激素替代治疗对去卵巢大鼠动脉的雌激素受体表达的影响

http://www.100md.com 《中华老年医学杂志》 2000年第5期

     激素替代治疗对去卵巢大鼠动脉的雌激素受体表达的影响

    阮云军 吴赛珠 孟素荣 周可祥 翁心植 朱小虎 彭健 郭志刚

    摘 要 目的 研究雌、孕激素替代治疗时去卵巢大鼠动脉壁雌激素受体(ER)的表达。 方法 将40只成年雌性大鼠随机分为4组：假手术对照组、去卵巢组、去卵巢+雌激素治疗组、去卵巢+雌孕激素治疗组。给予正常饮食，2个月后处死大鼠。用放免法检测血清中雌二醇和孕酮浓度，用放射配体结合分析法检测大鼠主动脉ER的含量。 结果 (1)正常雌性成年大鼠(假手术对照组)主动脉中存在ER，解离常数(Kd)为(3.0±0. 7)×10^-9，最大结合容量(Bmax)为(37.4±7.9) pmol/g蛋白；(2)去卵巢组大鼠 动脉ER的Bmax〔(10.4±5.9)pmol/g蛋白〕显著低于假手术组(P<0.01)；(3)去卵巢+雌激素 治疗组与去卵巢+雌孕激素治疗组动脉ER的Bmax差别无显著性〔(分别为(40.7±7.5)和(35.1±4.5) pm ol/g蛋白〕，二者都显著高于去卵巢组；各组间Kd值差别无显著性。 结论 去卵巢2个月后大鼠主动脉的ER表达显著减少，补充雌激素或补充雌、孕激素能使去卵巢大鼠主动脉ER的含量维持在正常水平，这可能是雌激素对绝经后妇女心血管保护作用的机制之一。

    关键词：受体，雌激素；激素替代疗法；动脉粥样硬化

    雌激素替代治疗(ERT)能降低绝经后妇女动脉粥样硬化和冠心病的发病率^〔1〕，这种保护作用的具体机制尚未完全明确，可能涉及血脂效应、受体效应、及钙离子拮抗效应等多因素的参与^〔2，3〕。许多研究已表明,ERT能降低血脂和低密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比值(LDL/HDL)，维持绝经后妇女正常的血脂水平，从而发挥心血管保护作用，但ERT对绝经后心血管壁ER表达有何影响尚未明确。我们于1998年12月至1999年6月以去卵巢雌性大鼠模拟绝经，用放射配体结合分析技术观察雌、孕激素替代治疗时主动脉上的ER表达，并探讨其意义。

    材料与方法

    一、主要试剂与设备

    (2，4，6，7)³H-雌二醇(NEN)放射性活度为222×10⁶ Bq/mmol(New England Nuclear产品)；苯甲酸雌二醇、黄体酮(上海第九制药厂产品)；17β-雌二醇、葡聚糖T₇₀(美国Sigma产品)；低温超速离心机；Beckman LS-6500液体闪烁计数仪，雌二醇放免试剂盒和孕酮放免试剂盒(意大利Serozyme产品)。

    二、动物分组

    将40只(300±25)g雌性成年SD大鼠平均分为4组，每组10只。(1)去卵巢组：大鼠用3%戊巴比妥钠(0.1ml/100 g)腹腔注射麻醉，无菌条件下，在脊柱两侧2 cm肋弓下1cm拔除长毛，取背部切口开腹，在Y型的子宫末端可见粉红色绿豆大小的卵巢，结扎切除双侧卵巢后，关腹。(2)假手术对照组：只切开腹膜，不切除卵巢。(3)去卵巢+雌激素治疗组(雌激素组)：卵巢切除术第10天起给予肌注苯甲酸雌二醇(5 μg/次)，隔天1次，共注射30次。(4)去卵巢+雌孕激素治疗组(雌孕激素组)：同(3)组，只是同时肌注黄体酮(1 mg/次)，隔天1次，共注射30次。正常饮食饲养2个月后断头处死大鼠，收集5 ml动脉血，1500 r/min离心20 min，取血清置-20℃冰箱，在2周内用放免法检测雌二醇和孕酮浓度；并从主动脉根部至肾动脉分支处分离主动脉，称重，用生理盐水清洗后立即置于液氮中，存入-70℃冰箱，在2周内检测受体水平。

    三、方法

    放射配体结合技术检测ER。用多点饱和法测ER与³H-雌二醇、17β-雌二醇结合的饱和浓度，Scatchard作图计算平均解离常数(Kd)和最大结合容量(Bmax)。将所制备的细胞悬液按1∶10的比例用TEGM缓冲液匀浆，取浆液，于4℃、800 r/min离心20 min。取上清，于4℃、105000 r/min离心60 min。上清液即为待测胞浆溶液，待测定蛋白浓度。取200 μl胞浆溶液，加入不同浓度(0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 nmol/L)的³H-雌二醇，非特异管加入500倍浓度的17β-雌二醇，4℃温育18 h。加入200 μl葡聚糖包被活性炭液(含0.5%活性炭粉，0.05%葡聚糖T₇₀),4℃温育15 min，于4℃、1 500 r/min离心15 min。将上清液加入甲苯闪烁液中用液体闪烁仪直接计数(dpm)。总结合数减非特异结合数为特异结合数，数据用Scatchard方法处理^〔4〕。

    四、统计学处理

    数据用X±s表达，用t检验、χ²检验和方差分析进行组间显著性检验。

    结 果

    一、各组大鼠血清雌二醇和孕酮浓度

    见表1。去卵巢组的血清雌二醇和孕酮浓度显著低于假手术组，补充雌激素或雌、孕激素后血清雌二醇浓度显著高于去卵巢组。雌激素组的血清孕酮水平与去卵巢组差别无显著性，雌孕激素组的血清孕酮水平显著高于去卵巢组。

    表1 各组大鼠血清雌二醇、孕酮浓度(X±s,ng/L)

    组别

    鼠数

    (只)

    雌二醇浓度

    孕酮浓度

    假手术组

    10

    1006.7±87.8^△

    18.3±11.4^△

    去卵巢组

    10

    180.9±35.6^*

    2.5±2.4^*

    雌激素组

    10

    632.3±137.1^*△

    2.8±2.2^*

    雌孕激素组

    10

    694.4±128.4^*△

    14.2±6.0^△

    注：与假手术组比较，^P<0.01；与去卵巢组比较，^△P<0.01

    二、各组大鼠主动脉中所表达的ER的Bmax及受体的Kd值

    见表2。去卵巢组主动脉中雌激素受体的Bmax显著低于假手术组，雌激素或雌孕激素组之间主动脉中ER的Bmax无差别，二组均显著高于去卵巢组；各组Kd值差别无显著性。

    表2 各组动脉壁雌激素受体的Bmax、Kd比较(X±s)

    组别

    鼠数

    (只)

    Bmax(pmol/g蛋白)

    Kd(×10^-9)

    假手术组

    10

    37.4±7.9

    3.0±0.7

    去卵巢组

    10

    10.4±5.9^*

    2.0±1.4

    雌激素组

    10

    40.7±7.5^△

    2.7±0.8

    雌孕激素组

    10

    35.1±4.5^△

    3.4±1.2

    注：与假手术组相比，^P<0.01；与去卵巢组相比，^△P<0.01讨 论

    长期以来，对雌激素心血管保护机制的探讨主要集中于雌激素对血脂及血管壁细胞的直接作用的研究上，而近年ER的作用作为一个新的热点已引起重视，目前采用分子生物学技术已在心血管系统中检测到ER及其mRNA^〔5-7〕。众多的基础实验证实雌激素的许多心血管保护机制均由血管壁的ER介导，如抑制血管平滑肌细胞增殖、激活L-精氨酸-一氧化氮途径促使血管内皮合成一氧化氮^〔8，9〕、促进血管内皮损伤修复等。ER是将雌激素上述信号转化为细胞内化学反应的枢纽，心血管系统中ER的质量和数量异常可能与一些心血管疾病的发生有着直接的关系，因此探讨心血管系统中ER的变化规律可能提供有价值的研究线索。

    Losordo等^〔10〕用免疫组化法对绝经前死于冠心病和非心性死亡、冠状动脉(冠脉)正常的妇女(各12例)进行ER研究，发现83.3%的正常冠脉ER阳性,而83.3%的粥样硬化动脉ER阴性。表明绝经前妇女冠脉上的ER对防止粥样硬化有保护作用。我们采用双侧卵巢切除的大鼠模拟绝经模型，卵巢切除后血清雌二醇浓度显著降低，反映了人工绝经后的状态。补充雌激素或雌、孕激素后血清雌二醇浓度略低于生理水平，显著高于卵巢切除大鼠，可以模拟绝经后的雌激素替代疗法。我们的实验证实在正常雌性大鼠主动脉中含有ER，受体具有饱和性、高亲和力和一定甾体特异结合特点；卵巢切除2个月后雌性大鼠动脉中ER的含量与卵巢切除前相比显著减少；而对卵巢切除大鼠补充适量雌激素能使心血管壁ER维持在去卵巢前水平，加用适量孕激素并不影响ER的表达。各组Kd值未见差异说明各组受体功能无明显差别。提示绝经后血管壁ER含量减少可能是导致绝经后女性冠心病发病率迅速上升的重要机制之一。

    近年来雌激素替代治疗已逐步推广，对绝经后女性的心血管保护作用已获得认可，但机制尚未完全阐明。已明确ERT能使女性的血脂维持在正常的水平。本研究发现ERT时动脉壁ER能维持在正常水准，提示ERT可能经ER途径使雌激素对心血管系统的保护作用持续存在。由于长期补充雌激素有增加患乳腺癌和子宫内膜癌的危险，目前临床上采用雌、孕激素联合替代治疗取代传统的雌激素替代治疗方案，使因单纯使用雌激素替代治疗而造成的副作用大为减少^〔11〕。但孕激素对雌激素的作用具负面效应，加用孕激素是否会减弱雌激素的心血管保护作用需进行临床观察和基础研究。我们的研究发现给予适量的雌孕激素联合替代治疗时，动脉壁ER的表达与单用雌激素无明显差别，这表明加用适量的孕激素不影响雌激素替代治疗时动脉壁ER的表达。

    由于绝经后体内雌激素浓度的变化与女性冠心病发病率关系的研究已经获得了肯定的结果，明确ERT时动脉壁中ER表达情况的意义在于人们可试图从ER这一角度挖掘出雌激素替代治疗的新方案。进一步的研究将从血管壁中ER质的异常以及ER的激活途径探索ER与动脉粥样硬化的关系。

    基金项目：国家自然科学基金(39600169)；广东省自然科学基金(950845)；广东省 “五个一”科教兴医工程重点科研项目

    作者单位：阮云军(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    吴赛珠(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    孟素荣(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    周可祥(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    朱小虎(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    彭健(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    郭志刚(510515 广州市, 第一军医大学附属南方医院心内科)

    翁心植(首都医科大学附属红十字朝阳医院)

    参考文献

    1，Peterson LR. Estrogen replacement therapy and coronary artery disease. Curr Opin Cardiol，1998，13：223-231.

    2，Pelzer T, Shamim A, Neyses L, et al. Estrogen effects in the heart. Mol Cell Biochem，1996，160-161：307-313.

    3，冯力，张远慧，吴赛珠，等. 雌激素对卵巢切除雌兔血管内膜损伤后 血小板聚集与血管平滑肌增殖的影响. 中华老年医学杂志，1998，17：293-296.

    4，曹泽毅，主编. 激素受体及其临床应用. 北京：北京医科大学 中国协 和医科大学联合出版社, 1993.12.

    5，Grohe C, Kahlert S, Lobbert K，et al. Cardiac myocytes and fi broblasts contain functional estrogen receptor. FEBS Lett, 1997，416：107-112.

    6，Kim-Schulze S. Expression of an estrogen receptor by human coronary a rtery and umbilical endothelial cells. Circulation，1996，94：1402-1408.

    7，Venkov CD, Rankin AB,Vaughan DE，et al. Identification of aut hentic estrogen r eceoptor in cultured endothelial cells. Circulation，1996，94:727-733.

    8，Goetz RM, Morano I, Calovini T，et al. Increased expresion of endothelial cons titutive nitric oxide synthase in rat aorta during pregnancy. Biophys Res Commu n， 1994， 205：905-910.

    9，Weiner CP, Lizasoain I, Baylis SA，et al. Induction of calciu m dependent nitri c oxide synthases by sex hormons. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：5212.

    10，Losordo DW, Kearney M, Kim EA, et al.Variable expression of the estro gen receptor in normal and atherosclerotic coronary arteries of premenopausal women.Circulat ion， 1994，89：1501-1510.

    11，梁万宁，吴赛珠，刘伊丽，等. 雌激素对绝经后妇女冠心病治疗作用的观察. 中华内科杂志， 1998，37：525-528.

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/Dir/2001/03/01/50/51/63.htm