增加趋势。田辉等[8]曾选用兔抗人p16多克隆抗体采用免疫组织化学SABC法观察63例食管癌组织中p16蛋白的表达，可随肿瘤的分化程度降低而下降，并与肿瘤临床分期呈明显负相关，与患者生存时间呈明显正相关。本结果与文献结果基本一致。
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二、bcl-2蛋白与眼睑恶性肿瘤的关系
抗凋亡基因bcl-2是由Tsujimoto等[9]在人类滤泡性淋巴瘤研究中发现而命名，定位于人染色体18q21，长约230 000 bp。它是通过染色体内的转位活化而致其编码的蛋白产物过度表达。bcl-2基因产物-bcl-2蛋白是一种跨膜蛋白，含239个氨基酸，相对分子质量约26 000，-COOH端有19个疏水氨基酸组成的跨膜片段。bcl-2蛋白在核膜、内质网和线粒体膜上呈斑片状分布。在成人组织内bcl-2蛋白的阳性表达仅限于部分能够连续不断“自我更新”组织内的少数“不成熟细胞”，如皮肤的基底细胞、骨髓的造血细胞以及小肠粘膜细胞等[10]。bcl-2蛋白在正常上皮组织中的表达，通常局限于皮肤基底层、肠道粘膜陷窝和外分泌腺(胰腺、唾液腺和汗腺)的导管细胞。研究还发现，人胎儿皮肤参与构建毛囊的基底细胞和形成中的乳腺胚芽细胞中可见大量bcl-2蛋白聚集，提示bcl-2蛋白参与了上皮细胞的分化过程。
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BCC是一种很少发生转移的肿瘤，其发生机制可能是由于细胞生存时间过度延长造成细胞聚集，形成的肿瘤。本研究发现，40 例BCC中均有bcl-2蛋白的阳性表达，且肿瘤细胞均呈均匀一致的阳性反应，这与国外文献报道一致[11]。因此，bcl-2蛋白在BCC中的普遍过度表达，表明BCC中存在肿瘤细胞凋亡抑制机制，这使肿瘤细胞因寿命延长而过度积聚，使肿瘤组织不断发展、扩大，而并非细胞分裂增殖所致。结合p16蛋白阳性高表达，说明bcl-2蛋白过度表达而导致的细胞凋亡抑制和低增殖活性可能是BCC临床生长缓慢、且极少转移等生物学行为的分子病理学基础之一。此外，本研究还发现，40例BCC全层癌细胞均有bcl-2蛋白的阳性表达，瘤细胞团上方的表皮基底层细胞也可见bcl-2蛋白，因此，支持BCC来源于表皮基底细胞的理论。
目前研究结果显示，bcl-2蛋白的阳性表达高的肿瘤，恶性程度低，生存率高，预后好。在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、软骨肉瘤、卵巢癌等肿瘤的研究均可见bcl-2蛋白阳性表达的患者较无bcl-2蛋白阳性表达的患者预后好。本研究结果中，40例BCC均表达bcl-2，这与BCC很少转移、预后较好等临床特点相符。
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SCC与BCC不同，是来源于表皮基底细胞层上方的角元细胞(即棘细胞)的恶性肿瘤。它生长速度较快，且容易发生转移。本研究所检测的33例SCC中，除1例有局灶性阳性反应外，32例未见bcl-2蛋白的阳性表达，23例眼睑皮脂腺癌中亦未见有bcl-2蛋白的阳性表达，这与bcl-2在BCC普遍过度表达的实验结果形成鲜明对比，但二者有不同程度的p16蛋白阳性表达，提示SCC、眼睑皮脂腺癌的发生、发展与凋亡抑制基因bcl-2无直接关系，而p16蛋白在调控SCC、眼睑皮脂腺癌的生长中起到一定作用。
综上所述，p16蛋白的表达与眼睑恶性肿瘤的发生及分化程度有关；BCC中的bcl-2 蛋白的普遍过度表达现象，提示凋亡抑制作用可能是BCC发病的分子生物学机制之一；临床检测眼睑恶性肿瘤的p16蛋白和bcl-2蛋白的阳性表达，有助于评价眼睑恶性肿瘤的恶性程度和预后。
作者单位:牛膺筠(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
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刘夫玲(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
孟旭霞(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
王红云(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
林红(266003 青岛大学医学院附属医院眼科)
参考文献
1.Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J,et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264(5157):436-440.
2.Tsujimoto Y, Finger L. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cell with the t(14;18) chromosome translocation. Science, 1984,226(4678): 1097-1099.
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3.Reed JC. bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol,1994,124:1-6.
4.倪逴.3 510例眼睑肿瘤的组织病理学分类.中华眼科杂志,1996,32:435-437.
5.Grigorian M, Tulchinsky E,Burrone O,et al. Modulation of mtsl expression in mouse and human normal and tumor cells. Electrophoresis,1994,15: 463-468.
6.Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature, 1994,368(6473):753-756.
, 百拇医药
7.Nishikawa R, Furnari FB, Lin H, et al. Loss of p16INK4 expression is frequent in high grade gliomas. Cancer Res,1995，55:1941-1945.
8.田辉,王善政，陈明菊，等.食管癌p16基因表达及其临床意义.实用癌症杂志，1998,13：11-12.
9.Tsujimoto Y, Cossman J, Taffe E,et al. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science, 1985,228(4706):1440-1443.
10.Hockenbery DM, Zutter M, Hickey W, et al. bcl-2 protein is topographically restricted in tissues characterized by apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991,88:6961-6965.
11.Verhaegh ME, Sanders CJ, Arends JW, et al. Expression of the apoptosis-suppressing protein bcl-2 in non-melanoma skin cancer. Br J Dermatol，1995,132:740-744., 百拇医药