急性弥漫性轴索损伤超微结构及血脑屏障改变的实验研究
急性弥漫性轴索损伤超微结构及血脑屏障改变的实验研究
王晓峰 李拴德 毛小林 杨喜民
摘 要 目的 研究大鼠脑弥漫性轴索损伤后血脑屏障及超微结构在不同时间点的变化情况。 方法 利用角加速度旋转模具制作大鼠急性弥漫性轴索损伤模型，在透射电镜下观察硝酸镧颗粒的分布情况和超微形态的改变。 结果 大鼠弥漫性轴索损伤后30 min血脑屏障通透性发生改变，24 h通透性增加达到高峰，72 h略有下降。超微结构以72 h损害最为严重。 结论 大鼠急性弥漫性轴索损伤后血脑屏障通透性增加是造成脑水肿的主要原因之一。超微结构的改变以广泛细胞肿胀、轴索溶解、断裂、回缩球形成为主要特征。
关键词：血脑屏障；显微镜检查，电子；弥漫性轴索损伤
弥漫性轴索损伤(Diffuse axonel injury， DAI)是一种原发性脑损伤，也是闭合性颅脑损伤的严重类型之一。以其较高死亡率和致残率而引起临床工作者的广泛关注，已成为目前神经外科研究的热点之一。目前报道多以临床为主，笔者从基础方面探讨了DAI后血脑屏障(BBB)和超微结构的变化情况。
, http://www.100md.com
材料与方法
1. 实验动物和分组：雄性Wistar大鼠40只，体重250±20 g，随机分为正常对照组，伤后30 min、2， 24， 72 h实验组。
2. 动物模型建立：用质量浓度为10 g/L的戍巴比妥钠(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，固定于贺晓生等[1]设计的角加速度、剪应力旋转装置上，使其头颅在2 ms旋转90°,惯性驱导下作非线性角加速度运动，脑冠状面产生与长轴垂直的剪应力导致DAI。
3. 透射电镜观察：按设计时间点开胸，用等渗盐水和含有硝酸镧颗粒的多聚甲醛和二甲砷酸钠混合灌注液进行心脏快速灌注，开颅取灰白质交界及脑干处组织，混合固定液及饿酸前后固定，行漂洗、脱水、包埋，电子染色后切成厚度为50 nm的超薄切片在JEM-2000EX透射电镜下观察血脑屏障改变。轴索结构标本用等渗盐水和多聚甲醛分别灌注，固定、漂洗、脱水、包埋方法相同，但不进行电子染色。
, 百拇医药
结果
1. 血脑屏障改变：正常对照组电镜下观察见大小为10 nm的硝酸镧颗粒不能透过BBB，镧颗粒均匀附着在毛细血管内壁，内皮细胞紧密联接无开放，未见到吞饮小泡。在伤后30 min组即发现有少量硝酸镧颗粒通过BBB 入脑，部分紧密联接开放，2 h呈进行性增加。这一现象在24 h达到高峰，镧颗粒通透入脑，分布范围广，且远离毛细血管。72 h组略有下降。
2. 超微结构变化：正常组轴索排列整齐，轴突膜结构清楚，周期内线、致密线分布规整，轴浆饱满，神经元形态正常，胞膜完整，胞质分布均匀，细胞器形态、数量正常。损伤后神经元多表现为广泛水肿，损害以白质为主，早期轴索膜增厚、肿胀，膜的三层结构模糊不清，轴浆轻度空泡化，线粒体肿胀。在24 h发展为轴索溶解、分叉、断裂和轻度增生，特征性表现为伤后72 h回缩球(ARB)形成。
讨论
, 百拇医药 急性弥漫性轴索损伤是弥漫性脑损伤的主要类型，占重型颅脑损伤的28%～42%[2，3]，1982年被Adams等[4]正式命名。DAI指头部主要在角加速度状态下旋转产生的剪应力致脑的中轴及其邻近结构损伤。由于脑组织的不易屈性很小，头部角加速度运动时，脑组织易受剪力作用发生应变，使神经轴索和血管折曲损伤，其死亡率较高，预后极差。近年来随着影像学的发展，DAI已被部分神经外科工作者已作为诊断名词[5]。病理报告显示，损伤主要发生在脑干、胼胝体、基底节等轴索聚集区。
笔者以Wistar大鼠制作DAI损伤模型，利用硝酸镧颗粒的通透特性，采用心脏快速灌注的方法，在透射电镜下观察到急性DAI后30 min即有镧颗粒通过BBB入脑，BBB改变为通道样改变，在24 h达到高峰，72 h略有下降，但下降程度较低。说明DAI后BBB通透性增加是脑水肿发生的主要原因，出现早，且持续时间长，而且急性DAI使BBB的形态结构破坏严重，是此类疾病预后差的主要因素之一。
, 百拇医药
笔者在透射电镜下观察发现DAI 后不同时期神经细胞及轴索的超微形态变化，神经细胞主要表现为广泛细胞水肿、溶解、坏死的过程，而轴索的变化具有特征性的改变，最初的改变为排列混乱、扭曲、肿胀，逐渐发展为轴索膜溶解断裂，轴浆溢出后，出现增生、包绕、形成ARB，轴索断裂是逐渐形成的，由于早期轴浆没有溢出，故在损伤早期不能观察到ARB 的出现。因此，DAI并不意味外伤后立刻造成轴索解剖学上横断性损伤，而是在剪应力作用后轴索膜功能障碍，轴浆运输受阻，轴浆蓄积，引起轴索肿胀、弯曲、最后断裂形成回缩球。故轴索广泛性损伤，治疗不及时或不正确，出现严重继发损伤或并发症是其死亡率高和预后差的主要原因。
作者单位：王晓峰(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
李拴德(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
毛小林(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
, 百拇医药
杨喜民(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
参考文献
1，贺晓生，易声禹，章翔，等.脑弥漫性轴索损伤致伤装置的研制和应用.第四军医大学学报，1998，19:87-89.
2，Adams JH, Doyle D, Ford I, et al. Diffuse axonal injury in head injury: definition,diagnosis and grading. Histopathol,1989,15:49-59.
3，Bennett MO, Brien DP, Phillips JP, et al. Clinicopathologic observations in 100 consecutive patients with fatal head injury admitted to a neurosurgical unit. Ir Med J,1995,88:60-69.
4，Adams JH, Gennarelli TA,Maxwell WL. Diffuse axonal injury in non-missile head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry,1991，54:481-483.
5，Servadei P, Vergoni G, Pasini A, et al. Diffuse axonal injury in brain stem iocalization: report of a case in a mild injured patient. J Neurosurg Sci, 1994,38:384-388., 百拇医药
王晓峰 李拴德 毛小林 杨喜民
摘 要 目的 研究大鼠脑弥漫性轴索损伤后血脑屏障及超微结构在不同时间点的变化情况。 方法 利用角加速度旋转模具制作大鼠急性弥漫性轴索损伤模型，在透射电镜下观察硝酸镧颗粒的分布情况和超微形态的改变。 结果 大鼠弥漫性轴索损伤后30 min血脑屏障通透性发生改变，24 h通透性增加达到高峰，72 h略有下降。超微结构以72 h损害最为严重。 结论 大鼠急性弥漫性轴索损伤后血脑屏障通透性增加是造成脑水肿的主要原因之一。超微结构的改变以广泛细胞肿胀、轴索溶解、断裂、回缩球形成为主要特征。
关键词：血脑屏障；显微镜检查，电子；弥漫性轴索损伤
弥漫性轴索损伤(Diffuse axonel injury， DAI)是一种原发性脑损伤，也是闭合性颅脑损伤的严重类型之一。以其较高死亡率和致残率而引起临床工作者的广泛关注，已成为目前神经外科研究的热点之一。目前报道多以临床为主，笔者从基础方面探讨了DAI后血脑屏障(BBB)和超微结构的变化情况。
, http://www.100md.com
材料与方法
1. 实验动物和分组：雄性Wistar大鼠40只，体重250±20 g，随机分为正常对照组，伤后30 min、2， 24， 72 h实验组。
2. 动物模型建立：用质量浓度为10 g/L的戍巴比妥钠(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，固定于贺晓生等[1]设计的角加速度、剪应力旋转装置上，使其头颅在2 ms旋转90°,惯性驱导下作非线性角加速度运动，脑冠状面产生与长轴垂直的剪应力导致DAI。
3. 透射电镜观察：按设计时间点开胸，用等渗盐水和含有硝酸镧颗粒的多聚甲醛和二甲砷酸钠混合灌注液进行心脏快速灌注，开颅取灰白质交界及脑干处组织，混合固定液及饿酸前后固定，行漂洗、脱水、包埋，电子染色后切成厚度为50 nm的超薄切片在JEM-2000EX透射电镜下观察血脑屏障改变。轴索结构标本用等渗盐水和多聚甲醛分别灌注，固定、漂洗、脱水、包埋方法相同，但不进行电子染色。
, 百拇医药
结果
1. 血脑屏障改变：正常对照组电镜下观察见大小为10 nm的硝酸镧颗粒不能透过BBB，镧颗粒均匀附着在毛细血管内壁，内皮细胞紧密联接无开放，未见到吞饮小泡。在伤后30 min组即发现有少量硝酸镧颗粒通过BBB 入脑，部分紧密联接开放，2 h呈进行性增加。这一现象在24 h达到高峰，镧颗粒通透入脑，分布范围广，且远离毛细血管。72 h组略有下降。
2. 超微结构变化：正常组轴索排列整齐，轴突膜结构清楚，周期内线、致密线分布规整，轴浆饱满，神经元形态正常，胞膜完整，胞质分布均匀，细胞器形态、数量正常。损伤后神经元多表现为广泛水肿，损害以白质为主，早期轴索膜增厚、肿胀，膜的三层结构模糊不清，轴浆轻度空泡化，线粒体肿胀。在24 h发展为轴索溶解、分叉、断裂和轻度增生，特征性表现为伤后72 h回缩球(ARB)形成。
讨论
, 百拇医药 急性弥漫性轴索损伤是弥漫性脑损伤的主要类型，占重型颅脑损伤的28%～42%[2，3]，1982年被Adams等[4]正式命名。DAI指头部主要在角加速度状态下旋转产生的剪应力致脑的中轴及其邻近结构损伤。由于脑组织的不易屈性很小，头部角加速度运动时，脑组织易受剪力作用发生应变，使神经轴索和血管折曲损伤，其死亡率较高，预后极差。近年来随着影像学的发展，DAI已被部分神经外科工作者已作为诊断名词[5]。病理报告显示，损伤主要发生在脑干、胼胝体、基底节等轴索聚集区。
笔者以Wistar大鼠制作DAI损伤模型，利用硝酸镧颗粒的通透特性，采用心脏快速灌注的方法，在透射电镜下观察到急性DAI后30 min即有镧颗粒通过BBB入脑，BBB改变为通道样改变，在24 h达到高峰，72 h略有下降，但下降程度较低。说明DAI后BBB通透性增加是脑水肿发生的主要原因，出现早，且持续时间长，而且急性DAI使BBB的形态结构破坏严重，是此类疾病预后差的主要因素之一。
, 百拇医药
笔者在透射电镜下观察发现DAI 后不同时期神经细胞及轴索的超微形态变化，神经细胞主要表现为广泛细胞水肿、溶解、坏死的过程，而轴索的变化具有特征性的改变，最初的改变为排列混乱、扭曲、肿胀，逐渐发展为轴索膜溶解断裂，轴浆溢出后，出现增生、包绕、形成ARB，轴索断裂是逐渐形成的，由于早期轴浆没有溢出，故在损伤早期不能观察到ARB 的出现。因此，DAI并不意味外伤后立刻造成轴索解剖学上横断性损伤，而是在剪应力作用后轴索膜功能障碍，轴浆运输受阻，轴浆蓄积，引起轴索肿胀、弯曲、最后断裂形成回缩球。故轴索广泛性损伤，治疗不及时或不正确，出现严重继发损伤或并发症是其死亡率高和预后差的主要原因。
作者单位：王晓峰(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
李拴德(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
毛小林(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
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杨喜民(721004 宝鸡，解放军第三医院神经外科)
参考文献
1，贺晓生，易声禹，章翔，等.脑弥漫性轴索损伤致伤装置的研制和应用.第四军医大学学报，1998，19:87-89.
2，Adams JH, Doyle D, Ford I, et al. Diffuse axonal injury in head injury: definition,diagnosis and grading. Histopathol,1989,15:49-59.
3，Bennett MO, Brien DP, Phillips JP, et al. Clinicopathologic observations in 100 consecutive patients with fatal head injury admitted to a neurosurgical unit. Ir Med J,1995,88:60-69.
4，Adams JH, Gennarelli TA,Maxwell WL. Diffuse axonal injury in non-missile head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry,1991，54:481-483.
5，Servadei P, Vergoni G, Pasini A, et al. Diffuse axonal injury in brain stem iocalization: report of a case in a mild injured patient. J Neurosurg Sci, 1994,38:384-388., 百拇医药