氯血红素对大鼠缺氧性肺动脉高压的作用
氯血红素对大鼠缺氧性肺动脉高压的作用
甄国华 张珍祥 徐永健
关键词：氯血红素；大鼠；缺氧性肺动脉高压
肺动脉平滑肌细胞增殖引起的肺血管重构是造成慢性阻塞性肺疾病(COPD)缺氧性肺动脉高压的病理形态学基础。诱导型血红素氧合酶(HO-1)在缺氧状态下表达增多，分解血红素产生的CO可抑制肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖。我们检测了血红素氧合酶促进剂—氯血红素(Hemin)对慢性缺氧大鼠肺组织中HO-1基因表达及肺动脉压的影响。
材料与方法 按薛全福方法[1]复制动物模型。雄性Wistar大鼠72只，体重200～300 g，随机分为下列3组，每组各8只。Hemin干预组：即每次缺氧前0.5 h腹腔注射Hemin 15 mg/kg体重，分别在5 d、10 d、15 d进行检测；单纯缺氧组：在每次缺氧前0.5 h注射等量生理盐水，分别在5 d、10 d、15 d进行检测；另设正常对照组，也分别在5 d、10 d、15 d进行检测。
, http://www.100md.com
RVSP和RV/(LV+SP)检测及病理观察：在预定的时间点,经右侧颈外静脉插管至右心室，导管另一端通过压力传感器接多导生理记录仪(日本Nihon Kohden)，记录右室压力峰值作为右心室收缩压(RVSP)。剪取大鼠右心室游离壁(RV)及左心室(LV)加室间隔(SP)，分别称其湿重，计算右心肥大指数[RV/(LV+SP)]。肺组织标本经HE染色，光镜下观察腺泡内肺动脉(IAPA)管壁厚度及管腔大小。
逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)：使用TRIzol试剂盒(美国GibcolBRL)提取总RNA，取2 μg总RNA进行逆转录反应，逆转录产物取2 μl进行PCR。HO-1引物的设计依据大鼠HO-1序列[2]，正向引物：5′-GAA TTC AGC ATG CCC CAG GAT TTG-3′，反向引物：5′-TCT AGA CTA GCT GGA TGT TGA GCA GGA-3′， 扩增的目的片段长615 bp。大鼠β-actin正向引物：5′-GAG CAC CCT GTG CTG CTC ACC CTA GG-3′，反向引物：5′-GTG GTG GTG AAG CTG TAG CCA CGC T-3′，目的片段长310 bp。使用50 μl反应体系同时扩增HO-1和β-actin，PCR的具体循环参数为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56.1 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，末次循环延伸时间为72 ℃ 10 min。循环完成后，取10 μl PCR产物进行电泳、照相、扫描，用HPIAS-1000图像分析系统进行分析，结果以HO-1/β-actin的积分光密度表示。
, 百拇医药
统计学处理：进行t检验。
结果 (1)在单纯缺氧组各时相点，RVSP和RV/(LV+SP)明显高于正常对照组(P<0.01或P<0.05)，且呈逐渐上升的趋势。Hemin干预组各时相点RVSP和10 d、15 d的RV/(LV+SP)显著低于单纯缺氧组各相应时相点(P<0.01或P<0.05)，但高于正常对照组(P<0.01或P<0.05，表1)。(2) HE染色显示，常压缺氧15 d大鼠IAPA较正常大鼠管壁增厚，管腔明显狭窄，而经Hemin干预后，上述病理改变减轻(图1～3)。(3)RT-PCR分析显示，单纯缺氧组各时相点HO-1 mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.01)，且有逐渐升高的趋势。Hemin干预组各时相点HO-1 mRNA水平均显著高于正常对照组及单纯缺氧组(P<0.01)，但Hemin干预组各时相点之间差异无显著性(P>0.05，表1，图4)。
, http://www.100md.com
表1 各组大鼠不同时相点RVSP、RV/(LV+SP)及HO-1 mRNA的变化(X±s)
组别
鼠
数
RVSP(mm Hg)
RV/(LV+SP)(%)
HO-1mRNA
5 d
10 d
15 d
5 d
, 百拇医药
10 d
15 d
5 d
10 d
15 d
正常对
照组
8
34.1±3.4
31.3±2.9
33±3
23.1±2.5
22.5±2.7
, 百拇医药
22.7±2.1
0.42±0.03
0.39±0.04
0.41±0.03
单纯缺
氧组
8
48.8±3.8*
55.3±4.3*
64±3*
29.9±3.2*
, http://www.100md.com
36.8±3.7*
43.9±4.0*
0.98±0.04*
1.51±0.06*
1.70±0.07*
Hemin
干预组
8
40.3±2.8*△
48.3±4.6*△
, http://www.100md.com
53±3*△
27.0±3.9**
30.7±3.5*△
39.8±3.0*△△
1.93±0.08*△
2.06±0.08*△
1.98±0.07*△
注：单纯缺氧组、Hemin干预组各时相点与正常对照组比较 * P<0.01，**P<0.05; Hemin干预组与单纯缺氧组间对应的时相点比较 △ P<0.01，△△ P<0.05, 1 mm Hg=0.133 kPa
, http://www.100md.com
图1 正常对照组大鼠IAPA HE ×200
图2 单纯缺氧组大鼠IAPA HE ×200
图3 Hemin干预组大鼠IAPA HE ×200
A：正常对照组；B：缺氧5 d；C：缺氧10 d；D：缺氧15 d；
, http://www.100md.com
E：Hemin干预5 d；F:Hemin干预10 d；G：Hemin干预15 d；
M：PCR marker，从上到下依次为237、377、515、695、994、1 543 bp
图4 RT-PCR的电泳结果
讨论 COPD导致肺泡缺氧，引起缺氧性肺动脉高压(PAH)。在肺动脉高压的晚期，肺血管重构越重，给PAH的治疗带来了很大的困难。1968年Tenhunne等[3]首次发现HO酶，HO在体内将血红素分解产生CO。近来发现多种应激原，如缺氧、高热、内毒素、休克、创伤等都可诱导HO-1表达，这是机体在应激状态下的一种适应性反应。
本组实验使用较敏感的RT-PCR方法检测正常及缺氧不同时相点的大鼠肺组织发现，在正常大鼠肺组织有低水平的HO-1 mRNA，而在缺氧第5 d、10 d、15 d，HO-1 mRNA水平升高2～4倍，在缺氧15 d时为最高。说明缺氧可以诱导大鼠肺组织HO-1基因的表达。随着缺氧时间的延长，RVSP和RV/(LV+SP)也逐渐升高，与HO-1 mRNA水平的升高相关，说明右心室收缩压间接反映了肺动脉压的水平。
, http://www.100md.com
Hemin可诱导HO-1基因表达增强，促进内源性CO产生[4]。本组实验发现，Hemin干预后可使缺氧大鼠肺组织中HO-1 mRNA维持在高水平，显著高于正常对照组及单纯缺氧组各相应时间点，Hemin干预组RVSP和RV/(LV+SP)则显著低于单纯缺氧组各相应时相点。这说明Hemin使缺氧大鼠肺组织HO-1基因高表达，促进内源性CO产生后，改善了缺氧时大鼠肺血流动力学的改变及对右心室的不利影响。同时Hemin干预组大鼠IAPA管壁增厚、管腔狭窄等血管重构的特征较单纯缺氧组也有所改善。这说明，Hemin可通过促进HO-1基因表达增强，使CO产生增多，阻抑肺血管重构，在缺氧性肺动脉高压的形成中起调节作用。
作者单位：甄国华(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸疾病研究室)
张珍祥(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸疾病研究室)
, 百拇医药
徐永健(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸疾病研究室)
参考文献
[1]薛全福，谢剑鸣，胡长贵，等. 常压缺氧性肺动脉高压模型的建立. 中华结核和呼吸杂志，1989,12:350-352.
[2]Shibahara S, Muller R, Taguchi H. Cloning and expression of cDNA for rat heme oxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82：7865-7869.
[3]Tenhunne R, Marver HS, Sohmid R. The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1968, 61：748-755.
[4]Levere RD. Effect of heme arginate administration on blood pressure in spontaneously hypertensive rats. J Clin Invest, 1990, 86：213-219., 百拇医药
甄国华 张珍祥 徐永健
关键词：氯血红素；大鼠；缺氧性肺动脉高压
肺动脉平滑肌细胞增殖引起的肺血管重构是造成慢性阻塞性肺疾病(COPD)缺氧性肺动脉高压的病理形态学基础。诱导型血红素氧合酶(HO-1)在缺氧状态下表达增多，分解血红素产生的CO可抑制肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖。我们检测了血红素氧合酶促进剂—氯血红素(Hemin)对慢性缺氧大鼠肺组织中HO-1基因表达及肺动脉压的影响。
材料与方法 按薛全福方法[1]复制动物模型。雄性Wistar大鼠72只，体重200～300 g，随机分为下列3组，每组各8只。Hemin干预组：即每次缺氧前0.5 h腹腔注射Hemin 15 mg/kg体重，分别在5 d、10 d、15 d进行检测；单纯缺氧组：在每次缺氧前0.5 h注射等量生理盐水，分别在5 d、10 d、15 d进行检测；另设正常对照组，也分别在5 d、10 d、15 d进行检测。
, http://www.100md.com
RVSP和RV/(LV+SP)检测及病理观察：在预定的时间点,经右侧颈外静脉插管至右心室，导管另一端通过压力传感器接多导生理记录仪(日本Nihon Kohden)，记录右室压力峰值作为右心室收缩压(RVSP)。剪取大鼠右心室游离壁(RV)及左心室(LV)加室间隔(SP)，分别称其湿重，计算右心肥大指数[RV/(LV+SP)]。肺组织标本经HE染色，光镜下观察腺泡内肺动脉(IAPA)管壁厚度及管腔大小。
逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)：使用TRIzol试剂盒(美国GibcolBRL)提取总RNA，取2 μg总RNA进行逆转录反应，逆转录产物取2 μl进行PCR。HO-1引物的设计依据大鼠HO-1序列[2]，正向引物：5′-GAA TTC AGC ATG CCC CAG GAT TTG-3′，反向引物：5′-TCT AGA CTA GCT GGA TGT TGA GCA GGA-3′， 扩增的目的片段长615 bp。大鼠β-actin正向引物：5′-GAG CAC CCT GTG CTG CTC ACC CTA GG-3′，反向引物：5′-GTG GTG GTG AAG CTG TAG CCA CGC T-3′，目的片段长310 bp。使用50 μl反应体系同时扩增HO-1和β-actin，PCR的具体循环参数为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56.1 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，末次循环延伸时间为72 ℃ 10 min。循环完成后，取10 μl PCR产物进行电泳、照相、扫描，用HPIAS-1000图像分析系统进行分析，结果以HO-1/β-actin的积分光密度表示。
, 百拇医药
统计学处理：进行t检验。
结果 (1)在单纯缺氧组各时相点，RVSP和RV/(LV+SP)明显高于正常对照组(P<0.01或P<0.05)，且呈逐渐上升的趋势。Hemin干预组各时相点RVSP和10 d、15 d的RV/(LV+SP)显著低于单纯缺氧组各相应时相点(P<0.01或P<0.05)，但高于正常对照组(P<0.01或P<0.05，表1)。(2) HE染色显示，常压缺氧15 d大鼠IAPA较正常大鼠管壁增厚，管腔明显狭窄，而经Hemin干预后，上述病理改变减轻(图1～3)。(3)RT-PCR分析显示，单纯缺氧组各时相点HO-1 mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.01)，且有逐渐升高的趋势。Hemin干预组各时相点HO-1 mRNA水平均显著高于正常对照组及单纯缺氧组(P<0.01)，但Hemin干预组各时相点之间差异无显著性(P>0.05，表1，图4)。
, http://www.100md.com
表1 各组大鼠不同时相点RVSP、RV/(LV+SP)及HO-1 mRNA的变化(X±s)
组别
鼠
数
RVSP(mm Hg)
RV/(LV+SP)(%)
HO-1mRNA
5 d
10 d
15 d
5 d
, 百拇医药
10 d
15 d
5 d
10 d
15 d
正常对
照组
8
34.1±3.4
31.3±2.9
33±3
23.1±2.5
22.5±2.7
, 百拇医药
22.7±2.1
0.42±0.03
0.39±0.04
0.41±0.03
单纯缺
氧组
8
48.8±3.8*
55.3±4.3*
64±3*
29.9±3.2*
, http://www.100md.com
36.8±3.7*
43.9±4.0*
0.98±0.04*
1.51±0.06*
1.70±0.07*
Hemin
干预组
8
40.3±2.8*△
48.3±4.6*△
, http://www.100md.com
53±3*△
27.0±3.9**
30.7±3.5*△
39.8±3.0*△△
1.93±0.08*△
2.06±0.08*△
1.98±0.07*△
注：单纯缺氧组、Hemin干预组各时相点与正常对照组比较 * P<0.01，**P<0.05; Hemin干预组与单纯缺氧组间对应的时相点比较 △ P<0.01，△△ P<0.05, 1 mm Hg=0.133 kPa
, http://www.100md.com
图1 正常对照组大鼠IAPA HE ×200
图2 单纯缺氧组大鼠IAPA HE ×200
图3 Hemin干预组大鼠IAPA HE ×200
A：正常对照组；B：缺氧5 d；C：缺氧10 d；D：缺氧15 d；
, http://www.100md.com
E：Hemin干预5 d；F:Hemin干预10 d；G：Hemin干预15 d；
M：PCR marker，从上到下依次为237、377、515、695、994、1 543 bp
图4 RT-PCR的电泳结果
讨论 COPD导致肺泡缺氧，引起缺氧性肺动脉高压(PAH)。在肺动脉高压的晚期，肺血管重构越重，给PAH的治疗带来了很大的困难。1968年Tenhunne等[3]首次发现HO酶，HO在体内将血红素分解产生CO。近来发现多种应激原，如缺氧、高热、内毒素、休克、创伤等都可诱导HO-1表达，这是机体在应激状态下的一种适应性反应。
本组实验使用较敏感的RT-PCR方法检测正常及缺氧不同时相点的大鼠肺组织发现，在正常大鼠肺组织有低水平的HO-1 mRNA，而在缺氧第5 d、10 d、15 d，HO-1 mRNA水平升高2～4倍，在缺氧15 d时为最高。说明缺氧可以诱导大鼠肺组织HO-1基因的表达。随着缺氧时间的延长，RVSP和RV/(LV+SP)也逐渐升高，与HO-1 mRNA水平的升高相关，说明右心室收缩压间接反映了肺动脉压的水平。
, http://www.100md.com
Hemin可诱导HO-1基因表达增强，促进内源性CO产生[4]。本组实验发现，Hemin干预后可使缺氧大鼠肺组织中HO-1 mRNA维持在高水平，显著高于正常对照组及单纯缺氧组各相应时间点，Hemin干预组RVSP和RV/(LV+SP)则显著低于单纯缺氧组各相应时相点。这说明Hemin使缺氧大鼠肺组织HO-1基因高表达，促进内源性CO产生后，改善了缺氧时大鼠肺血流动力学的改变及对右心室的不利影响。同时Hemin干预组大鼠IAPA管壁增厚、管腔狭窄等血管重构的特征较单纯缺氧组也有所改善。这说明，Hemin可通过促进HO-1基因表达增强，使CO产生增多，阻抑肺血管重构，在缺氧性肺动脉高压的形成中起调节作用。
作者单位：甄国华(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸疾病研究室)
张珍祥(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸疾病研究室)
, 百拇医药
徐永健(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸疾病研究室)
参考文献
[1]薛全福，谢剑鸣，胡长贵，等. 常压缺氧性肺动脉高压模型的建立. 中华结核和呼吸杂志，1989,12:350-352.
[2]Shibahara S, Muller R, Taguchi H. Cloning and expression of cDNA for rat heme oxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82：7865-7869.
[3]Tenhunne R, Marver HS, Sohmid R. The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1968, 61：748-755.
[4]Levere RD. Effect of heme arginate administration on blood pressure in spontaneously hypertensive rats. J Clin Invest, 1990, 86：213-219., 百拇医药