风湿性心脏病乳头肌中生长因子的表达及其意义
风湿性心脏病乳头肌中生长因子的表达及其意义
任崇雷 刘维永 张近宝 李文芳
摘 要 目的 了解风湿性心脏病(风心病)心肌中生长因子表达的特点，探讨生长因子与风心病心肌纤维化的关系。方法 风心病病人30例，其中二尖瓣狭窄(MS)为主16例，二尖瓣关闭不全(MR)为主14例，术中取左室乳头肌，成年及胎儿正常乳头肌各5例为对照，Masson染色检测心肌胶原；免疫组化方法观察转化生长因子β1(TGFβ1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)在心肌中的表达，均用图像分析仪定量分析。结果 结果 TGFβ1、bFGF在风心病心肌细胞中阳性表达增强，表达强度与心肌纤维化面积呈正相关(P<0.05)；bFGF在MR组的表达(52±11) Od/μm2强于MS组(39±12) Od/μm2；VEGF和bFGF还在心肌血管内皮细胞中表达。结论 细胞生长因子TGFβ1、bFGF均在风心病心肌纤维化形成中起作用，bFGF可能参与了风心病心肌细胞肥大过程，VEGF和bFGF还可能通过刺激新生血管的生成而参与风心病心肌重构，因此调控此类生长因子，可能为逆转风心病心肌纤维化展示了新思路。
, 百拇医药
关键词：风湿性心脏病；生长物质；心肌；纤维变性
本实验以临床风湿性心脏病(风心病)病人为研究对象，术中取左室乳头肌，用免疫组织化学方法检测转化生长因子β1(TGFβ1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)在风心病心肌中的表达，了解其分布特点及规律，探讨生长因子在风心病胶原代谢及心肌纤维化形成中的作用及意义，从分子水平阐明风心病胶原增生的发生和调控机制，为预防和逆转风心病心肌胶原增生提供理论依据及新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料：病变组标本(30例)选自我院确诊为风心病行二尖瓣替换术的左室乳头肌，除外合并主动脉瓣病变或冠心病者，其中男11例，女19例，年龄23～54岁，心功能Ⅲ级23例，Ⅳ级7例，病史1～30年。术前常规行心脏彩色多普勒检查和心功能检测。按瓣口面积和返流程度分为二尖瓣狭窄为主组(MS组)16例(瓣口面积<1.3 cm2，返流量<3 ml)；二尖瓣关闭不全为主组(MR组)14例(瓣口面积>1.5 cm2，返流量>6 ml)。对照组5例为成年尸检标本，取自意外死亡成年正常左室乳头肌；另5例对照组为胎儿尸检标本，取自3～7月龄死胎左室乳头肌。免疫组织化学染色所用兔抗人TGF-β1、bFGF、VEGF多克隆抗体(1∶50)为美国Santa Cruz公司产品，兔SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法：病变组标本在手术中取材，成年及胎儿尸检标本均在死后半小时内取材，40 ml/L多聚甲醛固定4～6 h，常规石蜡包埋，连续切片厚4 μm，分别做Masson及免疫组织化学染色。免疫组织化学染色经常规脱蜡至水，双氧水封闭内源性过氧化物酶，羊血清封闭，一抗孵育4 ℃过夜，生物素化的羊抗兔二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液各孵育30 min，DAB显色，苏木精衬染，封片，镜下观察。同时设有PBS阴性对照和抗流行性出血热病毒抗体替代对照。
1.3 统计学处理：将Masson及免疫组化染色切片在显微镜下随机选取5个视野，输入自动图像分析仪，定量检测心肌纤维化面积、细胞阳性反应光密度值。所有数据以均数±标准差表示，用第四军医大学SPLM统计软件分析，组间比较用方差分析或t检验，部分参数间采用线性相关分析，P<0.05为检验显著水平。
2 结 果
2.1 生长因子在心肌中的表达：TGFβ1、bFGF及VEGF均弥漫表达于风心病心肌细胞质，bFGF、VEGF还在血管内皮细胞质表达(图1)；正常成人心肌组织中三种因子均表达弱阳性或阴性(图2)，胎儿心肌表达阳性但不如风心病心肌中强(图3)。图像分析的半定量结果亦显示，风心病心肌中TGFβ1、bFGF及VEGF含量均较正常对照组明显增高(P<0.01)，而与胎儿组接近(P>0.05)(见表1，图4)。统计结果显示，实验组中MR组较MS组bFGF的表达更高(P<0.05)。
, 百拇医药
图1 风心病乳头肌中三种生长因子表达情况(免疫组化染色,棕黄色为阳性表达信号,3.3×40)
a:TGFβ1 b:bFGF1 c:VEGF
图2 成年正常乳头肌中三种生长因子表达情况(免疫组化染色,棕黄色为阳性表达信号,3.3×40)
a:TGFβ1 b:bFGF1 c:VEGF
, http://www.100md.com
图3 胎儿正常乳头肌中三种生长因子表达情况(免疫组化染色,棕黄色为阳性表达信号,3.3×40)
a:TGFβ1 b:bFGF1 c:VEGF
2.2 生长因子与心肌纤维化的关系：将实验组TGFβ1、bFGF及VEGF的半定量值与纤维化面积进行相关分析，发现TGFβ1、bFGF的表达程度与心肌纤维化面积均呈正相关，即随心肌纤维化面积的增加，TGFβ1(r＝0.817 4，P<0.001)、bFGF(r＝0.514 9，P<0.05)表达增强，而VEGF的表达与心肌纤维化面积相关不显著(r＝0.208 6，P>0.05)。
表1 TGFβ1、bFGF及VEGF在各组心肌中的表达(X±s)
, 百拇医药 Od/μm2
项目
对照组
实验组
成人(5例)
胎儿(5例)
MS(16例)
MR(14例)
TGFβ1
7±4
35±6
45±16*
, 百拇医药
43±13*
bFGF
5±3
33±4
39±12*
52±11*Δ
VEGF
6±4
36±5
31±6*
32±6*
, 百拇医药 注：与成人组比P<0.01；Δ与MS组比P<0.05
图4 TGFβ1、bFGF及VEGF在各组心肌中的表达
3 讨 论
TGFβ1是一种多功能的蛋白质，是TGFβ家族中最重要的一个成员。体内外实验研究[1-3]表明，TGFβ1能增加胶原为主的间质蛋白质的合成，在器官纤维化形成过程中起作用。国内有研究[4]报道TGFβ1在风心病瓣膜纤维化中的作用，在风心病心肌纤维化中的作用尚未见报道。本研究用免疫组织化学技术检测发现，TGFβ1在风心病心肌表达增强，表达强度与心肌纤维化面积呈正相关，表明TGFβ1参与了风心病心肌纤维化的形成过程。研究结果还显示TGFβ1主要分布在心肌细胞中，提示TGFβ1可能是由心肌细胞合成、分泌的。我实验室还发现风心病心肌纤维化时心肌间质成纤维细胞和心肌细胞均参与了胶原的合成[5]，因此TGFβ1可能既通过旁分泌调节成纤维细胞对胶原的合成，又通过自分泌调控方式影响心肌细胞的胶原合成。因此设法抑制TGFβ1的激活、释放或拮抗其对胶原合成的上调作用，有可能为临床防治风心病心肌纤维化提供新的手段。
, 百拇医药
bFGF是一种对中胚层来源的细胞有强烈促增生和分化作用的细胞生长因子，可促进血管内皮细胞的生长而在血管生成中起作用[6]。本研究显示，bFGF在风心病心肌中表达增强，表达强度与心肌纤维化面积呈正相关，且主要定位于心肌细胞质中，和TGFβ1相似。说明bFGF和TGFβ1在风心病心肌胶原增生中协同起上调作用。Chua等[7]在心脏成纤维细胞的培养中发现，单用bFGF，可刺激胶原酶的分泌，使胶原生成减少；而与TGFβ1合用，则抑制胶原酶的分泌，胶原合成增多；并认为其不同的作用与细胞因子网络有关。并提示若从细胞因子的作用方面寻求防治心肌纤维化的方法，要注意细胞因子网络间的相互作用。另外，研究结果还显示，二尖瓣关闭不全组中bFGF表达较二尖瓣狭窄组更强。bFGF还可能在二尖瓣关闭不全组的心肌细胞肥大发病过程中起作用。这与特发性心肌病中的发现相吻合[8]。
VEGF是近年来发现的一种高度特异的、强烈的血管内皮细胞促分裂因子和血管生成因子，它能促使生理性及病理性的血管生成[9]，与bFGF在血管生成中的作用相似。本研究还发现，VEGF在风心病心肌细胞中表达增强，除在心肌细胞表达外，还和bFGF一样发现在血管内皮细胞亦有阳性表达。VEGF和bFGF均可能通过刺激新生血管的生成而参与了风心病心肌重构过程。
, 百拇医药
在此前的相关研究中我们还发现风心病肥大的心肌细胞有向胎儿心肌细胞表型转化的征象[10]。本研究中，我们也对风心病组和成人对照组及胎儿对照组细胞生长因子的表达做了对比，发现以上三种生长因子在成年对照组表达均较弱，而在风心病及胎儿组表达相似，均明显增强。虽然还不能就此得出是生长因子使风心病心肌细胞发生了表型转化的结论，但生长因子的激活、释放可能是引起风心病心肌细胞表型转化的因素之一。
根据上述细胞生长因子在风心病心肌纤维化过程中的作用机制，调控此类因子的表达，可能为逆转风湿性心肌胶原增生展示新思路。
(本文图1～3见插页图第7页)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870790)
任崇雷(710032 西安，第四军医大学西京医院心血管外科)
, 百拇医药
刘维永(710032 西安，第四军医大学西京医院心血管外科)
张近宝(710032 西安，第四军医大学西京医院心血管外科)
李文芳(解放军466医院心胸外科)
参考文献
1，Czaja MJ,Weiner FR,Flanders KC,et al.In vitro and in vivo association of transforming growth factor β1 with hepatic fibrosis.J Cell Biol,1989,108:2477-2482.
2，Broekelmann TJ,Limper AH,Colby TV,et al.Transforming gro-wth factor β1 is present at sites of extracellular matrix gene expression in human pulmonary fibrosis.Proc Natl Acad Sci USA,1991,14:269-273.
, http://www.100md.com
3，Li TM,Brooks G.Differential protein expression and subcellular distribution of transforming growth factor β1，β2 and β3 in cardiomyocytes during pressure over-load-induced hypertrophy.J Mol Cell Cardiol,1997,29:2213.
4，杨军民，张宝仁，谢毅，等.风湿性心脏瓣膜胶原及转化生长因子β1改变的初步研究.中华心血管病杂志，1997，25：103-105.
5，樊宏，刘维永，晏培松，等.风湿性心脏病二尖瓣和心肌间质病理组织学及免疫组化观察.中华医学杂志，1996，76：183-186.
, http://www.100md.com 6，Gospodarowicz D,Ferrara N,Schweigerer L,et al.Structural characterization and biological functions of basic fibroblast growth factor.Endocr Rev,1987,8:95.
7，Chua C,Chua BHL, Zhao ZY,et al.Effect of growth factors on collagen metabolism in cultured human heart fibroblasts.Connect Tissue Res,1991,26:2771-2810.
8，Tomita Y,Kusama Y,Seino Y,et al.Increased accumulation of fibroblast growth factor in left ventricular myocytes of patients with idiopathic cardiomyopathy.Am Heart J,1997,134:778-779.
9，Ferrara N,Henzel WJ.Pituitary follicular cells secret a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1989,161:851-858.
10，张近宝，刘维永，晏培松，等.增生细胞核抗原、α平滑肌肌动蛋白在风湿性心脏病乳头肌中的表达及意义.中华医学杂志，1998，78：337-339., http://www.100md.com
任崇雷 刘维永 张近宝 李文芳
摘 要 目的 了解风湿性心脏病(风心病)心肌中生长因子表达的特点，探讨生长因子与风心病心肌纤维化的关系。方法 风心病病人30例，其中二尖瓣狭窄(MS)为主16例，二尖瓣关闭不全(MR)为主14例，术中取左室乳头肌，成年及胎儿正常乳头肌各5例为对照，Masson染色检测心肌胶原；免疫组化方法观察转化生长因子β1(TGFβ1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)在心肌中的表达，均用图像分析仪定量分析。结果 结果 TGFβ1、bFGF在风心病心肌细胞中阳性表达增强，表达强度与心肌纤维化面积呈正相关(P<0.05)；bFGF在MR组的表达(52±11) Od/μm2强于MS组(39±12) Od/μm2；VEGF和bFGF还在心肌血管内皮细胞中表达。结论 细胞生长因子TGFβ1、bFGF均在风心病心肌纤维化形成中起作用，bFGF可能参与了风心病心肌细胞肥大过程，VEGF和bFGF还可能通过刺激新生血管的生成而参与风心病心肌重构，因此调控此类生长因子，可能为逆转风心病心肌纤维化展示了新思路。
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关键词：风湿性心脏病；生长物质；心肌；纤维变性
本实验以临床风湿性心脏病(风心病)病人为研究对象，术中取左室乳头肌，用免疫组织化学方法检测转化生长因子β1(TGFβ1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)在风心病心肌中的表达，了解其分布特点及规律，探讨生长因子在风心病胶原代谢及心肌纤维化形成中的作用及意义，从分子水平阐明风心病胶原增生的发生和调控机制，为预防和逆转风心病心肌胶原增生提供理论依据及新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料：病变组标本(30例)选自我院确诊为风心病行二尖瓣替换术的左室乳头肌，除外合并主动脉瓣病变或冠心病者，其中男11例，女19例，年龄23～54岁，心功能Ⅲ级23例，Ⅳ级7例，病史1～30年。术前常规行心脏彩色多普勒检查和心功能检测。按瓣口面积和返流程度分为二尖瓣狭窄为主组(MS组)16例(瓣口面积<1.3 cm2，返流量<3 ml)；二尖瓣关闭不全为主组(MR组)14例(瓣口面积>1.5 cm2，返流量>6 ml)。对照组5例为成年尸检标本，取自意外死亡成年正常左室乳头肌；另5例对照组为胎儿尸检标本，取自3～7月龄死胎左室乳头肌。免疫组织化学染色所用兔抗人TGF-β1、bFGF、VEGF多克隆抗体(1∶50)为美国Santa Cruz公司产品，兔SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法：病变组标本在手术中取材，成年及胎儿尸检标本均在死后半小时内取材，40 ml/L多聚甲醛固定4～6 h，常规石蜡包埋，连续切片厚4 μm，分别做Masson及免疫组织化学染色。免疫组织化学染色经常规脱蜡至水，双氧水封闭内源性过氧化物酶，羊血清封闭，一抗孵育4 ℃过夜，生物素化的羊抗兔二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液各孵育30 min，DAB显色，苏木精衬染，封片，镜下观察。同时设有PBS阴性对照和抗流行性出血热病毒抗体替代对照。
1.3 统计学处理：将Masson及免疫组化染色切片在显微镜下随机选取5个视野，输入自动图像分析仪，定量检测心肌纤维化面积、细胞阳性反应光密度值。所有数据以均数±标准差表示，用第四军医大学SPLM统计软件分析，组间比较用方差分析或t检验，部分参数间采用线性相关分析，P<0.05为检验显著水平。
2 结 果
2.1 生长因子在心肌中的表达：TGFβ1、bFGF及VEGF均弥漫表达于风心病心肌细胞质，bFGF、VEGF还在血管内皮细胞质表达(图1)；正常成人心肌组织中三种因子均表达弱阳性或阴性(图2)，胎儿心肌表达阳性但不如风心病心肌中强(图3)。图像分析的半定量结果亦显示，风心病心肌中TGFβ1、bFGF及VEGF含量均较正常对照组明显增高(P<0.01)，而与胎儿组接近(P>0.05)(见表1，图4)。统计结果显示，实验组中MR组较MS组bFGF的表达更高(P<0.05)。
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图1 风心病乳头肌中三种生长因子表达情况(免疫组化染色,棕黄色为阳性表达信号,3.3×40)
a:TGFβ1 b:bFGF1 c:VEGF
图2 成年正常乳头肌中三种生长因子表达情况(免疫组化染色,棕黄色为阳性表达信号,3.3×40)
a:TGFβ1 b:bFGF1 c:VEGF
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图3 胎儿正常乳头肌中三种生长因子表达情况(免疫组化染色,棕黄色为阳性表达信号,3.3×40)
a:TGFβ1 b:bFGF1 c:VEGF
2.2 生长因子与心肌纤维化的关系：将实验组TGFβ1、bFGF及VEGF的半定量值与纤维化面积进行相关分析，发现TGFβ1、bFGF的表达程度与心肌纤维化面积均呈正相关，即随心肌纤维化面积的增加，TGFβ1(r＝0.817 4，P<0.001)、bFGF(r＝0.514 9，P<0.05)表达增强，而VEGF的表达与心肌纤维化面积相关不显著(r＝0.208 6，P>0.05)。
表1 TGFβ1、bFGF及VEGF在各组心肌中的表达(X±s)
, 百拇医药 Od/μm2
项目
对照组
实验组
成人(5例)
胎儿(5例)
MS(16例)
MR(14例)
TGFβ1
7±4
35±6
45±16*
, 百拇医药
43±13*
bFGF
5±3
33±4
39±12*
52±11*Δ
VEGF
6±4
36±5
31±6*
32±6*
, 百拇医药 注：与成人组比P<0.01；Δ与MS组比P<0.05
图4 TGFβ1、bFGF及VEGF在各组心肌中的表达
3 讨 论
TGFβ1是一种多功能的蛋白质，是TGFβ家族中最重要的一个成员。体内外实验研究[1-3]表明，TGFβ1能增加胶原为主的间质蛋白质的合成，在器官纤维化形成过程中起作用。国内有研究[4]报道TGFβ1在风心病瓣膜纤维化中的作用，在风心病心肌纤维化中的作用尚未见报道。本研究用免疫组织化学技术检测发现，TGFβ1在风心病心肌表达增强，表达强度与心肌纤维化面积呈正相关，表明TGFβ1参与了风心病心肌纤维化的形成过程。研究结果还显示TGFβ1主要分布在心肌细胞中，提示TGFβ1可能是由心肌细胞合成、分泌的。我实验室还发现风心病心肌纤维化时心肌间质成纤维细胞和心肌细胞均参与了胶原的合成[5]，因此TGFβ1可能既通过旁分泌调节成纤维细胞对胶原的合成，又通过自分泌调控方式影响心肌细胞的胶原合成。因此设法抑制TGFβ1的激活、释放或拮抗其对胶原合成的上调作用，有可能为临床防治风心病心肌纤维化提供新的手段。
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bFGF是一种对中胚层来源的细胞有强烈促增生和分化作用的细胞生长因子，可促进血管内皮细胞的生长而在血管生成中起作用[6]。本研究显示，bFGF在风心病心肌中表达增强，表达强度与心肌纤维化面积呈正相关，且主要定位于心肌细胞质中，和TGFβ1相似。说明bFGF和TGFβ1在风心病心肌胶原增生中协同起上调作用。Chua等[7]在心脏成纤维细胞的培养中发现，单用bFGF，可刺激胶原酶的分泌，使胶原生成减少；而与TGFβ1合用，则抑制胶原酶的分泌，胶原合成增多；并认为其不同的作用与细胞因子网络有关。并提示若从细胞因子的作用方面寻求防治心肌纤维化的方法，要注意细胞因子网络间的相互作用。另外，研究结果还显示，二尖瓣关闭不全组中bFGF表达较二尖瓣狭窄组更强。bFGF还可能在二尖瓣关闭不全组的心肌细胞肥大发病过程中起作用。这与特发性心肌病中的发现相吻合[8]。
VEGF是近年来发现的一种高度特异的、强烈的血管内皮细胞促分裂因子和血管生成因子，它能促使生理性及病理性的血管生成[9]，与bFGF在血管生成中的作用相似。本研究还发现，VEGF在风心病心肌细胞中表达增强，除在心肌细胞表达外，还和bFGF一样发现在血管内皮细胞亦有阳性表达。VEGF和bFGF均可能通过刺激新生血管的生成而参与了风心病心肌重构过程。
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在此前的相关研究中我们还发现风心病肥大的心肌细胞有向胎儿心肌细胞表型转化的征象[10]。本研究中，我们也对风心病组和成人对照组及胎儿对照组细胞生长因子的表达做了对比，发现以上三种生长因子在成年对照组表达均较弱，而在风心病及胎儿组表达相似，均明显增强。虽然还不能就此得出是生长因子使风心病心肌细胞发生了表型转化的结论，但生长因子的激活、释放可能是引起风心病心肌细胞表型转化的因素之一。
根据上述细胞生长因子在风心病心肌纤维化过程中的作用机制，调控此类因子的表达，可能为逆转风湿性心肌胶原增生展示新思路。
(本文图1～3见插页图第7页)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870790)
任崇雷(710032 西安，第四军医大学西京医院心血管外科)
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刘维永(710032 西安，第四军医大学西京医院心血管外科)
张近宝(710032 西安，第四军医大学西京医院心血管外科)
李文芳(解放军466医院心胸外科)
参考文献
1，Czaja MJ,Weiner FR,Flanders KC,et al.In vitro and in vivo association of transforming growth factor β1 with hepatic fibrosis.J Cell Biol,1989,108:2477-2482.
2，Broekelmann TJ,Limper AH,Colby TV,et al.Transforming gro-wth factor β1 is present at sites of extracellular matrix gene expression in human pulmonary fibrosis.Proc Natl Acad Sci USA,1991,14:269-273.
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3，Li TM,Brooks G.Differential protein expression and subcellular distribution of transforming growth factor β1，β2 and β3 in cardiomyocytes during pressure over-load-induced hypertrophy.J Mol Cell Cardiol,1997,29:2213.
4，杨军民，张宝仁，谢毅，等.风湿性心脏瓣膜胶原及转化生长因子β1改变的初步研究.中华心血管病杂志，1997，25：103-105.
5，樊宏，刘维永，晏培松，等.风湿性心脏病二尖瓣和心肌间质病理组织学及免疫组化观察.中华医学杂志，1996，76：183-186.
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7，Chua C,Chua BHL, Zhao ZY,et al.Effect of growth factors on collagen metabolism in cultured human heart fibroblasts.Connect Tissue Res,1991,26:2771-2810.
8，Tomita Y,Kusama Y,Seino Y,et al.Increased accumulation of fibroblast growth factor in left ventricular myocytes of patients with idiopathic cardiomyopathy.Am Heart J,1997,134:778-779.
9，Ferrara N,Henzel WJ.Pituitary follicular cells secret a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1989,161:851-858.
10，张近宝，刘维永，晏培松，等.增生细胞核抗原、α平滑肌肌动蛋白在风湿性心脏病乳头肌中的表达及意义.中华医学杂志，1998，78：337-339., http://www.100md.com