陕西省老年人群Rb基因的多态性研究
陕西省老年人群Rb基因的多态性研究
郑强荪 舒青 刘军 张宁 张宁仔
摘 要 目的 探讨老年人群Rb基因内含子17、20的多态性分布及该位点与衰老的相关性。 方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术先后对老年人(100例)和青年人(52例)的Rb基因17内含子位 点及对老年人(68例)和青年人(56例)的Rb基因20内含子位点进行检测。 结果 在老年组中，Rb基因17内含子位点共检测出2个等位基因片段:945 bp(A)及630+315 bp(B),基因型频率：A/A 0.20,A/B 0.45,B/B 0.35,等位基因频率：A 0.43，B 0.57；与青年组基因型频率差异无显著性意义。在老年组中，Rb基因20内含子位点共检测出18个等位基因片段，片段大小在260～390 bp之间,杂合率为0.68，多态信息量(PIC)为0.85，其基因频率与青年组比较，差异有显著性(P<0.001)。老年组基因分布高峰在2 90 bp(35.3%)，青年组在300 bp(29.5%)。部分片段差异有显著性意义。 结论 Rb基因17内含子位点的多态性较稳定，不易发生突变。老年组Rb基因20内含子的位点多态性与青年组比较差异有显著性意义，是否该位点遗传标记与细胞的衰老有一定的相关性，值得进一步研究。
, http://www.100md.com
关键词：基因，视网膜母细胞瘤；DNA，卫星；DNA序列，不稳定
近年发现一些遗传病的致病原因是分子动态突变所致〔1,2〕,动态突变指DNA中的碱基重复序列拷贝数发生扩增而导致的突变，即含微卫星DNA的不稳定性(MSI)。重复序列拷贝数的增加或减少，均可使基因变得不稳定,可表现出病症或在染色体上出现脆性位点。Rb基因是细胞增殖的抑制基因,我们对老年人群中Rb基因(内含子20、17)多态性的分布及其与青年人群是否存在差异进行研究，以此探讨老年人群的遗传标记是否随衰老而发生改变。
材料和方法
一、材料
1.对象：老年组：100例，为1998年3月至1999年6月唐都医院心内科陕西省汉族住院患者，年龄60～75岁，男性57例，女性43例。经动脉造影和超声多普勒检查无狭窄和粥样硬化斑块，无肿瘤。青年组：56例(无血缘关系)，西京医院血库提供血液标本，20～28岁，男性25例，女性31例。先后进行Rb基因内含子20和17的检测。
, 百拇医药
2.引物：(1)内含子20引物序列：A 5'-CTCCTCCCTACTTACTTGT-3',B 5'-AATTAACAAGGTGTGGTGG-3'(2)内含子17引物序列：A5'-TTGAACCTAACACGTTAACG-3',B5'-GGTAACAAGAAGTAACCTT-3'(美联公司合成)。
二、方法
1.DNA抽提：取静脉血3～5 ml，采用蛋白酶K消化法及常规酚-氯仿法提取基因组DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)扩增：PCR反应总体积为30 μl，依次加入灭菌双蒸水，10×缓冲液3 μl，引物各25 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L 2.4 μl,Taq酶2.5 U(上海Promega公司产品)，DNA模板约0.5 μg。PCR扩增在美国PE公司DNA扩增仪上进行。内含子17扩增条件：97℃变性10 min，94℃变性45 s；48℃退火45 s；72℃延伸1 min，循环30次，最后一次循环72℃延伸10 min。扩增产物用限制性内切酶XbaI消化，37℃ 4 h，在1%琼脂糖凝胶(Sigma公司产品)电泳，35 V电泳1 h,溴乙锭(EB)染色，紫外光灯下观察并照相。内含子20扩增条件：97℃变性10 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，循环30次，最后一次循环72℃延伸10 min。产物用8%聚丙烯酰胺凝胶(Gibco公司产品)电泳，160 V电泳4 h,EB染色，凝胶分析系统分析并照相。测序确定其重复单位。以质粒载体pBR 322 DNA/MspI为标记物。
, http://www.100md.com
三、统计方法
计算各组基因频率、基因型频率，并按Hardy-Weinberg平衡原理确认样本的群体代表性，组之间基因频率比较用χ2检验。基因杂合率及多态信息量(PIC)计算使用Cooper的方法。
结 果
一、老年组与青年组Rb基因17内含子的多态分布
见表1、图1。100例非肿瘤、非动脉粥样硬化老年人基因组DNA经PCR检测后，发现2种等位基因片段:945 bp(A)及630 bp+15 bp(B)，基因型频率：A/A 0.20,A/B 0.45,B/B 0.35,等位基因频率：A 0.43,B 0.57。与52例青年组比较差异无显著性(P>0.05)。
表1 老年组与青年组Rb基因17内含子基因型分布
, 百拇医药
组别
例数
基因型频率
等位基因频率
A/A
A/B
B/B
A
B
青年组
52
0.29
0.52
, http://www.100md.com
0.19
0.45
0.55
老年组
100
0.20
0.45
0.35
0.43
0.57
1～3:青年组；4～7：老年组
图1 老年组与青年组Rb基因17内含子PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
, http://www.100md.com
二、老年组与青年组Rb基因20内含子位点数目的可变串联顺序(VNTR)区的多态分布
见表2、图2。68例老年人基因组DNA经PCR检测后，发现多态片段18个，片段大小在390～260 bp之间，频率分布在0.007～0.228。其中>290 bp占90.4%，<290 bp占9.6%，高峰在290 bp(35.3%)。该位点杂合率为0.68，PIC 0.85。青年组分布高峰在300 bp(29.5%)。将老年组基因频率分布与56例青年人比较，差异有显著性(P<0.001)。老年组VNTR分布为1个峰(290 bp)，青年组为2个峰(320 bp和300 bp)。在320 bp和280 bp处，两组差异有显著性(P<0.05和P<0.01)。群体符合Hardy-Weinberg平衡。
表2 老年组与青年组Rb基因20内含子VNTR多态分布
组别
, 百拇医药
例数
等位基因频率(%)
杂合率
PIC
＃ 390～330
330～320
320～310
310～300
300～290
290～280
280～260
老年组
, 百拇医药
68
8.8
3.7
16.1
26.5
35.3
3.7
5.9
0.68
0.85
青年组
56
1.8
, 百拇医药
15.2
8.9
29.5
20.5
15.2
8.9
0.70
0.86
注：＃ 单位为bp
M:DNA标记物；1～4：青年组；5～8：老年组
图2 老年组与青年组Rb基因20内含子PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图
, 百拇医药
讨 论
Rb基因是视网膜母细胞瘤易感基因，位于13q14，是隐性抑癌基因,其产物是一个相对分子质量为110000的核磷酸蛋白。其作用主要是通过结合转录因子E 2 F，起到抑制细胞增殖的作用，近来发现Rb也可通过抑制RNA聚合酶I和RNA聚合酶III的转录作用，控制细胞的生长〔3〕。Rb基因因其突变而失活的现象已在不少恶性肿瘤，如视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤等中发现〔4〕。
VNTR、微卫星DNA是人类基因组内具有高度多态性的遗传标志。动态突变指DNA中的碱基重复序列拷贝数发生改变而导致的突变。重复序列拷贝数通常有一定的范围,超过这个范围,基因将变得不稳定,就可表现出病症或在染色体上出现脆性位点。这种拷贝数改变可发生在减数分裂过程中，不稳定性表现在世代间的拷贝数改变；也可发生在有丝分裂过程中，不稳定性表现在同一个体不同组织或细胞系的DNA呈现长度不同的多条杂交带。近年来，在多种肿瘤中均发现有MSI的存在，被认为其与肿瘤的发生有关〔5,6〕。本资料中，陕西省老年汉族人群Rb基因20内含子具有高度多态性，与青年人比较发现，多态片段增多，分布范围扩大，多态片段分布改变。有关衰老的“差错灾难学说”认为,在DNA-RNA-蛋白质遗传信息传递的每一步骤上，一旦发生错误，都可形成具有缺陷的蛋白质或酶的分子，日积月累，使细胞功能明显降低，导致细胞衰老和死亡。本组结果可能为衰老的“差错灾难学说”提供了实验依据。同时对Rb基因17内含子多态分布的检测结果表明，该位点在外显子17下游的21.8kb处，与青年组比较差异无显著性与白种人该位点的等位基因频率(A 0.55,B 0.45)比较，差异也无显著性〔7〕,推测该位点是一个较稳定的遗传标记。
, http://www.100md.com
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39600126、39700165)
作者单位：郑强荪(710038 西安市，第四军医大学附属唐都医院心脏内科)
刘军(710038 西安市，第四军医大学附属唐都医院心脏内科)
张宁仔(710038 西安市，第四军医大学附属唐都医院心脏内科)
舒青(医学遗传教研室)
张宁(医学遗传教研室)
参考文献
1，Formasarig M, Viel A, Valentini M, et al. Microsatellite instability and MLH1 and MSH2 germline defects are related to clinicopathological features in sporad ic colorectal cancer. Oncol Rep, 2000,7:39-43.
, 百拇医药
2，Gryfe R, Kim H, Hsieh ET,et al. Tumor microsatellite instability and c linical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med, 2000,342:69-77 .
3，Weinber RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell, 1 995, 81:323-330.
4，Weinber RA. Oncogenes, antioncogenes and the molecular bases of multis tep carciogenesis. Cancer Res, 1989,49:3713-3721.
5，Halling KC, Harper J, Moskaluk CA, et al. Origin of microsatellite ins tability in gastric cancer. Am J Pathol, 1999,155:205-216.
6，Vassilakis DA, Sourvinos G, Markatos M, et al. Microsatellite DNA ins tabilit y and loss of heterozygosity in pulmonary sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med , 1999,160:1729-1762.
7，Torri L, Glem S, David W, et al. Detection of the Xba I RFLP within th e retinoblastoma locus by PCR. Nucl Acids Res, 1990, 18:207., 百拇医药
郑强荪 舒青 刘军 张宁 张宁仔
摘 要 目的 探讨老年人群Rb基因内含子17、20的多态性分布及该位点与衰老的相关性。 方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术先后对老年人(100例)和青年人(52例)的Rb基因17内含子位 点及对老年人(68例)和青年人(56例)的Rb基因20内含子位点进行检测。 结果 在老年组中，Rb基因17内含子位点共检测出2个等位基因片段:945 bp(A)及630+315 bp(B),基因型频率：A/A 0.20,A/B 0.45,B/B 0.35,等位基因频率：A 0.43，B 0.57；与青年组基因型频率差异无显著性意义。在老年组中，Rb基因20内含子位点共检测出18个等位基因片段，片段大小在260～390 bp之间,杂合率为0.68，多态信息量(PIC)为0.85，其基因频率与青年组比较，差异有显著性(P<0.001)。老年组基因分布高峰在2 90 bp(35.3%)，青年组在300 bp(29.5%)。部分片段差异有显著性意义。 结论 Rb基因17内含子位点的多态性较稳定，不易发生突变。老年组Rb基因20内含子的位点多态性与青年组比较差异有显著性意义，是否该位点遗传标记与细胞的衰老有一定的相关性，值得进一步研究。
, http://www.100md.com
关键词：基因，视网膜母细胞瘤；DNA，卫星；DNA序列，不稳定
近年发现一些遗传病的致病原因是分子动态突变所致〔1,2〕,动态突变指DNA中的碱基重复序列拷贝数发生扩增而导致的突变，即含微卫星DNA的不稳定性(MSI)。重复序列拷贝数的增加或减少，均可使基因变得不稳定,可表现出病症或在染色体上出现脆性位点。Rb基因是细胞增殖的抑制基因,我们对老年人群中Rb基因(内含子20、17)多态性的分布及其与青年人群是否存在差异进行研究，以此探讨老年人群的遗传标记是否随衰老而发生改变。
材料和方法
一、材料
1.对象：老年组：100例，为1998年3月至1999年6月唐都医院心内科陕西省汉族住院患者，年龄60～75岁，男性57例，女性43例。经动脉造影和超声多普勒检查无狭窄和粥样硬化斑块，无肿瘤。青年组：56例(无血缘关系)，西京医院血库提供血液标本，20～28岁，男性25例，女性31例。先后进行Rb基因内含子20和17的检测。
, 百拇医药
2.引物：(1)内含子20引物序列：A 5'-CTCCTCCCTACTTACTTGT-3',B 5'-AATTAACAAGGTGTGGTGG-3'(2)内含子17引物序列：A5'-TTGAACCTAACACGTTAACG-3',B5'-GGTAACAAGAAGTAACCTT-3'(美联公司合成)。
二、方法
1.DNA抽提：取静脉血3～5 ml，采用蛋白酶K消化法及常规酚-氯仿法提取基因组DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)扩增：PCR反应总体积为30 μl，依次加入灭菌双蒸水，10×缓冲液3 μl，引物各25 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L 2.4 μl,Taq酶2.5 U(上海Promega公司产品)，DNA模板约0.5 μg。PCR扩增在美国PE公司DNA扩增仪上进行。内含子17扩增条件：97℃变性10 min，94℃变性45 s；48℃退火45 s；72℃延伸1 min，循环30次，最后一次循环72℃延伸10 min。扩增产物用限制性内切酶XbaI消化，37℃ 4 h，在1%琼脂糖凝胶(Sigma公司产品)电泳，35 V电泳1 h,溴乙锭(EB)染色，紫外光灯下观察并照相。内含子20扩增条件：97℃变性10 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，循环30次，最后一次循环72℃延伸10 min。产物用8%聚丙烯酰胺凝胶(Gibco公司产品)电泳，160 V电泳4 h,EB染色，凝胶分析系统分析并照相。测序确定其重复单位。以质粒载体pBR 322 DNA/MspI为标记物。
, http://www.100md.com
三、统计方法
计算各组基因频率、基因型频率，并按Hardy-Weinberg平衡原理确认样本的群体代表性，组之间基因频率比较用χ2检验。基因杂合率及多态信息量(PIC)计算使用Cooper的方法。
结 果
一、老年组与青年组Rb基因17内含子的多态分布
见表1、图1。100例非肿瘤、非动脉粥样硬化老年人基因组DNA经PCR检测后，发现2种等位基因片段:945 bp(A)及630 bp+15 bp(B)，基因型频率：A/A 0.20,A/B 0.45,B/B 0.35,等位基因频率：A 0.43,B 0.57。与52例青年组比较差异无显著性(P>0.05)。
表1 老年组与青年组Rb基因17内含子基因型分布
, 百拇医药
组别
例数
基因型频率
等位基因频率
A/A
A/B
B/B
A
B
青年组
52
0.29
0.52
, http://www.100md.com
0.19
0.45
0.55
老年组
100
0.20
0.45
0.35
0.43
0.57
1～3:青年组；4～7：老年组
图1 老年组与青年组Rb基因17内含子PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
, http://www.100md.com
二、老年组与青年组Rb基因20内含子位点数目的可变串联顺序(VNTR)区的多态分布
见表2、图2。68例老年人基因组DNA经PCR检测后，发现多态片段18个，片段大小在390～260 bp之间，频率分布在0.007～0.228。其中>290 bp占90.4%，<290 bp占9.6%，高峰在290 bp(35.3%)。该位点杂合率为0.68，PIC 0.85。青年组分布高峰在300 bp(29.5%)。将老年组基因频率分布与56例青年人比较，差异有显著性(P<0.001)。老年组VNTR分布为1个峰(290 bp)，青年组为2个峰(320 bp和300 bp)。在320 bp和280 bp处，两组差异有显著性(P<0.05和P<0.01)。群体符合Hardy-Weinberg平衡。
表2 老年组与青年组Rb基因20内含子VNTR多态分布
组别
, 百拇医药
例数
等位基因频率(%)
杂合率
PIC
＃ 390～330
330～320
320～310
310～300
300～290
290～280
280～260
老年组
, 百拇医药
68
8.8
3.7
16.1
26.5
35.3
3.7
5.9
0.68
0.85
青年组
56
1.8
, 百拇医药
15.2
8.9
29.5
20.5
15.2
8.9
0.70
0.86
注：＃ 单位为bp
M:DNA标记物；1～4：青年组；5～8：老年组
图2 老年组与青年组Rb基因20内含子PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图
, 百拇医药
讨 论
Rb基因是视网膜母细胞瘤易感基因，位于13q14，是隐性抑癌基因,其产物是一个相对分子质量为110000的核磷酸蛋白。其作用主要是通过结合转录因子E 2 F，起到抑制细胞增殖的作用，近来发现Rb也可通过抑制RNA聚合酶I和RNA聚合酶III的转录作用，控制细胞的生长〔3〕。Rb基因因其突变而失活的现象已在不少恶性肿瘤，如视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤等中发现〔4〕。
VNTR、微卫星DNA是人类基因组内具有高度多态性的遗传标志。动态突变指DNA中的碱基重复序列拷贝数发生改变而导致的突变。重复序列拷贝数通常有一定的范围,超过这个范围,基因将变得不稳定,就可表现出病症或在染色体上出现脆性位点。这种拷贝数改变可发生在减数分裂过程中，不稳定性表现在世代间的拷贝数改变；也可发生在有丝分裂过程中，不稳定性表现在同一个体不同组织或细胞系的DNA呈现长度不同的多条杂交带。近年来，在多种肿瘤中均发现有MSI的存在，被认为其与肿瘤的发生有关〔5,6〕。本资料中，陕西省老年汉族人群Rb基因20内含子具有高度多态性，与青年人比较发现，多态片段增多，分布范围扩大，多态片段分布改变。有关衰老的“差错灾难学说”认为,在DNA-RNA-蛋白质遗传信息传递的每一步骤上，一旦发生错误，都可形成具有缺陷的蛋白质或酶的分子，日积月累，使细胞功能明显降低，导致细胞衰老和死亡。本组结果可能为衰老的“差错灾难学说”提供了实验依据。同时对Rb基因17内含子多态分布的检测结果表明，该位点在外显子17下游的21.8kb处，与青年组比较差异无显著性与白种人该位点的等位基因频率(A 0.55,B 0.45)比较，差异也无显著性〔7〕,推测该位点是一个较稳定的遗传标记。
, http://www.100md.com
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39600126、39700165)
作者单位：郑强荪(710038 西安市，第四军医大学附属唐都医院心脏内科)
刘军(710038 西安市，第四军医大学附属唐都医院心脏内科)
张宁仔(710038 西安市，第四军医大学附属唐都医院心脏内科)
舒青(医学遗传教研室)
张宁(医学遗传教研室)
参考文献
1，Formasarig M, Viel A, Valentini M, et al. Microsatellite instability and MLH1 and MSH2 germline defects are related to clinicopathological features in sporad ic colorectal cancer. Oncol Rep, 2000,7:39-43.
, 百拇医药
2，Gryfe R, Kim H, Hsieh ET,et al. Tumor microsatellite instability and c linical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med, 2000,342:69-77 .
3，Weinber RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell, 1 995, 81:323-330.
4，Weinber RA. Oncogenes, antioncogenes and the molecular bases of multis tep carciogenesis. Cancer Res, 1989,49:3713-3721.
5，Halling KC, Harper J, Moskaluk CA, et al. Origin of microsatellite ins tability in gastric cancer. Am J Pathol, 1999,155:205-216.
6，Vassilakis DA, Sourvinos G, Markatos M, et al. Microsatellite DNA ins tabilit y and loss of heterozygosity in pulmonary sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med , 1999,160:1729-1762.
7，Torri L, Glem S, David W, et al. Detection of the Xba I RFLP within th e retinoblastoma locus by PCR. Nucl Acids Res, 1990, 18:207., 百拇医药