G蛋白在哮喘豚鼠肺组织中的表达变化
G蛋白在哮喘豚鼠肺组织中的表达变化
曹国强 杨肇亨 熊仁平 刘霞 李力 周元国
关键词：G蛋白；哮喘；豚鼠 G蛋白是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的重要蛋白质，G蛋白的水平及其活性变化调节着绝大多数的生理、生化、免疫反应以及与其相关基因表达[1]。我们的实验旨在通过观察哮喘豚鼠肺组织G蛋白含量变化及机制，为深入了解哮喘发病的分子机制，进而从分子水平治疗哮喘提供实验及理论基础。
材料与方法 雄性豚鼠15只(本校实验动物中心提供)，体重300～450 g， 随机分为正常对照组、致敏组、哮喘组，每组5只。哮喘组和致敏组分别用100 mg卵蛋白皮下及腹腔内注射致敏，哮喘组动物致敏后，分别于第9、10、13、14及15 d重复激发，致敏组用生理盐水激发。正常对照组用生理盐水致敏，其余同哮喘组。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。动物诱发哮喘后即刻活杀。干冰速冻后置于-70℃冰箱备用。
, 百拇医药
Western Blot杂交分析：参照文献[2]方法改进后进行。将冷冻组织置于4℃ 预冷的含0.4 mmol/L 甲苯黄酰氟(PMSF，美国Sigma公司)，1 mmol/L 1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline,美国Sigma公司)，1 mmol/L碘乙酰胺(瑞士Fluka公司)和1 mmol/L抑胃肽A(pepstatin A,美国Sigma公司)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中，匀浆制备膜蛋白，置-70℃储存备用。电泳用11%SDS-聚丙烯酰胺电泳，按每一样品25～50 μg分别上4块胶，1块用于染色确定上样量的一致性，另3块分别用电转移的方式转至醋酸纤维素膜上。将膜用5%的脱脂奶粉封闭后，分别与抗Gsα(按滴度1∶1 200稀释，以下相同)，Goα(1∶1 000)、Giα(1∶1 200)和Gqα(1∶1 200)抗体(均为美国NEN公司产品)反应1 h，洗去抗体后将膜置于1∶8 000的辣根过氧化物酶标记的IgG (英国Amersham公司)中反应1 h，PBS液充分洗涤后，用增强型化学发光(ECL)显影药盒(英国Amersham公司)显影，X线片记录影像。用DUMAS图像分析系统对X线胶片进行定量分析。结果用测得目标带的积分吸光度表示，然后按占对照组的百分比进行统计。
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统计学处理：实验结果用X±s表示，P<0.05为差异有显著性。
结果 本组实验用多克隆抗G蛋白抗体能有效地检出相应的目标带。交叉反应少而弱，而用增强型化学发光法检测辣根过氧化物酶标记的二抗，具有灵敏度高、耗时短、背景干净操作及要求相对简单的特点。比较四种G蛋白亚型的杂交结果，可以看出肺组织中Goα为单一带，位于39 000，因为含量很低，检出不稳定，定量困难。Giα、Gqα则比较稳定，二者均为一条带，分子量分别为41 000和42 000。Gsα可见三条清晰带，分子量分别为42 000、45 000和52 000，豚鼠以42 000带为主。致敏组豚鼠肺膜组织α亚基未见显著改变。哮喘豚鼠肺膜组织G sα水平也未发现显著变化[为对照组的(101±8)%，P>0.05)]，而Giα、Gqα水平均较正常对照组显著提高[分别为对照组的(126±14)%及(122±18)%，P<0.01，P<0.05]。
, http://www.100md.com
讨论 G蛋白是近年来在生物细胞膜上发现的一组与三磷酸腺苷(GTP)相结合的蛋白质，其主要功能是将激素或神经递质信息由细胞外表面的受体传递至细胞内的效应器，如腺苷酸环化酶等。本组研究观察了Goα、Gqα、Giα及Gsα，发现Goα在肺组织含量虽低但仍可检测到，Gqα 和Giα均为一条带，Gsα有三条带，与文献报道的结果相类似[3，4]，说明检出的结果是可靠的。本组实验发现，Gqα及在哮喘豚鼠肺膜组织中的含量显著增加，而Gsα的含量无明显变化，该结果与文献报道一致[3]。
研究证实，Gqα蛋白亚基藕联于血栓烷A2(TXA2)、血小板激活因子(PAF)、内皮素(ET)、缓激肽、组胺等众多的受体，Giα也是PAF、ET等众多受体与效应器藕联的通道。众所周知，上述多种炎症介质的表达变化在哮喘的发生与发展中有着重要的作用，而Gqα及Giα的表达增加还会改变其与受体和效应器的藕联效率，进而改变气道对上述介质的反应能力。因此我们认为，Gqα和Giα的高表达可能在哮喘的发病中占有重要的地位。如能在早期抑制或降低以传递有害信号为主的G蛋白如Gqα和Giα等，将可能减轻有害物质造成的损害，而在后期则可阻止进一步恶化，使机体得到恢复。
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作者单位：曹国强(400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院呼吸科)
杨肇亨(400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院呼吸科)
熊仁平(分子生物学实验室)
刘霞(分子生物学实验室)
李力(分子生物学实验室)
周元国(分子生物学实验室)
参考文献
[1]Raymond JR. Multiple mechanisms of receptors-G protein signaling. Am J Physiol，1995，269:141-158.
, 百拇医药
[2]Harlow E, Lane D. Antibodies: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory，1988.471-504.
[3]Lee JY, Uchida Y, Sakamoto T, et al. Alternation of G protien levels in antigen-challenged guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther， 1994，271：1713-1720.
[4]Emala CW, Yang J， Hirshean CA, et al. G protein subunits in lung cells. Life Sci ，1994，55:593-602., http://www.100md.com
曹国强 杨肇亨 熊仁平 刘霞 李力 周元国
关键词：G蛋白；哮喘；豚鼠 G蛋白是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的重要蛋白质，G蛋白的水平及其活性变化调节着绝大多数的生理、生化、免疫反应以及与其相关基因表达[1]。我们的实验旨在通过观察哮喘豚鼠肺组织G蛋白含量变化及机制，为深入了解哮喘发病的分子机制，进而从分子水平治疗哮喘提供实验及理论基础。
材料与方法 雄性豚鼠15只(本校实验动物中心提供)，体重300～450 g， 随机分为正常对照组、致敏组、哮喘组，每组5只。哮喘组和致敏组分别用100 mg卵蛋白皮下及腹腔内注射致敏，哮喘组动物致敏后，分别于第9、10、13、14及15 d重复激发，致敏组用生理盐水激发。正常对照组用生理盐水致敏，其余同哮喘组。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。动物诱发哮喘后即刻活杀。干冰速冻后置于-70℃冰箱备用。
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Western Blot杂交分析：参照文献[2]方法改进后进行。将冷冻组织置于4℃ 预冷的含0.4 mmol/L 甲苯黄酰氟(PMSF，美国Sigma公司)，1 mmol/L 1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline,美国Sigma公司)，1 mmol/L碘乙酰胺(瑞士Fluka公司)和1 mmol/L抑胃肽A(pepstatin A,美国Sigma公司)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中，匀浆制备膜蛋白，置-70℃储存备用。电泳用11%SDS-聚丙烯酰胺电泳，按每一样品25～50 μg分别上4块胶，1块用于染色确定上样量的一致性，另3块分别用电转移的方式转至醋酸纤维素膜上。将膜用5%的脱脂奶粉封闭后，分别与抗Gsα(按滴度1∶1 200稀释，以下相同)，Goα(1∶1 000)、Giα(1∶1 200)和Gqα(1∶1 200)抗体(均为美国NEN公司产品)反应1 h，洗去抗体后将膜置于1∶8 000的辣根过氧化物酶标记的IgG (英国Amersham公司)中反应1 h，PBS液充分洗涤后，用增强型化学发光(ECL)显影药盒(英国Amersham公司)显影，X线片记录影像。用DUMAS图像分析系统对X线胶片进行定量分析。结果用测得目标带的积分吸光度表示，然后按占对照组的百分比进行统计。
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统计学处理：实验结果用X±s表示，P<0.05为差异有显著性。
结果 本组实验用多克隆抗G蛋白抗体能有效地检出相应的目标带。交叉反应少而弱，而用增强型化学发光法检测辣根过氧化物酶标记的二抗，具有灵敏度高、耗时短、背景干净操作及要求相对简单的特点。比较四种G蛋白亚型的杂交结果，可以看出肺组织中Goα为单一带，位于39 000，因为含量很低，检出不稳定，定量困难。Giα、Gqα则比较稳定，二者均为一条带，分子量分别为41 000和42 000。Gsα可见三条清晰带，分子量分别为42 000、45 000和52 000，豚鼠以42 000带为主。致敏组豚鼠肺膜组织α亚基未见显著改变。哮喘豚鼠肺膜组织G sα水平也未发现显著变化[为对照组的(101±8)%，P>0.05)]，而Giα、Gqα水平均较正常对照组显著提高[分别为对照组的(126±14)%及(122±18)%，P<0.01，P<0.05]。
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讨论 G蛋白是近年来在生物细胞膜上发现的一组与三磷酸腺苷(GTP)相结合的蛋白质，其主要功能是将激素或神经递质信息由细胞外表面的受体传递至细胞内的效应器，如腺苷酸环化酶等。本组研究观察了Goα、Gqα、Giα及Gsα，发现Goα在肺组织含量虽低但仍可检测到，Gqα 和Giα均为一条带，Gsα有三条带，与文献报道的结果相类似[3，4]，说明检出的结果是可靠的。本组实验发现，Gqα及在哮喘豚鼠肺膜组织中的含量显著增加，而Gsα的含量无明显变化，该结果与文献报道一致[3]。
研究证实，Gqα蛋白亚基藕联于血栓烷A2(TXA2)、血小板激活因子(PAF)、内皮素(ET)、缓激肽、组胺等众多的受体，Giα也是PAF、ET等众多受体与效应器藕联的通道。众所周知，上述多种炎症介质的表达变化在哮喘的发生与发展中有着重要的作用，而Gqα及Giα的表达增加还会改变其与受体和效应器的藕联效率，进而改变气道对上述介质的反应能力。因此我们认为，Gqα和Giα的高表达可能在哮喘的发病中占有重要的地位。如能在早期抑制或降低以传递有害信号为主的G蛋白如Gqα和Giα等，将可能减轻有害物质造成的损害，而在后期则可阻止进一步恶化，使机体得到恢复。
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作者单位：曹国强(400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院呼吸科)
杨肇亨(400042 重庆，第三军医大学附属大坪医院呼吸科)
熊仁平(分子生物学实验室)
刘霞(分子生物学实验室)
李力(分子生物学实验室)
周元国(分子生物学实验室)
参考文献
[1]Raymond JR. Multiple mechanisms of receptors-G protein signaling. Am J Physiol，1995，269:141-158.
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[2]Harlow E, Lane D. Antibodies: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory，1988.471-504.
[3]Lee JY, Uchida Y, Sakamoto T, et al. Alternation of G protien levels in antigen-challenged guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther， 1994，271：1713-1720.
[4]Emala CW, Yang J， Hirshean CA, et al. G protein subunits in lung cells. Life Sci ，1994，55:593-602., http://www.100md.com