血清P53-IgG抗体测定及其临床价值初步研究
血清P53-IgG抗体测定及其临床价值初步研究
谢鑫友 姜红英 林洁 费春荣
摘 要 目的 建立血清P53蛋白IgG抗体 (P53-IgG) 酶免疫测定法，初步探讨其临床价值。方法 以P53MoAb为包被抗体，以亲和层析纯化浓缩P53蛋白作为中介，自行建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。结果 78例消化道癌P53-IgG阳性率34.62% (27/78)，而32名献血员和30例非癌住院患者均为阴性，P均<0.01。48 例经免疫组化P53蛋白染色阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25% (27/48)，显著高于阴性对照组(0/30)，P<0.01。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%，敏感度34.62%，阳性预测值100%，阴性预测值58.82%。本方法测定特异性100%，批内差异3.8%，批间差异16.2%。结论 血清P53-IgG测定与P53蛋白表达相关，是P53基因研究的新的辅助指标之一。
, http://www.100md.com
关键词：血清学诊断；酶联免疫吸附测定；P53抗体
P53抑癌基因是研究最为深入的肿瘤相关基因之一，其与肿瘤产生、肿瘤生长调控|肿瘤细胞凋亡等关系密切。P53基因表达与肿瘤浸润转移和复发潜能有关，P53基因蛋白(即P53蛋白)阳性的肿瘤预后不良。检测 P53基因/ 蛋白对评价患者预后和提高患者术后生存期限具重要价值。P53基因/蛋白检测以往仅限于手术切除肿瘤组织的免疫组织化学染色和DNA原位杂交。最近发现 P53基因/蛋白阳性肿瘤患者血清中存在特异性的抗P53蛋白抗体(P53-IgG)，P53-IgG测定可用于肿瘤转移，复发预测和P53表达动态观察，已引起了国内外学者的关注[1，2]。本研究自行建立了P53-IgG测定方法，并探讨其临床初步应用价值，现报道如下。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
1.试剂：CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia 公司，瑞典 )，P53 MoAb (MS-105，Clone: Pab 1801，福州迈新生物技术公司进口分装)，酯化生物素(美国Sigma公司)，亲和素 (上海丽珠东风试剂厂)，免抗人IgG酶标抗体(丹麦Dako公司)。
2.标本来源：血清标本130份，其中献血员32份，年龄23～42岁；非癌住院患者30份(脑卒4份，肝硬化12份，高血压11份，消化性溃疡3份)，年龄31～64岁；消化道癌78份(胃癌62份，肝癌11份，大肠癌5份)，年龄48～78岁。以上肿瘤均经手术，病理证实。所有标本经肘静脉取血3 ml，新鲜分离血清，置-20℃保存，备用。
二、方法
1.P53蛋白粗制品的制备：收集数份经冰冻切片P53染色阳性胃癌组织，仔细剔除正常组织、纤维，并剪成1 mm×1 mm×1 mm，加入4倍体积的冰冷0.1 mol/L Tris 盐酸缓冲液 (内含0.1%苯磺酰氯，1.0% Triton-100)高速匀桨，4℃搅拌过夜，次日再超声粉碎(0℃15 s×8次)， 10 000 r/min离心15 min，弃沉淀，上清液经生理盐水透析平衡[3]。另取预经对 0.1 mol/L NaHCO3透析平衡的P53 MoAb 1 ml与1gCNBr-Sepharose 4B按说明书交联，即为亲和层析柱，将上述肿瘤上清液流穿此柱，经解吸后即可获P53粗制品。加0.1%NaN3置2～8℃保存。
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2.P53 MoAb与酯化生物素交联：同文献报道[4]。制备生物素化P53 MoAb置30%甘油2～8℃保存。
3.血清P53-IgG测定：将亲和素以10 mg/L浓度包被微孔，4℃过夜，次日取出洗涤3次后，用10%小牛血清37℃封闭30 min，洗涤2次，加入生物素化MoAb 50 μl和50 μl预经反应 4℃过夜的血清-P53粗制品混合液 (血清1∶50，P53粗制品1∶25，等量混匀)，混匀1 min，37℃反应60 min，洗涤3～5次，加入免抗人IgG酶标抗体，37℃反应60 min，洗涤3～5次，加四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)底物避光显色10～15 min，以50 μl/孔2 mol/L盐酸终止反应，以490 nm测各孔A值。同时设立阴性及空白对照。阳性判断标准：凡大于献血员平均吸光度X+2.56s以上者为阳性。
4.方法学质控：同一样本同次重复20孔，计算批内差异，同一样本不同批次连续检测10次，计算批间差异。
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三、统计方法
采用卡方检验。
结果
1.从近20 g肿瘤组织中用亲和层析法分离P53粗制品420 mg，用Western-Blot法鉴定内含数种杂蛋白，与P53 MoAb呈强反应。
2.不同疾患血清P53-IgG 阳性率测定结果表明献血员、非癌住院患者均无P53-IgG表达(0/32，0/30)，消化道肿患者P53-IgG阳性率34.62%(27/78)，显著高于前两组，P值均<0.01。血清P53-IgG测定的特异性100%，敏感性为34.62%。
3.免疫组化染色P53阳性患者血清P53-IgG测定结果示30例P53阴性患者P53-IgG均阴性，而48例P53阳性患者P53-IgG阳性率56.25%，二者差异有显著意义，P<0.01。提示P53-IgG表达与P53基因/蛋白表达密切相关。血清P53-IgG测定的阳性预测值100%，阴性预测值58.82%。
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4.5例P53-IgG阳性患者在肿瘤切除后15 d，30 d测定仍为阳性，6～12月后复查P53-IgG均为阴性。提示P53-IgG水平随肿切除缓慢下降，速度较慢可能与IgG半衰期长有关。
5.本方法测定的特异性100%，批内差异3.8%，批间差异16.2%。
讨论
P53抑癌基因分野生型和突变型2种。野生型存在于正常体细胞内，对细胞的生长、分化起调控作用，含量甚微，用现行技术不能检测到野生型蛋白；突变型P53基因由于其DNA碱基突变(多为点突变)，致合成的P53蛋白构象改变，正常生理功能丧失或减弱，并致P53蛋白在细胞核内异常堆积，易被现行技术检测到，业已证明这种异常的P53蛋白多表达于肿瘤细胞内，其表达是否与肿瘤预后有关[5]。Crawford等[1]发现突变型P53蛋白随肿瘤细胞的死亡崩解而释放入血，刺激机体免疫系统产生特异性的自身抗体。Trivers等[2]认为测定血清P53-IGG对预测肿瘤浸润转移和复发有重要价值。与传统的免疫组化染色法相比较，血清P53-IgG测定取材更方便，更有利于术后复发监测及P53动态观察。
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我们在国内率先建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。采用进口P53 MoAB作为第一抗体(包被抗体)避免了结果的假阳性、假阴性反应，保证方法的高特异性;采用亲和素-生物素技术可提高方法检测灵敏度。结果显示，本法检测特异性100%，批内差异3.8%，批间差异16.2%，具较高灵敏度。我们在试验中发现直接采用P53蛋白粗制品包被微孔时，其检测灵敏度低，P53蛋白粗制品用量大。遂设计了先将样本血清与P53蛋白粗制品反应，形成抗原抗体复合物，然后再分别与P53 MoAb、免抗人IgG酶标抗体反应，则避免了P53蛋白粗制品直接包被时的不足。
本试验结果表明，献血员和非癌住院患者血清P53-IgG均阴性，78份消化道肿瘤其阳性率为34.62%，48份经免疫组化染色P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%，敏感性34.62%，阳性预测值100%，阴性预测值58.82%。提示P53-IgG与P53蛋白表达相关。然也有部分P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阴性。因而P53-IgG阴性不能排除P53蛋白阳性可能，其原因可能与机体荷瘤大小、时间等有关，尚需作进一步探讨。另作者观察了P53-IgG阳性患者手术后的P53-IgG动态变化，发现术后15 d、30 d P53-IgG仍阳性，但术后6～12月则转为阴性。
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作者单位：谢鑫友(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
姜红英(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
林洁(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
费春荣(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
参考文献
1，Crawford LV，Pim DC，Bulbrook RD.Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int J Cancer, 1982, 30:403-408.
, http://www.100md.com
2，Trivers GE, Cawley HL, DeBenedtti VM,et al.Anti-p53 antibodies in sera of workers occupationally exposed to vinyl chloride. J Natl Cancer inst, 1995,87:1400-1407.
3，朱永良，钱可大，唐训球，等，抗胃癌细胞单克隆抗体的制备. 浙江医科大学学报，1996，25:21-23.
4，洪孝庄，孙曼雯，主编.蛋白质连接技术. 北京：中国医药科技出版社. 1993. 35-37.
5，Mudenda B, Green JA, Green B, et al. The relationship between serum P53 autoantibodies and characteristecs of human breast cancer. Br J Cancer, 1994, 6:1115-1119., 百拇医药
谢鑫友 姜红英 林洁 费春荣
摘 要 目的 建立血清P53蛋白IgG抗体 (P53-IgG) 酶免疫测定法，初步探讨其临床价值。方法 以P53MoAb为包被抗体，以亲和层析纯化浓缩P53蛋白作为中介，自行建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。结果 78例消化道癌P53-IgG阳性率34.62% (27/78)，而32名献血员和30例非癌住院患者均为阴性，P均<0.01。48 例经免疫组化P53蛋白染色阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25% (27/48)，显著高于阴性对照组(0/30)，P<0.01。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%，敏感度34.62%，阳性预测值100%，阴性预测值58.82%。本方法测定特异性100%，批内差异3.8%，批间差异16.2%。结论 血清P53-IgG测定与P53蛋白表达相关，是P53基因研究的新的辅助指标之一。
, http://www.100md.com
关键词：血清学诊断；酶联免疫吸附测定；P53抗体
P53抑癌基因是研究最为深入的肿瘤相关基因之一，其与肿瘤产生、肿瘤生长调控|肿瘤细胞凋亡等关系密切。P53基因表达与肿瘤浸润转移和复发潜能有关，P53基因蛋白(即P53蛋白)阳性的肿瘤预后不良。检测 P53基因/ 蛋白对评价患者预后和提高患者术后生存期限具重要价值。P53基因/蛋白检测以往仅限于手术切除肿瘤组织的免疫组织化学染色和DNA原位杂交。最近发现 P53基因/蛋白阳性肿瘤患者血清中存在特异性的抗P53蛋白抗体(P53-IgG)，P53-IgG测定可用于肿瘤转移，复发预测和P53表达动态观察，已引起了国内外学者的关注[1，2]。本研究自行建立了P53-IgG测定方法，并探讨其临床初步应用价值，现报道如下。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
1.试剂：CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia 公司，瑞典 )，P53 MoAb (MS-105，Clone: Pab 1801，福州迈新生物技术公司进口分装)，酯化生物素(美国Sigma公司)，亲和素 (上海丽珠东风试剂厂)，免抗人IgG酶标抗体(丹麦Dako公司)。
2.标本来源：血清标本130份，其中献血员32份，年龄23～42岁；非癌住院患者30份(脑卒4份，肝硬化12份，高血压11份，消化性溃疡3份)，年龄31～64岁；消化道癌78份(胃癌62份，肝癌11份，大肠癌5份)，年龄48～78岁。以上肿瘤均经手术，病理证实。所有标本经肘静脉取血3 ml，新鲜分离血清，置-20℃保存，备用。
二、方法
1.P53蛋白粗制品的制备：收集数份经冰冻切片P53染色阳性胃癌组织，仔细剔除正常组织、纤维，并剪成1 mm×1 mm×1 mm，加入4倍体积的冰冷0.1 mol/L Tris 盐酸缓冲液 (内含0.1%苯磺酰氯，1.0% Triton-100)高速匀桨，4℃搅拌过夜，次日再超声粉碎(0℃15 s×8次)， 10 000 r/min离心15 min，弃沉淀，上清液经生理盐水透析平衡[3]。另取预经对 0.1 mol/L NaHCO3透析平衡的P53 MoAb 1 ml与1gCNBr-Sepharose 4B按说明书交联，即为亲和层析柱，将上述肿瘤上清液流穿此柱，经解吸后即可获P53粗制品。加0.1%NaN3置2～8℃保存。
, 百拇医药
2.P53 MoAb与酯化生物素交联：同文献报道[4]。制备生物素化P53 MoAb置30%甘油2～8℃保存。
3.血清P53-IgG测定：将亲和素以10 mg/L浓度包被微孔，4℃过夜，次日取出洗涤3次后，用10%小牛血清37℃封闭30 min，洗涤2次，加入生物素化MoAb 50 μl和50 μl预经反应 4℃过夜的血清-P53粗制品混合液 (血清1∶50，P53粗制品1∶25，等量混匀)，混匀1 min，37℃反应60 min，洗涤3～5次，加入免抗人IgG酶标抗体，37℃反应60 min，洗涤3～5次，加四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)底物避光显色10～15 min，以50 μl/孔2 mol/L盐酸终止反应，以490 nm测各孔A值。同时设立阴性及空白对照。阳性判断标准：凡大于献血员平均吸光度X+2.56s以上者为阳性。
4.方法学质控：同一样本同次重复20孔，计算批内差异，同一样本不同批次连续检测10次，计算批间差异。
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三、统计方法
采用卡方检验。
结果
1.从近20 g肿瘤组织中用亲和层析法分离P53粗制品420 mg，用Western-Blot法鉴定内含数种杂蛋白，与P53 MoAb呈强反应。
2.不同疾患血清P53-IgG 阳性率测定结果表明献血员、非癌住院患者均无P53-IgG表达(0/32，0/30)，消化道肿患者P53-IgG阳性率34.62%(27/78)，显著高于前两组，P值均<0.01。血清P53-IgG测定的特异性100%，敏感性为34.62%。
3.免疫组化染色P53阳性患者血清P53-IgG测定结果示30例P53阴性患者P53-IgG均阴性，而48例P53阳性患者P53-IgG阳性率56.25%，二者差异有显著意义，P<0.01。提示P53-IgG表达与P53基因/蛋白表达密切相关。血清P53-IgG测定的阳性预测值100%，阴性预测值58.82%。
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4.5例P53-IgG阳性患者在肿瘤切除后15 d，30 d测定仍为阳性，6～12月后复查P53-IgG均为阴性。提示P53-IgG水平随肿切除缓慢下降，速度较慢可能与IgG半衰期长有关。
5.本方法测定的特异性100%，批内差异3.8%，批间差异16.2%。
讨论
P53抑癌基因分野生型和突变型2种。野生型存在于正常体细胞内，对细胞的生长、分化起调控作用，含量甚微，用现行技术不能检测到野生型蛋白；突变型P53基因由于其DNA碱基突变(多为点突变)，致合成的P53蛋白构象改变，正常生理功能丧失或减弱，并致P53蛋白在细胞核内异常堆积，易被现行技术检测到，业已证明这种异常的P53蛋白多表达于肿瘤细胞内，其表达是否与肿瘤预后有关[5]。Crawford等[1]发现突变型P53蛋白随肿瘤细胞的死亡崩解而释放入血，刺激机体免疫系统产生特异性的自身抗体。Trivers等[2]认为测定血清P53-IGG对预测肿瘤浸润转移和复发有重要价值。与传统的免疫组化染色法相比较，血清P53-IgG测定取材更方便，更有利于术后复发监测及P53动态观察。
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我们在国内率先建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。采用进口P53 MoAB作为第一抗体(包被抗体)避免了结果的假阳性、假阴性反应，保证方法的高特异性;采用亲和素-生物素技术可提高方法检测灵敏度。结果显示，本法检测特异性100%，批内差异3.8%，批间差异16.2%，具较高灵敏度。我们在试验中发现直接采用P53蛋白粗制品包被微孔时，其检测灵敏度低，P53蛋白粗制品用量大。遂设计了先将样本血清与P53蛋白粗制品反应，形成抗原抗体复合物，然后再分别与P53 MoAb、免抗人IgG酶标抗体反应，则避免了P53蛋白粗制品直接包被时的不足。
本试验结果表明，献血员和非癌住院患者血清P53-IgG均阴性，78份消化道肿瘤其阳性率为34.62%，48份经免疫组化染色P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%，敏感性34.62%，阳性预测值100%，阴性预测值58.82%。提示P53-IgG与P53蛋白表达相关。然也有部分P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阴性。因而P53-IgG阴性不能排除P53蛋白阳性可能，其原因可能与机体荷瘤大小、时间等有关，尚需作进一步探讨。另作者观察了P53-IgG阳性患者手术后的P53-IgG动态变化，发现术后15 d、30 d P53-IgG仍阳性，但术后6～12月则转为阴性。
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作者单位：谢鑫友(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
姜红英(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
林洁(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
费春荣(310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院)
参考文献
1，Crawford LV，Pim DC，Bulbrook RD.Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int J Cancer, 1982, 30:403-408.
, http://www.100md.com
2，Trivers GE, Cawley HL, DeBenedtti VM,et al.Anti-p53 antibodies in sera of workers occupationally exposed to vinyl chloride. J Natl Cancer inst, 1995,87:1400-1407.
3，朱永良，钱可大，唐训球，等，抗胃癌细胞单克隆抗体的制备. 浙江医科大学学报，1996，25:21-23.
4，洪孝庄，孙曼雯，主编.蛋白质连接技术. 北京：中国医药科技出版社. 1993. 35-37.
5，Mudenda B, Green JA, Green B, et al. The relationship between serum P53 autoantibodies and characteristecs of human breast cancer. Br J Cancer, 1994, 6:1115-1119., 百拇医药