体外培养大鼠白内障模型晶状体的早期生化改变
体外培养大鼠白内障模型晶状体的早期生化改变
董东生 陆爱丽 刘莹 贾维红 侯纬敏
摘 要 目的 进一步探讨白内障的发生机制。方法 采用器官培养方法，以不同浓度亚硒酸钠及半乳糖作用于晶状体，诱发大鼠晶状体形成白内障，在培养初期测定晶状体内非蛋白质巯基(nonprotein sulfhydryl, NP-SH)、蛋白质巯基(protein sulfhydryl ，P-SH)和不溶性蛋白质二硫键的含量，脂类过氧化水平，以及与谷胱甘肽代谢有关的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH peroxidase, GSH-PX)、谷胱甘肽还原酶(GSH reductase, GSSG-R)及谷胱甘肽硫转移酶(GSH S transferase, GSH-S)的活性。结果 培养初期(10 min)低浓度药物培养基中晶状体NP-SH、P-SH含量降低，二硫键含量呈升高趋势，差异有显著性(P<0.05)；GSH-PX、GSH-S活性升高，丙二醛(malonaldehyde，MDA)具有升高趋势；GSSG-R活性无明显变化。结论 亚硒酸钠及半乳糖可在体外诱发大鼠晶状体发生混浊，并在早期即可诱发晶状体发生生化改变。
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关键词：白内障；组织培养；晶体；生物化学
白内障是目前致盲的主要原因，有关白内障发生机制及其预防，国内外学者做了大量研究。可诱发白内障的因素较多，如体内注射平阳霉素、亚硒酸钠、半乳糖等药物可诱发白内障发生，我们利用晶状体体外培养技术制作白内障模型，探讨培养早期，即晶状体未混浊时，其巯基、二硫键、脂类过氧化等物质的含量水平及谷胱甘肽相关酶活性的变化，以期阐明白内障的发病机制。
材料与方法
一、材料
1.动物：北京医科大学实验动物部提供的Wistar大鼠，体重80～100 g，雌雄不限。
2.仪器：PU-8800紫外分光光度计；Hitachi F-3000荧光分光光度计。
3.试剂：美国GibcoBRL公司的组织培养199培养基(含5% 胎牛血清、10万U/L青霉素G及 80mg/L链霉素)；北京化工厂的亚硒酸钠；上海试剂二厂的半乳糖；美国Sigma公司的氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、过氧化特丁烷、5,5′二硫-二硝基苯甲酸及硼氢化钠；美国Fluka公司的还原型辅酶Ⅱ及四乙氧基丙烷；其他试剂均为国产分析纯试剂。酶活性分析试剂均为实验当天以双蒸馏水配制。
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二、方法
1.制备晶状体：参照Schenck等[1]的研究方法，按无菌操作原则摘取大鼠晶状体，仔细剔除虹膜及残留玻璃体，用含青霉素及链霉素的Hank液冲洗后，放入已预热的199 培养基24 孔培养板中，每孔放置1枚晶状体，后极向下，37℃、5% CO2条件下培养，2d后在倒置显微镜下观察。除外在剥取过程中受损的晶状体，选择完好透明的晶状体126枚随机组合，置于无血清培养基中待用。
2.诱发白内障模型：参照张家萍等[2,3]研究中整体实验药物的注射剂量，设定培养基中药物浓度。亚硒酸钠组：亚硒酸钠浓度从75 μmol/L 逐渐递减至15 μmol/L ；半乳糖组：半乳糖浓度从35 mmol/L 逐渐递减至15 mmol/L；对照组：无血清199培养基。按常规更换晶状体培养液，定期观察并记录晶状体变化情况，直至实验组晶状体全部混浊。晶状体混浊程度参照Azuma等[4]的标准分为5个等级。Ⅰ级：晶状体无混浊；Ⅱ级：晶状体轻度混浊，周边出现空泡；Ⅲ级：晶状体中度混浊，周边空泡向中心扩展，中心核出现雾状混浊；Ⅳ级：晶状体高度混浊，空泡扩展到核区，中心核雾状混浊加重；Ⅴ级：晶状体核混浊，白内障成熟。
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3.测定晶状体中非蛋白质巯基(nonprotein sulfhydryl, NP-SH)、蛋白质巯基(protein sulfhydryl，P-SH)和不溶性蛋白质二硫键的含量：参照侯伟敏等[5]研究方法，给药后10 min，取出亚硒酸钠组药物浓度为15 μmol/L及半乳糖组药物浓度为15 mmol/L培养基中的晶状体，吸干水分、称重，同时以对照组正常晶状体为对照。采用PU-8800紫外分光光度计进行测定，混合溶液均在412 nm处读数。根据所得光密度值，参照半胱氨酸标准曲线计算NP-SH含量，参照牛血清清蛋白标准曲线计算P-SH含量，参照氧化型谷胱甘肽标准曲线计算不溶性蛋白质二硫键含量。
4.测定晶状体抗氧化相关酶活性：参照侯伟敏等[6] 研究方法, 晶状体选择及处理过程同上。以30℃时1 min氧化1 μmol还原型辅酶Ⅱ为1个活性单位，测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH peroxidase, GSH-PX)及谷胱甘肽还原酶(GSH reductase, GSSG-R)的活性。以2，4-二硝基氯苯为作用物，以25℃时1 min催化生成1 μmol产物为1个活性单位，测定谷胱甘肽硫转移酶(GSH S transferase, GSH-S)活性。
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5.测定脂类过氧化水平(lipid peroxidation)：采用Ohkawa等[7]的方法，以脂类过氧化代谢产物丙二醛(malonaldehyde，MDA)为测定指标，将从上述两浓度药物培养基中取出、吸除水分、称重后的晶状体，以1 g组织加入9 ml 1.15%氯化钾液为标准进行匀浆。在不同试管中依次加入不同培养基晶状体匀浆液0.2 ml、8% 十二烷基硫酸钠0.2 ml、20%醋酸1.5 ml及0.8%硫代巴比妥酸1.5 ml，用双蒸馏水调节终体积至4 ml。95℃水浴加热60 min。取出冷却后加入3.5 ml正丁醇与吡啶的混合液(两液体体积比为15∶1)，振摇后提取有机层，以四乙氧基丙烷为标准，在Hitachi F-3000荧光分光光度计上测定荧光强度，激发光波长515 nm，发射光波长553 nm，计算MDA的量。
三、统计学方法
以
±s记录数据，采用单因素方差分析方法统计数据。
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结果
一、白内障模型的诱发(图1～10)
培养24 h时，亚硒酸钠组药物浓度为15 μmol/L 及半乳糖组药物浓度为15 mmol/L 培养基中的晶状体均清亮透明，两组其他药物浓度培养基中的晶状体均出现了Ⅱ或Ⅲ级混浊；48 h后，两实验组晶状体混浊程度均逐渐加重，上述两药物浓度培养基中的晶状体大部分出现了Ⅱ级混浊(亚硒酸钠组为97%，半乳糖组为92%)；72 h时，亚硒酸钠组高浓度药物培养基中86%晶状体为Ⅴ级混浊，半乳糖组及对照组晶状体混浊以Ⅲ或Ⅳ级为主；至96 h，所有实验组晶状体均为Ⅴ级混浊；对照组晶状体仍透明。
二、晶状体中NP-SH、P-SH及不溶性蛋白质二硫键的含量
以培养基药物浓度亚硒酸钠组15 μmol/L、半乳糖组15 mmol/L为实验浓度，培养10 min后两实验组晶状体中NP-SH(F=47.62)和P-SH(F=5.18)含量均减少(表1)，与对照组比较，差异有显著性(P<0.001，0.05)。两实验组二硫键含量均呈增加趋势，与对照组比较，差异有显著性(F=19.78，P<0.001)。
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三、晶状体抗氧化相关酶活性的变化
以培养基药物浓度亚硒酸钠组15 μmol/L 、半乳糖组15 mmol/L为实验浓度，培养10 min后两实验组晶状体GSH-PX活性升高(表2)，与对照组比较差异有显著性(F=20.17，P<0.001)；GSH-S活性呈升高趋势，3个组比较，差异有显著性(F=25.16，P<0.001)；GSSG-R活性无改变，3个组比较，差异无显著性(F=1.23，P>0.05)。
表1 3组晶状体中NP-SH、P-SH及不溶性蛋白质二硫键
含量比较(±s，μmol/100 mg晶状体湿重)
组别
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NP-SH
P-SH
不溶性蛋白质
二硫键
对照组
0.55±0.07
27.08±5.97
0.82±0.10
亚硒酸钠组
(15 μmol/L)
0.22±0.05
20.00±3.00
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1.73±0.29
半乳糖组
(15 mmol/L)
0.31±0.06
21.60±1.83
1.65±0.37
F值
47.62
5.18
19.78
P值
<0.001
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<0.05
<0.001
表2 3组晶状体中GSH-PX,GSSG-R及GSH-S活性变化
(±s，U/100 mg晶状体湿重)
组别
GSH-PX
GSSG-R
GSH-S
对照组
, http://www.100md.com 262.14±32.62
14.48±1.02
18.14±1.00
亚硒酸钠组 (15 μmol/L)
387.68±55.17
15.23±1.31
28.67±1.26
半乳糖组
(15 mmol/L)
421.50±46.76
13.89±1.96
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27.31±4.57
F值
20.17
1.23
25.16
P值
<0.001
>0.05
<0.001
四、晶状体脂类过氧化水平的变化
以培养基药物浓度亚硒酸钠组15 μmol/L、半乳糖组15 mmol/L 为实验浓度，培养10 min后对照组、亚硒酸钠组及半乳糖组晶状体脂类过氧化平均水平分别为(18.18±1.81)、(24.03±2.15)及(23.05±1.91) nmol/g晶状体湿重，均呈升高趋势，3个组比较，差异有显著性(F=15.30，P<0.001)。讨论
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一、观察对象的确定
在不同药物浓度培养基中，观察培养24、48、72及96 h的晶状体，发现15 μmol/L亚硒酸钠及15 mmol/L半乳糖可诱发晶状体形成白内障，但作用较轻缓。为检测体外培养大鼠白内障模型晶状体的早期生化改变，本研究以此培养基药物浓度为实验浓度，确定该浓度培养基中的晶状体为实验观察对象。
二、观察指标的意义
正常情况下，晶状体中含有较高浓度还原型谷胱甘肽，其为晶状体中重要的抗氧化物质之一，在清除自由基、保护脂类及蛋白质免受氧化损伤等方面具有重要作用。还原型谷胱甘肽可维持晶状体P-SH处于还原状态。当其含量下降到一定水平，晶状体P-SH即被氧化，并以二硫键形式相互交联，形成高分子量蛋白质。晶状体中90%以上NP-SH为还原型谷胱甘肽。随着白内障病程的发展，晶状体中NP-SH及P-SH含量均逐渐下降，而二硫键高分子蛋白质含量增加。在本研究的两实验组中，低浓度药物培养基中晶状体NP-SH及P-SH含量均下降，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。商福等[8]报道，当NP-SH降至较低水平时，P-SH开始减少，表明晶状体中NP-SH在保护P-SH免受氧化损伤方面具有重要作用，并且只有在NP-SH减少到临界值以下，P-SH才会被大量氧化。这与本研究结果相符。
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GSH-PX可催化谷胱甘肽与过氧化物反应，以消除过氧化物有害作用，同时谷胱甘肽由还原型转变成氧化型。氧化型谷胱甘肽在GSSG-R的作用下，还原为还原型谷胱甘肽，以维持还原型谷胱甘肽的含量。GSH-S是具有解毒功能、与清除过氧化物有关的酶[9]。在本研究中，经低浓度药物培养的晶状体均表现为GSH-PX和GSH-S含量升高，可能为晶状体自身代偿机制所致，使解毒作用增强，但同时消耗了GSH，促进了白内障的发展；而GSSG-R无明显改变，可能与培养时间较短及晶状体自身GSH含量较大有关。
晶状体细胞膜中脂类过氧化是白内障发生的始动因素[10]，是脂类过氧化的产物，测量其含量可以反映脂类过氧化水平。MDA可与蛋白质氨基及磷脂某些基团发生相互交联作用，从而对晶状体造成损害并引发白内障。本研究中，两实验组MDA含量均升高，与对照组比较，差异有显著性(F=15.30,P<0.05)。
本研究通过体外建立亚硒酸钠及半乳糖白内障动物模型，对培养早期的晶状体生化指标进行了较详细的观察，其结果与整体实验基本一致[6，7，10，11] 。由此说明通过器官培养在体外诱发大鼠白内障模型，既简单、经济，又可缩短实验周期，是一种简便、可靠的实验方法。
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图1 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体I级混浊×40
图2 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体II级混浊×40
图3 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体III级混浊×40
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图4 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体IV级混浊×40
图5 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体V级混浊×40
图6 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体I级混浊×40
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图7 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体II级混浊×40
图8 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体III级混浊×40
图9 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体IV级混浊×40
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图10 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体V级混浊×40
作者单位：董东生(100073 首都医科大学附属北京同仁医院眼科)
刘莹(100073 首都医科大学附属北京同仁医院眼科)
陆爱丽(北京医科大学生物化学与分子生物学系)
贾维红(北京医科大学生物化学与分子生物学系)
侯纬敏(北京医科大学生物化学与分子生物学系)
参考文献
1，Schenck D, Fournier DJ,Patterson JW. Tissue culture of rat lenses. Proc Soc Exp Biol Med, 1976 ,153: 444-448.
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2，张家萍，侯伟敏，刘世荣,等. 晶状体生化的研究 ：Ⅰ.诱发白内障的探讨. 北京医学院学报, 1984,16:19-21.
3，张家萍，侯伟敏，刘世荣,等. 晶状体生化的研究：亚硒酸钠诱发大鼠白内障的研究.生物化学杂志，1985,1(5):15-19.
4，Azuma M, Shearer TR, Matsumoto T, et al. Calpain II in two in vivo models of sugar cataract. Exp Eye Res,1990,51:393-401.
5，侯伟敏，张家萍，吴平,等. 晶状体生化的研究：亚硒酸钠诱发大鼠白内障晶状体中巯基、二硫键及维生素C的含量.生物化学杂志，1985,1(5):23-26.
6，侯伟敏，张家萍，吴平,等. 晶状体生化的研究：正常和亚硒酸钠诱发白内障大鼠晶状体中与谷胱甘肽代谢有关的三种酶活性的测定.生物化学杂志，1985,1(1):33-37.
, http://www.100md.com
7，Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979,95: 351-358.
8，商福，张家萍，张昌颖.比较不同类型白内障形成过程中非蛋白质巯基与蛋白质巯基的动态变化及关系.生物化学杂志，1991，7：237-241.
9，Gondhowiardjo TD,Van Haeringen NJ. Corneal aldehyde dehydrogenase, glutathione reductase, and glutathione S-transferase in pathologic corneas. Cornea , 1993, 12:310-314.
10，张昌颖，王克维，卢景雾. 白内障形成过程中晶状体细胞膜上脂类与蛋白质氧化的时间差异性 .生物化学杂志, 1995,11:166-170.
11，杨涛，梁康，侯纬敏,等.四种中草药抗白内障形成中晶状体脂类过氧化水平及脂类含量的变化.生物化学杂志, 1992,8:164-167., 百拇医药
董东生 陆爱丽 刘莹 贾维红 侯纬敏
摘 要 目的 进一步探讨白内障的发生机制。方法 采用器官培养方法，以不同浓度亚硒酸钠及半乳糖作用于晶状体，诱发大鼠晶状体形成白内障，在培养初期测定晶状体内非蛋白质巯基(nonprotein sulfhydryl, NP-SH)、蛋白质巯基(protein sulfhydryl ，P-SH)和不溶性蛋白质二硫键的含量，脂类过氧化水平，以及与谷胱甘肽代谢有关的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH peroxidase, GSH-PX)、谷胱甘肽还原酶(GSH reductase, GSSG-R)及谷胱甘肽硫转移酶(GSH S transferase, GSH-S)的活性。结果 培养初期(10 min)低浓度药物培养基中晶状体NP-SH、P-SH含量降低，二硫键含量呈升高趋势，差异有显著性(P<0.05)；GSH-PX、GSH-S活性升高，丙二醛(malonaldehyde，MDA)具有升高趋势；GSSG-R活性无明显变化。结论 亚硒酸钠及半乳糖可在体外诱发大鼠晶状体发生混浊，并在早期即可诱发晶状体发生生化改变。
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关键词：白内障；组织培养；晶体；生物化学
白内障是目前致盲的主要原因，有关白内障发生机制及其预防，国内外学者做了大量研究。可诱发白内障的因素较多，如体内注射平阳霉素、亚硒酸钠、半乳糖等药物可诱发白内障发生，我们利用晶状体体外培养技术制作白内障模型，探讨培养早期，即晶状体未混浊时，其巯基、二硫键、脂类过氧化等物质的含量水平及谷胱甘肽相关酶活性的变化，以期阐明白内障的发病机制。
材料与方法
一、材料
1.动物：北京医科大学实验动物部提供的Wistar大鼠，体重80～100 g，雌雄不限。
2.仪器：PU-8800紫外分光光度计；Hitachi F-3000荧光分光光度计。
3.试剂：美国GibcoBRL公司的组织培养199培养基(含5% 胎牛血清、10万U/L青霉素G及 80mg/L链霉素)；北京化工厂的亚硒酸钠；上海试剂二厂的半乳糖；美国Sigma公司的氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、过氧化特丁烷、5,5′二硫-二硝基苯甲酸及硼氢化钠；美国Fluka公司的还原型辅酶Ⅱ及四乙氧基丙烷；其他试剂均为国产分析纯试剂。酶活性分析试剂均为实验当天以双蒸馏水配制。
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二、方法
1.制备晶状体：参照Schenck等[1]的研究方法，按无菌操作原则摘取大鼠晶状体，仔细剔除虹膜及残留玻璃体，用含青霉素及链霉素的Hank液冲洗后，放入已预热的199 培养基24 孔培养板中，每孔放置1枚晶状体，后极向下，37℃、5% CO2条件下培养，2d后在倒置显微镜下观察。除外在剥取过程中受损的晶状体，选择完好透明的晶状体126枚随机组合，置于无血清培养基中待用。
2.诱发白内障模型：参照张家萍等[2,3]研究中整体实验药物的注射剂量，设定培养基中药物浓度。亚硒酸钠组：亚硒酸钠浓度从75 μmol/L 逐渐递减至15 μmol/L ；半乳糖组：半乳糖浓度从35 mmol/L 逐渐递减至15 mmol/L；对照组：无血清199培养基。按常规更换晶状体培养液，定期观察并记录晶状体变化情况，直至实验组晶状体全部混浊。晶状体混浊程度参照Azuma等[4]的标准分为5个等级。Ⅰ级：晶状体无混浊；Ⅱ级：晶状体轻度混浊，周边出现空泡；Ⅲ级：晶状体中度混浊，周边空泡向中心扩展，中心核出现雾状混浊；Ⅳ级：晶状体高度混浊，空泡扩展到核区，中心核雾状混浊加重；Ⅴ级：晶状体核混浊，白内障成熟。
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3.测定晶状体中非蛋白质巯基(nonprotein sulfhydryl, NP-SH)、蛋白质巯基(protein sulfhydryl，P-SH)和不溶性蛋白质二硫键的含量：参照侯伟敏等[5]研究方法，给药后10 min，取出亚硒酸钠组药物浓度为15 μmol/L及半乳糖组药物浓度为15 mmol/L培养基中的晶状体，吸干水分、称重，同时以对照组正常晶状体为对照。采用PU-8800紫外分光光度计进行测定，混合溶液均在412 nm处读数。根据所得光密度值，参照半胱氨酸标准曲线计算NP-SH含量，参照牛血清清蛋白标准曲线计算P-SH含量，参照氧化型谷胱甘肽标准曲线计算不溶性蛋白质二硫键含量。
4.测定晶状体抗氧化相关酶活性：参照侯伟敏等[6] 研究方法, 晶状体选择及处理过程同上。以30℃时1 min氧化1 μmol还原型辅酶Ⅱ为1个活性单位，测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH peroxidase, GSH-PX)及谷胱甘肽还原酶(GSH reductase, GSSG-R)的活性。以2，4-二硝基氯苯为作用物，以25℃时1 min催化生成1 μmol产物为1个活性单位，测定谷胱甘肽硫转移酶(GSH S transferase, GSH-S)活性。
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5.测定脂类过氧化水平(lipid peroxidation)：采用Ohkawa等[7]的方法，以脂类过氧化代谢产物丙二醛(malonaldehyde，MDA)为测定指标，将从上述两浓度药物培养基中取出、吸除水分、称重后的晶状体，以1 g组织加入9 ml 1.15%氯化钾液为标准进行匀浆。在不同试管中依次加入不同培养基晶状体匀浆液0.2 ml、8% 十二烷基硫酸钠0.2 ml、20%醋酸1.5 ml及0.8%硫代巴比妥酸1.5 ml，用双蒸馏水调节终体积至4 ml。95℃水浴加热60 min。取出冷却后加入3.5 ml正丁醇与吡啶的混合液(两液体体积比为15∶1)，振摇后提取有机层，以四乙氧基丙烷为标准，在Hitachi F-3000荧光分光光度计上测定荧光强度，激发光波长515 nm，发射光波长553 nm，计算MDA的量。
三、统计学方法
以
±s记录数据，采用单因素方差分析方法统计数据。, 百拇医药
结果
一、白内障模型的诱发(图1～10)
培养24 h时，亚硒酸钠组药物浓度为15 μmol/L 及半乳糖组药物浓度为15 mmol/L 培养基中的晶状体均清亮透明，两组其他药物浓度培养基中的晶状体均出现了Ⅱ或Ⅲ级混浊；48 h后，两实验组晶状体混浊程度均逐渐加重，上述两药物浓度培养基中的晶状体大部分出现了Ⅱ级混浊(亚硒酸钠组为97%，半乳糖组为92%)；72 h时，亚硒酸钠组高浓度药物培养基中86%晶状体为Ⅴ级混浊，半乳糖组及对照组晶状体混浊以Ⅲ或Ⅳ级为主；至96 h，所有实验组晶状体均为Ⅴ级混浊；对照组晶状体仍透明。
二、晶状体中NP-SH、P-SH及不溶性蛋白质二硫键的含量
以培养基药物浓度亚硒酸钠组15 μmol/L、半乳糖组15 mmol/L为实验浓度，培养10 min后两实验组晶状体中NP-SH(F=47.62)和P-SH(F=5.18)含量均减少(表1)，与对照组比较，差异有显著性(P<0.001，0.05)。两实验组二硫键含量均呈增加趋势，与对照组比较，差异有显著性(F=19.78，P<0.001)。
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三、晶状体抗氧化相关酶活性的变化
以培养基药物浓度亚硒酸钠组15 μmol/L 、半乳糖组15 mmol/L为实验浓度，培养10 min后两实验组晶状体GSH-PX活性升高(表2)，与对照组比较差异有显著性(F=20.17，P<0.001)；GSH-S活性呈升高趋势，3个组比较，差异有显著性(F=25.16，P<0.001)；GSSG-R活性无改变，3个组比较，差异无显著性(F=1.23，P>0.05)。
表1 3组晶状体中NP-SH、P-SH及不溶性蛋白质二硫键
含量比较(
±s，μmol/100 mg晶状体湿重)组别
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NP-SH
P-SH
不溶性蛋白质
二硫键
对照组
0.55±0.07
27.08±5.97
0.82±0.10
亚硒酸钠组
(15 μmol/L)
0.22±0.05
20.00±3.00
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1.73±0.29
半乳糖组
(15 mmol/L)
0.31±0.06
21.60±1.83
1.65±0.37
F值
47.62
5.18
19.78
P值
<0.001
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<0.001
表2 3组晶状体中GSH-PX,GSSG-R及GSH-S活性变化
(
±s，U/100 mg晶状体湿重)组别
GSH-PX
GSSG-R
GSH-S
对照组
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14.48±1.02
18.14±1.00
亚硒酸钠组 (15 μmol/L)
387.68±55.17
15.23±1.31
28.67±1.26
半乳糖组
(15 mmol/L)
421.50±46.76
13.89±1.96
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27.31±4.57
F值
20.17
1.23
25.16
P值
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>0.05
<0.001
四、晶状体脂类过氧化水平的变化
以培养基药物浓度亚硒酸钠组15 μmol/L、半乳糖组15 mmol/L 为实验浓度，培养10 min后对照组、亚硒酸钠组及半乳糖组晶状体脂类过氧化平均水平分别为(18.18±1.81)、(24.03±2.15)及(23.05±1.91) nmol/g晶状体湿重，均呈升高趋势，3个组比较，差异有显著性(F=15.30，P<0.001)。讨论
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一、观察对象的确定
在不同药物浓度培养基中，观察培养24、48、72及96 h的晶状体，发现15 μmol/L亚硒酸钠及15 mmol/L半乳糖可诱发晶状体形成白内障，但作用较轻缓。为检测体外培养大鼠白内障模型晶状体的早期生化改变，本研究以此培养基药物浓度为实验浓度，确定该浓度培养基中的晶状体为实验观察对象。
二、观察指标的意义
正常情况下，晶状体中含有较高浓度还原型谷胱甘肽，其为晶状体中重要的抗氧化物质之一，在清除自由基、保护脂类及蛋白质免受氧化损伤等方面具有重要作用。还原型谷胱甘肽可维持晶状体P-SH处于还原状态。当其含量下降到一定水平，晶状体P-SH即被氧化，并以二硫键形式相互交联，形成高分子量蛋白质。晶状体中90%以上NP-SH为还原型谷胱甘肽。随着白内障病程的发展，晶状体中NP-SH及P-SH含量均逐渐下降，而二硫键高分子蛋白质含量增加。在本研究的两实验组中，低浓度药物培养基中晶状体NP-SH及P-SH含量均下降，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。商福等[8]报道，当NP-SH降至较低水平时，P-SH开始减少，表明晶状体中NP-SH在保护P-SH免受氧化损伤方面具有重要作用，并且只有在NP-SH减少到临界值以下，P-SH才会被大量氧化。这与本研究结果相符。
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GSH-PX可催化谷胱甘肽与过氧化物反应，以消除过氧化物有害作用，同时谷胱甘肽由还原型转变成氧化型。氧化型谷胱甘肽在GSSG-R的作用下，还原为还原型谷胱甘肽，以维持还原型谷胱甘肽的含量。GSH-S是具有解毒功能、与清除过氧化物有关的酶[9]。在本研究中，经低浓度药物培养的晶状体均表现为GSH-PX和GSH-S含量升高，可能为晶状体自身代偿机制所致，使解毒作用增强，但同时消耗了GSH，促进了白内障的发展；而GSSG-R无明显改变，可能与培养时间较短及晶状体自身GSH含量较大有关。
晶状体细胞膜中脂类过氧化是白内障发生的始动因素[10]，是脂类过氧化的产物，测量其含量可以反映脂类过氧化水平。MDA可与蛋白质氨基及磷脂某些基团发生相互交联作用，从而对晶状体造成损害并引发白内障。本研究中，两实验组MDA含量均升高，与对照组比较，差异有显著性(F=15.30,P<0.05)。
本研究通过体外建立亚硒酸钠及半乳糖白内障动物模型，对培养早期的晶状体生化指标进行了较详细的观察，其结果与整体实验基本一致[6，7，10，11] 。由此说明通过器官培养在体外诱发大鼠白内障模型，既简单、经济，又可缩短实验周期，是一种简便、可靠的实验方法。
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图1 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体I级混浊×40
图2 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体II级混浊×40
图3 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体III级混浊×40
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图4 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体IV级混浊×40
图5 亚硒酸钠组15 μmol/L药物培养基中晶状体V级混浊×40
图6 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体I级混浊×40
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图7 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体II级混浊×40
图8 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体III级混浊×40
图9 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体IV级混浊×40
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图10 半乳糖组15 mmol/L药物培养基中晶状体V级混浊×40
作者单位：董东生(100073 首都医科大学附属北京同仁医院眼科)
刘莹(100073 首都医科大学附属北京同仁医院眼科)
陆爱丽(北京医科大学生物化学与分子生物学系)
贾维红(北京医科大学生物化学与分子生物学系)
侯纬敏(北京医科大学生物化学与分子生物学系)
参考文献
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6，侯伟敏，张家萍，吴平,等. 晶状体生化的研究：正常和亚硒酸钠诱发白内障大鼠晶状体中与谷胱甘肽代谢有关的三种酶活性的测定.生物化学杂志，1985,1(1):33-37.
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