绝望行为模型大鼠脑内fos蛋白免疫阳性神经元的分布
绝望行为模型大鼠脑内fos蛋白免疫阳性神经元的分布
郑泰吉 崔尚允 李光昭 韩东日 金昌洙 孟凡强
摘 要 目的 探讨抑郁症的神经元结构及发病机制。方法 采用不同强度强迫游泳应激造成绝望行为(BD组)模型和单纯强迫游泳模型(对照组)大鼠(Wistar 系雄性，体重160～180 g)各10只，在其端脑、间脑、中脑和脑桥切片上各做抗fos蛋白免疫组化染色，40倍光镜下观察和计数各部位内fos蛋白免疫阳性(FLI)神经元及其数目，并进行两组之间的比较。结果 BD组与对照组40倍光镜下FLI神经元数目比较，前额内侧皮质 [BD组(49.4±3.7)个,对照组(18.9±4.8)个,P<0.01]、隔外侧核[BD组(41.6±3.2)个,对照组(11.4±3.0)个,P<0.01]、下丘脑室旁核[BD组(20.8±4.4)个,对照组(6.9±2.0)个,P<0.05]、下丘脑外侧区[BD组(12.4±1.6)个,对照组0个,P<0.01]、中脑中央灰质[BD组(46.3±5.2)个,对照组(20.2±4.3)个,P<0.01]、中脑网状结构[BD组(6.5±1.2)个，对照组0个,P<0.01]、中缝背核[BD组(4.8±0.4)个,对照组0个,P<0.01] 多于对照组；额皮质V层、中脑网状结构和中缝背核内见到胞核深染、胞浆浅染的FLI神经元胞体。结论 抑郁症的发病可能与脑内犒赏系统的强烈而持续的兴奋引起神经元内Ca2+过载而导致神经元变性有关。
, 百拇医药
关键词：抑郁症；神经变性；行为障碍；原癌基因蛋白质c-fos类
利用fos蛋白抗体的免疫组化法是一种反映神经功能通路的新方法，常被用于神经科学的研究，在抑郁症研究中应用较少。我们在绝望行为(BD)模型大鼠脑上应用该法观察了fos蛋白免疫阳性(FLI)神经元的分布情况，并以单纯强迫游泳(SFS)模型大鼠做为对照组，找出了该神经元的分布在两组内存在差异的部位，旨在探讨抑郁症的神经元结构及发病机制。
材料和方法
一、材料
动物模型：采用体重160～180 g的Wistar系雄性大鼠30只(延边大学医学院实验动物科提供)，先在安静、温暖(25℃)、避免强光的环境内饲养5天。将动物随机分为2组，经受BD第1，2次试验(以下分别简称第1次试验、第2次试验)的为实验组(n=20)，只经受第2次试验的为对照组(n=10)。
, 百拇医药
二、方法
1. BD试验：按Porsolt 等[1]的方法进行。在高42 cm、底面直径20 cm的圆柱形透明玻璃缸内倒入25 ℃的自来水使水位达到20 cm，将动物放入水缸内使其游泳15 min(第1次试验)，并用以1/100 s为单位的秒表(HITACHI牌)测定其在游泳的前5 min内所呈现的不动状态时间总和。24 h后，在同样条件下又使动物游泳5 min(第2次试验)，测定此期间内的不动状态时间总和。第2次试验中的不动状态时间总和长于第1次试验的前5 min内者定为BD组。
2.免疫组化法：BD试验结束后第2小时，用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉动物，经左心室和升主动脉先以生理盐水冲洗，继而用pH 7.4、含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐液(PBS)灌注固定。取脑，脑块放入灌注液进行后固定4 h，再放入含30%蔗糖的PBS至下沉。振动切片(4 ℃)，片厚40 μm, 从嗅结节至三叉神经根平面连续横切。切片分为3套，第1套切片按抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶(ABC)法进行抗fos蛋白免疫组化染色：以下每一步骤结束后均用PBS洗3次，每次15 min。第1套切片放入：(1)0.3%H2O2孵育10 min；(2)兔抗c-fos(fos蛋白抗体，Oncogene Science公司，1∶500)、0.3% triton X -100、 正常羊和牛血清中孵育24 h(4 ℃)；(3)生物素标记的羊抗兔IgG(VECTOR公司，1∶200)中孵育1 h(室温)；(4)ABC(VECTOR公司，1∶500)中孵育1 h(室温)；(5)在含有0.02%二氨基联苯胺、0.04% NiCl2和0.005%H2O2的NaH2PO4 溶液中成色5～7 min(室温)。第2套切片用1%中性红染色。第3套切片做免疫组化对照试验：用0.01 mol的PBS代替第1级抗体，按ABC法进行。40倍光镜下观察和计数各部位内FLI神经元及其数目。
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3.统计学处理:两组不动状态时间的比较，用t′检验；FLI神经元数目的比较按部位(参照Paxinos 等编制的1986年版大鼠脑图谱，)用单因素方差分析。
结果
一、两组的不动状态时间
20只实验组动物中，10只(占50%)因在第2次试验中的不动状态时间短于或等于第1次试验而未用于本研究。其余的BD组与对照组的不动状态时间分别为(222.2±11.5)s和(62.1 ±1. 7)s,差异有非常显著性(t′=44.87，t′0.01=3.25,t′>t′0.01，P<0.01)。
二、BD组与对照组FLI神经元分布比较(表1)
FLI产物经NiCl2强化后呈黑色、颗粒状，光镜下显示其主要分布于胞核，胞核染成黑色的细胞即为FLI神经元。核的染色有深、中、浅等3种。对照组FLI神经元分布于额、顶、梨状、扣带皮质，隔外侧核，尾壳核，屏状核，杏仁核，海马，丘脑室旁核，下丘脑室旁核、室周核、视上核，中脑中央灰质，蓝斑等部位；染色深度以中、浅两种为主。BD组与对照组比较，40倍光镜下FLI神经元数目在前额内侧皮质、隔外侧核、下丘脑室旁核、下丘脑外侧区、中脑中央灰质、中脑网状结构、中缝背核BD组明显增加(表1)，染色深度以深、中2种为主。
, 百拇医药
讨论
将BD模型动物在水中的不动状态时间总和作为其行为学观察指标，而这种不动状态时间特异性地只被各种抗抑郁疗法所缩短[1]，故本模型适用于抗抑郁药筛选试验和抑郁症的生物学研究。我们认为，本模型具有制作方法简便、效度和信度较高等特点。
fos蛋白是即刻早期表达基因c-fos编码产生的一种核蛋白，具有当机体受到外界刺激时在神经系统内迅速出现的特性。因此，利用fos蛋白抗体的免疫组化法有助于在细胞水平探讨各种精神障碍的发病机制[2，3]。Bang 等[4]报道(观察部位限于端脑和间脑)，与对照组比较，BD组前额内侧皮质、隔外侧核、下丘脑室旁核等部位内的FLI神经元数目增加，这与我们的部分结果一致。但本结果还显示，除端脑和间脑外，BD组下丘脑外侧区、中脑中央灰质、中脑网状结构、中缝背核内FLI神经元数目也增加。上述的BD组脑内FLI神经元数目增加的这些部位，均是与情感活动关系密切的部位，它们均发出纤维加入到前脑内侧束，从而参加脑内犒赏系统(reward system)的构成[5，6]。在本结果中，BD组额皮质V层、中脑网状结构和中缝背核内可见到胞核深染、胞浆浅染的FLI神经元胞体，提示这些神经元有变性性改变。其机制可能与应激所致神经元强烈而持续的兴奋引起细胞内Ca2+过载有关。据文献报道，在强制步行模型、慢性应激模型等其它抑郁症动物模型中，也已找到犒赏系统内一些神经元结构受损的证据或线索[7，8]。犒赏系统受损会导致快乐体验能力缺失，而后者是抑郁症的核心症状。
, 百拇医药
表1 BD组与对照组的40倍光镜下FLI神经元数目比较(X±s,个)
组别
鼠数
前额
隔核
下丘脑
中脑
侧皮质(a)
外侧核(a)
室旁核(b)
外侧区(b)
中央灰质(c)
, 百拇医药
网状结构(c)
中缝背核(d)
BD
10
49.4±3.7
41.6±3.2
20.8±4.4
12.4±1.6
46.3±5.2
6.5±1.2
4.8±0.4
对照
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10
18.9±4.8
11.4±3.0
6.9±2.0
0
20.2±4.3
0
0
F值
15.20
25.79
4.55
34.22
, 百拇医药
8.39
20.11
72.00
P值
<0.01
<0.01
<0.05
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：a.距耳间线9.29～9.48 mm、前囟0.20～0.48 mm层面； b.距耳间线7.70～7.60 mm、前囟-1.30～-1.40 mm 层面； c.距耳间线1.36～1.20 mm、 前囟-7.64～-7.80 mm层面； d.距耳间线-0.68～-0.80 mm、前囟-9.68～-9.80 mm层面
, http://www.100md.com
综上所述，我们认为就神经功能通路水平而言，抑郁症的发病可能与脑内犒赏系统强烈、持续的兴奋引起此系统神经元内Ca2+过载而导致神经元变性有关。由于样本数有限，进一步的探讨有待今后继续研究。
志谢 中国医科大学脑研究所何为维教授
作者单位：郑泰吉(133000 吉林省延边脑科医院精神科)
崔尚允(延边大学医学院神经解剖研究室)
李光昭(延边大学医学院神经解剖研究室)
韩东日(延边大学医学院神经解剖研究室)
金昌洙(延边大学医学院神经解剖研究室)
孟凡强(北京医科大学精神卫生研究所)
, http://www.100md.com
参考文献
1，Porsolt RD, Anton A, Blavet N, et al. Behavioral despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol,1978, 47:379-391.
2，Senba E, Ueyama T. Stress-induced expression of immediate early genes in the brain and peripheral organs of the rat. Neuroscience Research, 1997, 29:183-207.
3，Sagar SM, Sharp FR, Curran T. Expression of fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science，1988,240:1328-1331.
, http://www.100md.com
4，Bang SK, Kim WS. Increased fos expression by “behavioral despair” in rat brain. J Korean Neuropsychiatr Assoc, 1995,34:1949-1955.
5，西野仁雄.视床下部の外部神经结合とその动き.神研进步,1987, 31:418-430.
6，唐竹吾，主编.中枢神经系统解剖学.上海：上海科学技术出版社, 1986.281-284.
7，Kitayama I,Wang P,Yamashita K,et al. Noradrenergic function in depression model rats. In： Nomura J, ed. Neurobiology of depression and related disorders. New York: Acad Press, 1998. 236-247.
8，王雪琦,路长林,李丽云,等.大鼠抑郁模型的脑磁共振成像研究. 中华精神科杂志,1999,32:12-14., 百拇医药
郑泰吉 崔尚允 李光昭 韩东日 金昌洙 孟凡强
摘 要 目的 探讨抑郁症的神经元结构及发病机制。方法 采用不同强度强迫游泳应激造成绝望行为(BD组)模型和单纯强迫游泳模型(对照组)大鼠(Wistar 系雄性，体重160～180 g)各10只，在其端脑、间脑、中脑和脑桥切片上各做抗fos蛋白免疫组化染色，40倍光镜下观察和计数各部位内fos蛋白免疫阳性(FLI)神经元及其数目，并进行两组之间的比较。结果 BD组与对照组40倍光镜下FLI神经元数目比较，前额内侧皮质 [BD组(49.4±3.7)个,对照组(18.9±4.8)个,P<0.01]、隔外侧核[BD组(41.6±3.2)个,对照组(11.4±3.0)个,P<0.01]、下丘脑室旁核[BD组(20.8±4.4)个,对照组(6.9±2.0)个,P<0.05]、下丘脑外侧区[BD组(12.4±1.6)个,对照组0个,P<0.01]、中脑中央灰质[BD组(46.3±5.2)个,对照组(20.2±4.3)个,P<0.01]、中脑网状结构[BD组(6.5±1.2)个，对照组0个,P<0.01]、中缝背核[BD组(4.8±0.4)个,对照组0个,P<0.01] 多于对照组；额皮质V层、中脑网状结构和中缝背核内见到胞核深染、胞浆浅染的FLI神经元胞体。结论 抑郁症的发病可能与脑内犒赏系统的强烈而持续的兴奋引起神经元内Ca2+过载而导致神经元变性有关。
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关键词：抑郁症；神经变性；行为障碍；原癌基因蛋白质c-fos类
利用fos蛋白抗体的免疫组化法是一种反映神经功能通路的新方法，常被用于神经科学的研究，在抑郁症研究中应用较少。我们在绝望行为(BD)模型大鼠脑上应用该法观察了fos蛋白免疫阳性(FLI)神经元的分布情况，并以单纯强迫游泳(SFS)模型大鼠做为对照组，找出了该神经元的分布在两组内存在差异的部位，旨在探讨抑郁症的神经元结构及发病机制。
材料和方法
一、材料
动物模型：采用体重160～180 g的Wistar系雄性大鼠30只(延边大学医学院实验动物科提供)，先在安静、温暖(25℃)、避免强光的环境内饲养5天。将动物随机分为2组，经受BD第1，2次试验(以下分别简称第1次试验、第2次试验)的为实验组(n=20)，只经受第2次试验的为对照组(n=10)。
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二、方法
1. BD试验：按Porsolt 等[1]的方法进行。在高42 cm、底面直径20 cm的圆柱形透明玻璃缸内倒入25 ℃的自来水使水位达到20 cm，将动物放入水缸内使其游泳15 min(第1次试验)，并用以1/100 s为单位的秒表(HITACHI牌)测定其在游泳的前5 min内所呈现的不动状态时间总和。24 h后，在同样条件下又使动物游泳5 min(第2次试验)，测定此期间内的不动状态时间总和。第2次试验中的不动状态时间总和长于第1次试验的前5 min内者定为BD组。
2.免疫组化法：BD试验结束后第2小时，用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉动物，经左心室和升主动脉先以生理盐水冲洗，继而用pH 7.4、含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐液(PBS)灌注固定。取脑，脑块放入灌注液进行后固定4 h，再放入含30%蔗糖的PBS至下沉。振动切片(4 ℃)，片厚40 μm, 从嗅结节至三叉神经根平面连续横切。切片分为3套，第1套切片按抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶(ABC)法进行抗fos蛋白免疫组化染色：以下每一步骤结束后均用PBS洗3次，每次15 min。第1套切片放入：(1)0.3%H2O2孵育10 min；(2)兔抗c-fos(fos蛋白抗体，Oncogene Science公司，1∶500)、0.3% triton X -100、 正常羊和牛血清中孵育24 h(4 ℃)；(3)生物素标记的羊抗兔IgG(VECTOR公司，1∶200)中孵育1 h(室温)；(4)ABC(VECTOR公司，1∶500)中孵育1 h(室温)；(5)在含有0.02%二氨基联苯胺、0.04% NiCl2和0.005%H2O2的NaH2PO4 溶液中成色5～7 min(室温)。第2套切片用1%中性红染色。第3套切片做免疫组化对照试验：用0.01 mol的PBS代替第1级抗体，按ABC法进行。40倍光镜下观察和计数各部位内FLI神经元及其数目。
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3.统计学处理:两组不动状态时间的比较，用t′检验；FLI神经元数目的比较按部位(参照Paxinos 等编制的1986年版大鼠脑图谱，)用单因素方差分析。
结果
一、两组的不动状态时间
20只实验组动物中，10只(占50%)因在第2次试验中的不动状态时间短于或等于第1次试验而未用于本研究。其余的BD组与对照组的不动状态时间分别为(222.2±11.5)s和(62.1 ±1. 7)s,差异有非常显著性(t′=44.87，t′0.01=3.25,t′>t′0.01，P<0.01)。
二、BD组与对照组FLI神经元分布比较(表1)
FLI产物经NiCl2强化后呈黑色、颗粒状，光镜下显示其主要分布于胞核，胞核染成黑色的细胞即为FLI神经元。核的染色有深、中、浅等3种。对照组FLI神经元分布于额、顶、梨状、扣带皮质，隔外侧核，尾壳核，屏状核，杏仁核，海马，丘脑室旁核，下丘脑室旁核、室周核、视上核，中脑中央灰质，蓝斑等部位；染色深度以中、浅两种为主。BD组与对照组比较，40倍光镜下FLI神经元数目在前额内侧皮质、隔外侧核、下丘脑室旁核、下丘脑外侧区、中脑中央灰质、中脑网状结构、中缝背核BD组明显增加(表1)，染色深度以深、中2种为主。
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讨论
将BD模型动物在水中的不动状态时间总和作为其行为学观察指标，而这种不动状态时间特异性地只被各种抗抑郁疗法所缩短[1]，故本模型适用于抗抑郁药筛选试验和抑郁症的生物学研究。我们认为，本模型具有制作方法简便、效度和信度较高等特点。
fos蛋白是即刻早期表达基因c-fos编码产生的一种核蛋白，具有当机体受到外界刺激时在神经系统内迅速出现的特性。因此，利用fos蛋白抗体的免疫组化法有助于在细胞水平探讨各种精神障碍的发病机制[2，3]。Bang 等[4]报道(观察部位限于端脑和间脑)，与对照组比较，BD组前额内侧皮质、隔外侧核、下丘脑室旁核等部位内的FLI神经元数目增加，这与我们的部分结果一致。但本结果还显示，除端脑和间脑外，BD组下丘脑外侧区、中脑中央灰质、中脑网状结构、中缝背核内FLI神经元数目也增加。上述的BD组脑内FLI神经元数目增加的这些部位，均是与情感活动关系密切的部位，它们均发出纤维加入到前脑内侧束，从而参加脑内犒赏系统(reward system)的构成[5，6]。在本结果中，BD组额皮质V层、中脑网状结构和中缝背核内可见到胞核深染、胞浆浅染的FLI神经元胞体，提示这些神经元有变性性改变。其机制可能与应激所致神经元强烈而持续的兴奋引起细胞内Ca2+过载有关。据文献报道，在强制步行模型、慢性应激模型等其它抑郁症动物模型中，也已找到犒赏系统内一些神经元结构受损的证据或线索[7，8]。犒赏系统受损会导致快乐体验能力缺失，而后者是抑郁症的核心症状。
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表1 BD组与对照组的40倍光镜下FLI神经元数目比较(X±s,个)
组别
鼠数
前额
隔核
下丘脑
中脑
侧皮质(a)
外侧核(a)
室旁核(b)
外侧区(b)
中央灰质(c)
, 百拇医药
网状结构(c)
中缝背核(d)
BD
10
49.4±3.7
41.6±3.2
20.8±4.4
12.4±1.6
46.3±5.2
6.5±1.2
4.8±0.4
对照
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10
18.9±4.8
11.4±3.0
6.9±2.0
0
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F值
15.20
25.79
4.55
34.22
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8.39
20.11
72.00
P值
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注：a.距耳间线9.29～9.48 mm、前囟0.20～0.48 mm层面； b.距耳间线7.70～7.60 mm、前囟-1.30～-1.40 mm 层面； c.距耳间线1.36～1.20 mm、 前囟-7.64～-7.80 mm层面； d.距耳间线-0.68～-0.80 mm、前囟-9.68～-9.80 mm层面
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综上所述，我们认为就神经功能通路水平而言，抑郁症的发病可能与脑内犒赏系统强烈、持续的兴奋引起此系统神经元内Ca2+过载而导致神经元变性有关。由于样本数有限，进一步的探讨有待今后继续研究。
志谢 中国医科大学脑研究所何为维教授
作者单位：郑泰吉(133000 吉林省延边脑科医院精神科)
崔尚允(延边大学医学院神经解剖研究室)
李光昭(延边大学医学院神经解剖研究室)
韩东日(延边大学医学院神经解剖研究室)
金昌洙(延边大学医学院神经解剖研究室)
孟凡强(北京医科大学精神卫生研究所)
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参考文献
1，Porsolt RD, Anton A, Blavet N, et al. Behavioral despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol,1978, 47:379-391.
2，Senba E, Ueyama T. Stress-induced expression of immediate early genes in the brain and peripheral organs of the rat. Neuroscience Research, 1997, 29:183-207.
3，Sagar SM, Sharp FR, Curran T. Expression of fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science，1988,240:1328-1331.
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4，Bang SK, Kim WS. Increased fos expression by “behavioral despair” in rat brain. J Korean Neuropsychiatr Assoc, 1995,34:1949-1955.
5，西野仁雄.视床下部の外部神经结合とその动き.神研进步,1987, 31:418-430.
6，唐竹吾，主编.中枢神经系统解剖学.上海：上海科学技术出版社, 1986.281-284.
7，Kitayama I,Wang P,Yamashita K,et al. Noradrenergic function in depression model rats. In： Nomura J, ed. Neurobiology of depression and related disorders. New York: Acad Press, 1998. 236-247.
8，王雪琦,路长林,李丽云,等.大鼠抑郁模型的脑磁共振成像研究. 中华精神科杂志,1999,32:12-14., 百拇医药