支气管活检标本的端粒酶活性检测对肺癌的诊断价值
支气管活检标本的端粒酶活性检测对肺癌的诊断价值
王安潮 黄礼年 陈余清 徐凤珍 刘超
摘 要 目的 探讨肺癌组织端粒酶活性检测对肺癌的诊断价值。方法 采用端粒酶重复序列扩增法检测纤维支气管镜活组织检查的肺癌病变组织(70例)、肺癌对侧支气管组织(70例)及非癌性肺疾病支气管组织(20例)的端粒酶活性，并和病理学及细胞学检查结果进行比较。结果 肺癌病变组织端粒酶检出率为81%，明显高于肺癌对侧支气管组织(14%)( P<0.01) 及非癌性肺疾病支气管组织(10%)的检出率(P<0.01)；肺癌组织端粒酶检出率与活组织检查阳性率(87%)及刷检阳性率(76%)比较差异均无显著性(P>0.05)。结论 端粒酶活性的检测，对肺癌的诊断有重要意义。
关键词：肺癌；端粒酶；端粒酶重复序列扩增法；纤维支气管镜检查；活组织检查
端粒酶是目前国际上研究的最热门的肿瘤标志物之一[1]，1994年Kim[2]建立了高度敏感的重复序列扩增法(PCR-TRAP)端粒酶活性检测技术，目前已广泛用于各种恶性肿瘤多种标本的端粒酶活性检测。但尚未见纤维支气管镜(纤支镜)活组织检查(活检)标本端粒酶活性检测的报道。我们应用该技术检测了纤支镜活检的肺癌组织、肺癌对侧支气管和良性肺疾病支气管组织的端粒酶活性，并与肺癌病变活检及刷检结果进行对照，以期探讨端粒酶活性检测在肺癌诊断中的意义。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、标本来源
标本均为我院1998年10月～1999年6月住院及门诊纤支镜活检标本，经组织学和(或)细胞学证实为肺癌者70例，男性59例，女性11例，平均54岁；有吸烟史者46例。其中鳞癌47例，腺癌9 例，小细胞癌14例。术前均未行肺癌化疗及放疗。70例肺癌对侧支气管组织中有20例行病理检查，20例中18例显示慢性支气管粘膜炎，余为正常支气管粘膜组织。非癌性疾病20例，男性14例，女性6例，平均49岁；有吸烟史者10例。其中慢性支气管炎者8例，支气管扩张症者3例，肺结核浸润型和陈旧性各3例，肺脓肿、肺间质纤维化及支气管炭末沉着症各1例。病理检查示慢性支气管粘膜炎16例，余为鳞状化生和不典型增生。
二、端粒酶活性检测
1.端粒酶提取：标本离体后立即采集30～50 mg剪碎，在离体半小时内加入预冷端粒酶裂解液50 μl，冰浴1 h，4 ℃，16 000 g，离心20 min，小心移上清液至焦碳酸二酯(DEPC)水处理的预冷离心管内，双缩脲法测定蛋白质浓度，稀释至3 μg/μl，-80℃冻存。
, http://www.100md.com
2.端粒酶检测：采用PCR-TRAP法检测端粒酶活性(Telomerase PCR-TRAP试剂为德国宝德曼公司产品)。50 μl反应体系：2 μl细胞提取液(含6 μg蛋白)，25 μl扩增液[包括三脱氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶(Tng酶)、下游引物(TS引物，5′-AATCC GTCGAGCAGAGTT-3′)、上游引物(CX引物，5′- CTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3′)]， 加无菌DEPC水补足至50 μl混匀。以石蜡油覆盖，在480 PCR扩增仪(英国TECHNE ICAMBRIDGEI公司产)上进行引物延伸及扩增反应。25 ℃，30 min，94 ℃，3 min行端粒酶灭活，再以94 ℃，30 s，72 ℃，30 s，72 ℃，90 s，循环30次；最后置72 ℃，10 min平衡。PCR产物10 μl，加2 μl上样缓冲液，经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180 V，1 h)后，银染并照像。经聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法显影后可见二条以上间隔6 bp梯形条带的为阳性。
3.统计学分析：χ2检验，配对χ2检验。
, http://www.100md.com
结果
一、不同类型组织的端粒酶活性表达
1，2：非癌性肺疾病支气管组织；3，4：肺癌对侧支气管组织；5：293细胞阳性对照；6，7：肺癌病变组织；8：Lysis；9：ΔT293细胞阴性对照
图1 纤支镜活检标本的端粒酶活性表达
70例肺癌病变组织，端粒酶阳性检出率为81%(57/70)，其中小细胞肺癌和非小细胞肺癌分别为93%(13/14)和79%(44/56)；而肺癌对侧支气管组织，端粒酶阳性检出率只有14%(10/70)，与肺癌病变比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
表1 160例纤支镜活检组织的端粒酶活性表达
标本
, 百拇医药
例数
端粒酶活性
阳性(%)
阴性(%)
肺癌
70
57(81)
13(19)
鳞癌
47
37(78)
10(22)
腺癌
, 百拇医药
9
7(79)
2(21)
小细胞癌
14
13(93)
1( 7)
肺癌对侧支气管组织*
70
10(14)
60(86)
非癌性疾病支气管组织*
, 百拇医药
20
2(10)
18(90)
注：*与肺癌组织比较 P<0.01 20例非癌性疾病支气管组织，端粒酶阳性检出率仅10%(2/20)，该2例均为陈旧性肺结核，与肺癌组织比较差异有显著性(P<0.01)；但与肺癌对侧支气管组织比较差异无显著性(P>0.05)(表1，图1)。
二、肺癌组织端粒酶活性表达与临床生物学因素的关系
有吸烟史者，端粒酶阳性检出率为60%，无吸烟史者为22%，二者比较差异有显著性(P<0.05)。本组病例端粒酶活性表达与患者性别、年龄、组织学类型及分化程度之间均无相关性(P>0.05)。
三、肺癌组织端粒酶活性表达与病理及细胞学检查阳性率的比较
, 百拇医药
70例肺癌组织中，端粒酶表达阳性57例，病理诊断阳性61例(87%)，刷检涂片阳性53例(76%)，经配对χ2检验，阳性率差异均无显著性(χ2值前者与后二者比较分别为0.563和0.409，P>0.05)。端粒酶阳性表达的57例中，病理阳性51例，细胞学阳性44例；端粒酶阴性表达的13例中，病理及细胞学均阳性6例，单病理阳性4例，单细胞学阳性3例。70例肺癌组织中，活检、刷检双阳性45例，其中端粒酶阳性39例；活检阳性、刷检阴性16例，端粒酶阳性12例；刷检阳性、活检阴性8例，端粒酶阳性5例；活检、刷检均阴性1例，而端粒酶阳性。
讨论
大多数恶性肿瘤组织的端粒酶阳性检出率接近90%，肺癌组织为80%[3]，但正常组织及良性病变组织端粒酶活性常为阴性[2，3]。本组纤支镜活检肺癌组织的端粒酶阳性表达均明显高于肺癌对侧支气管及非癌性肺疾病支气管组织(P<0.01)。表明肺癌组织端粒酶活性检测有较高的敏感性和特异性，可作为肺癌诊断的重要手段。Kim等[2]报告，端粒酶活性表达水平与肿瘤类型及分化程度有一定的关系，但本组资料经统计学处理未显示这种相关性，与张行等[4]的报告一致， 这需要积累更多的资料加以研究。
, 百拇医药
本组肺癌对侧支气管及非癌性肺疾病支气管组织，端粒酶活性均有一定程度的表达，这是由于支气管粘膜的慢性炎症有淋巴细胞和白细胞浸润或不典型增生，细胞增殖活跃，致使端粒酶有低水平阳性表达[5，6]。当然，也不排除肺癌对侧支气管组织存在微小转移灶的可能。本组资料还显示，肺癌患者吸烟组较非吸烟组端粒酶阳性表达率高。
端粒酶是迄今发现的最广谱肿瘤标志物，对恶性肿瘤特异性强，端粒酶检测结合组织学和细胞学检查可提高肺癌的诊断率，本组分别达94%和93%，明显高于任何单项检查的诊断率。甚至肺癌在早期，组织学和细胞学难以诊断时，就可测得端粒酶活性[2，3]。端粒酶活性检测已成为诊断早期恶性肿瘤的重要手段，也可能是今后治疗癌症的新靶点。
作者单位：王安潮(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
黄礼年(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
, 百拇医药
陈余清(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
徐凤珍(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
刘超(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
参考文献
[1]Breslow RA， Shay JW， Gazdar AF，et al. Telomerase and early detection of cancer: a national cancer workshop.J Natl Cancer Inst，1997，89: 618-621.
[2]Kim NW， Piatyszek MA， Prowse KR， et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science，1994， 266: 2011-2015.
, 百拇医药
[3]Shay JW， Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，1997，37: 787-791.
[4]张行，应可净，蔡心涵，等.纤维支气管镜直视下肺刷落细胞端粒酶活性的检测.中华肿瘤杂志，1998，20：431-433.
[5]Hiyama K， Hirai Y， Kyoizumi S， et al. Activation of telomerase in human lymphytes and hematopoietic progenitor cells. J Immu，1995， 155: 3711.
[6]Hiyama E， Kodama T， Shinbara K， et al. Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors.Cancer Res，1997， 57: 326-331., 百拇医药
王安潮 黄礼年 陈余清 徐凤珍 刘超
摘 要 目的 探讨肺癌组织端粒酶活性检测对肺癌的诊断价值。方法 采用端粒酶重复序列扩增法检测纤维支气管镜活组织检查的肺癌病变组织(70例)、肺癌对侧支气管组织(70例)及非癌性肺疾病支气管组织(20例)的端粒酶活性，并和病理学及细胞学检查结果进行比较。结果 肺癌病变组织端粒酶检出率为81%，明显高于肺癌对侧支气管组织(14%)( P<0.01) 及非癌性肺疾病支气管组织(10%)的检出率(P<0.01)；肺癌组织端粒酶检出率与活组织检查阳性率(87%)及刷检阳性率(76%)比较差异均无显著性(P>0.05)。结论 端粒酶活性的检测，对肺癌的诊断有重要意义。
关键词：肺癌；端粒酶；端粒酶重复序列扩增法；纤维支气管镜检查；活组织检查
端粒酶是目前国际上研究的最热门的肿瘤标志物之一[1]，1994年Kim[2]建立了高度敏感的重复序列扩增法(PCR-TRAP)端粒酶活性检测技术，目前已广泛用于各种恶性肿瘤多种标本的端粒酶活性检测。但尚未见纤维支气管镜(纤支镜)活组织检查(活检)标本端粒酶活性检测的报道。我们应用该技术检测了纤支镜活检的肺癌组织、肺癌对侧支气管和良性肺疾病支气管组织的端粒酶活性，并与肺癌病变活检及刷检结果进行对照，以期探讨端粒酶活性检测在肺癌诊断中的意义。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、标本来源
标本均为我院1998年10月～1999年6月住院及门诊纤支镜活检标本，经组织学和(或)细胞学证实为肺癌者70例，男性59例，女性11例，平均54岁；有吸烟史者46例。其中鳞癌47例，腺癌9 例，小细胞癌14例。术前均未行肺癌化疗及放疗。70例肺癌对侧支气管组织中有20例行病理检查，20例中18例显示慢性支气管粘膜炎，余为正常支气管粘膜组织。非癌性疾病20例，男性14例，女性6例，平均49岁；有吸烟史者10例。其中慢性支气管炎者8例，支气管扩张症者3例，肺结核浸润型和陈旧性各3例，肺脓肿、肺间质纤维化及支气管炭末沉着症各1例。病理检查示慢性支气管粘膜炎16例，余为鳞状化生和不典型增生。
二、端粒酶活性检测
1.端粒酶提取：标本离体后立即采集30～50 mg剪碎，在离体半小时内加入预冷端粒酶裂解液50 μl，冰浴1 h，4 ℃，16 000 g，离心20 min，小心移上清液至焦碳酸二酯(DEPC)水处理的预冷离心管内，双缩脲法测定蛋白质浓度，稀释至3 μg/μl，-80℃冻存。
, http://www.100md.com
2.端粒酶检测：采用PCR-TRAP法检测端粒酶活性(Telomerase PCR-TRAP试剂为德国宝德曼公司产品)。50 μl反应体系：2 μl细胞提取液(含6 μg蛋白)，25 μl扩增液[包括三脱氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶(Tng酶)、下游引物(TS引物，5′-AATCC GTCGAGCAGAGTT-3′)、上游引物(CX引物，5′- CTTACCCTTACCCTTACCCTTA-3′)]， 加无菌DEPC水补足至50 μl混匀。以石蜡油覆盖，在480 PCR扩增仪(英国TECHNE ICAMBRIDGEI公司产)上进行引物延伸及扩增反应。25 ℃，30 min，94 ℃，3 min行端粒酶灭活，再以94 ℃，30 s，72 ℃，30 s，72 ℃，90 s，循环30次；最后置72 ℃，10 min平衡。PCR产物10 μl，加2 μl上样缓冲液，经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180 V，1 h)后，银染并照像。经聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法显影后可见二条以上间隔6 bp梯形条带的为阳性。
3.统计学分析：χ2检验，配对χ2检验。
, http://www.100md.com
结果
一、不同类型组织的端粒酶活性表达
1，2：非癌性肺疾病支气管组织；3，4：肺癌对侧支气管组织；5：293细胞阳性对照；6，7：肺癌病变组织；8：Lysis；9：ΔT293细胞阴性对照
图1 纤支镜活检标本的端粒酶活性表达
70例肺癌病变组织，端粒酶阳性检出率为81%(57/70)，其中小细胞肺癌和非小细胞肺癌分别为93%(13/14)和79%(44/56)；而肺癌对侧支气管组织，端粒酶阳性检出率只有14%(10/70)，与肺癌病变比较，差异有非常显著性(P<0.01)。
表1 160例纤支镜活检组织的端粒酶活性表达
标本
, 百拇医药
例数
端粒酶活性
阳性(%)
阴性(%)
肺癌
70
57(81)
13(19)
鳞癌
47
37(78)
10(22)
腺癌
, 百拇医药
9
7(79)
2(21)
小细胞癌
14
13(93)
1( 7)
肺癌对侧支气管组织*
70
10(14)
60(86)
非癌性疾病支气管组织*
, 百拇医药
20
2(10)
18(90)
注：*与肺癌组织比较 P<0.01 20例非癌性疾病支气管组织，端粒酶阳性检出率仅10%(2/20)，该2例均为陈旧性肺结核，与肺癌组织比较差异有显著性(P<0.01)；但与肺癌对侧支气管组织比较差异无显著性(P>0.05)(表1，图1)。
二、肺癌组织端粒酶活性表达与临床生物学因素的关系
有吸烟史者，端粒酶阳性检出率为60%，无吸烟史者为22%，二者比较差异有显著性(P<0.05)。本组病例端粒酶活性表达与患者性别、年龄、组织学类型及分化程度之间均无相关性(P>0.05)。
三、肺癌组织端粒酶活性表达与病理及细胞学检查阳性率的比较
, 百拇医药
70例肺癌组织中，端粒酶表达阳性57例，病理诊断阳性61例(87%)，刷检涂片阳性53例(76%)，经配对χ2检验，阳性率差异均无显著性(χ2值前者与后二者比较分别为0.563和0.409，P>0.05)。端粒酶阳性表达的57例中，病理阳性51例，细胞学阳性44例；端粒酶阴性表达的13例中，病理及细胞学均阳性6例，单病理阳性4例，单细胞学阳性3例。70例肺癌组织中，活检、刷检双阳性45例，其中端粒酶阳性39例；活检阳性、刷检阴性16例，端粒酶阳性12例；刷检阳性、活检阴性8例，端粒酶阳性5例；活检、刷检均阴性1例，而端粒酶阳性。
讨论
大多数恶性肿瘤组织的端粒酶阳性检出率接近90%，肺癌组织为80%[3]，但正常组织及良性病变组织端粒酶活性常为阴性[2，3]。本组纤支镜活检肺癌组织的端粒酶阳性表达均明显高于肺癌对侧支气管及非癌性肺疾病支气管组织(P<0.01)。表明肺癌组织端粒酶活性检测有较高的敏感性和特异性，可作为肺癌诊断的重要手段。Kim等[2]报告，端粒酶活性表达水平与肿瘤类型及分化程度有一定的关系，但本组资料经统计学处理未显示这种相关性，与张行等[4]的报告一致， 这需要积累更多的资料加以研究。
, 百拇医药
本组肺癌对侧支气管及非癌性肺疾病支气管组织，端粒酶活性均有一定程度的表达，这是由于支气管粘膜的慢性炎症有淋巴细胞和白细胞浸润或不典型增生，细胞增殖活跃，致使端粒酶有低水平阳性表达[5，6]。当然，也不排除肺癌对侧支气管组织存在微小转移灶的可能。本组资料还显示，肺癌患者吸烟组较非吸烟组端粒酶阳性表达率高。
端粒酶是迄今发现的最广谱肿瘤标志物，对恶性肿瘤特异性强，端粒酶检测结合组织学和细胞学检查可提高肺癌的诊断率，本组分别达94%和93%，明显高于任何单项检查的诊断率。甚至肺癌在早期，组织学和细胞学难以诊断时，就可测得端粒酶活性[2，3]。端粒酶活性检测已成为诊断早期恶性肿瘤的重要手段，也可能是今后治疗癌症的新靶点。
作者单位：王安潮(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
黄礼年(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
, 百拇医药
陈余清(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
徐凤珍(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
刘超(233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科)
参考文献
[1]Breslow RA， Shay JW， Gazdar AF，et al. Telomerase and early detection of cancer: a national cancer workshop.J Natl Cancer Inst，1997，89: 618-621.
[2]Kim NW， Piatyszek MA， Prowse KR， et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science，1994， 266: 2011-2015.
, 百拇医药
[3]Shay JW， Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，1997，37: 787-791.
[4]张行，应可净，蔡心涵，等.纤维支气管镜直视下肺刷落细胞端粒酶活性的检测.中华肿瘤杂志，1998，20：431-433.
[5]Hiyama K， Hirai Y， Kyoizumi S， et al. Activation of telomerase in human lymphytes and hematopoietic progenitor cells. J Immu，1995， 155: 3711.
[6]Hiyama E， Kodama T， Shinbara K， et al. Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors.Cancer Res，1997， 57: 326-331., 百拇医药