氦氖激光血管内照射对肿瘤浸润淋巴细胞生物活性的影响
氦氖激光血管内照射对肿瘤浸润淋巴细胞生物活性的影响
李刚 王获程 李庆平 王淑英 刘先玲 邓天伟 姜剩勇 黄玮 曾庆
摘 要 目的 研究氦氖激光血管内照射(ILIB)对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)生物活性的影响。方法 ILIB组60例恶性肿瘤患者用ILIB加生物治疗,对照组60例恶性肿瘤患者用模拟照射加生物治疗，分别测定照射前后TIL细胞增殖活性、细胞亚群(APAAP法)、细胞毒性(MTT法)与端粒酶活性(TRAP-PCR法)。结果 ILIB组治疗20 d后TIL增殖活性与对照组及治疗前相比，差异无显著性(P>0.05)；CD3、CD4、CD4/CD8明显高于治疗前及对照组(P<0.05)，而CD8差异无显著性(P>0.05)，TIL细胞毒性治疗后(41.0±6.2)%明显高于治疗前(21.1±4.0)%及对照组(25.1±3.1)%(P<0.01);TIL端粒酶活性治疗后0.061±0.001明显高于治疗前0.028±0.009及对照组0.025±0.007(P<0.05)。ILIB组缓解率53%、有效率79%，明显高于对照组缓解率28%(χ2＝7.84，P<0.01)、有效率48%(χ2＝12.17，P<0.001)。结论 ILIB引起TIL CD3、CD4、CD4/CD8、细胞毒性与端粒酶活性增加，增加肿瘤患者的免疫功能，增强TIL抗肿瘤效应，ILIB辅助生物治疗有希望进一步提高恶性肿瘤患者生存率。
, 百拇医药
关键词：激光，氦氖；肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润
肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)继淋巴因子激活性杀伤后，被认为具有更强抗肿瘤活性的免疫活性细胞[1]，应用TIL进行生物免疫治疗是治疗肿瘤的一种有效手段，努力提高免疫细胞的杀伤活性与增殖能力是肿瘤生物免疫治疗的一项重要策略[2]。氦氖激光血管内照射(ILIB)能显著改善肿瘤患者的免疫功能低下状态，其机理包括增强淋巴细胞的杀伤活性与增殖能力[3-5]，但ILIB对TIL是否具有同样的作用，目前研究甚少，我们对60例有远距离转移的恶性肿瘤患者进行ILIB治疗加生物治疗，与60例有远距离转移单用生物治疗的恶性肿瘤患者进行对照，观察TIL增殖活性、细胞亚群、细胞毒性与端粒酶活性的变化，并进行了疗效随访，为ILIB辅助肿瘤生物治疗提供科学依据。
资料和方法
, 百拇医药
120例恶性肿瘤来源于1995年10月～1999年10月的住院患者，经临床、病理及影像学检查确诊有远距离转移。随机分为ILIB组与对照组，每组60例。ILIB组，男42例，女18例；年龄15～82岁，平均(54.0±11.0)岁；头颈部恶性肿瘤20例，肾癌18例，肺癌10例，黑色素瘤5笼，乳腺癌5例，纵膈肿瘤2例。对照组，男44例，女16例；年龄20～81岁，平均(59.0±10.6)岁；头颈部恶性肿瘤18例，肾癌16例，肺癌14例，黑色素瘤4例，乳腺癌6例，纵膈肿瘤2例。两组卡氏评分≥60分，预计生存时间大于6个月。治疗前分离患者TIL，对照组用支持治疗(葡萄糖、脂肪乳、人血白蛋白或氨基酸)加模拟照射，ILIB组在与对照组支持治疗相同的基础上加用ILIB治疗，采用鹭岛公司LD480-Ⅲ型氦氖激光治疗仪，经皮穿刺后将光导纤维经套管针插入肘正中静脉1～2 cm，激光波长632.8 μm，输出功率2～3 mW，每日照射1次，每次60 min，共20次。照射期间两组均避免手术、放疗、化疗、皮质激素、光感性、影响造血系统药物及紫外线等。治疗20 d后再次分离两组患者TIL。
, 百拇医药
TIL的制备与回输：应用血液成分分离机抽取外周静脉血，离心分离血液细胞成分，同时回输红细胞和大部分血浆，留取富含白细胞的部分约200 ml，在实验室进一步应用淋巴细胞分层液分离，大约可分得(1～2)×109TIL，取治疗前及治疗20 d后的TIL行增殖活性、T细胞亚群、细胞毒性与端粒酶活性检测。取治疗20 d后的TIL以(1～2)×106/ml浓度接种各在含有IL-2 1×103U/ml，5%人“AB”血清的RPMI 1640培养液中，5%CO2，37℃孵育，3～5 d 传代1次，20 d后收集做无菌试验，洗涤后经0.5 Gy γ射线照射。于注射IL-2(10～20万U/d)第4～8 d开始回输体外扩增的TIL。
TIL细胞亚群的检测采用单克隆抗体碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP)测定CD3、CD4、CD8阳性细胞百分数(药盒由北京军事医学科学院生物制剂发展中心提供)，取分离好的单核细胞沉淀少许制成涂片，纯丙酮固定后，依次加入下列试剂：TIL亚群单抗、羊抗鼠二抗、APAAP复合物，每步反应30 min，然后加入碱性磷酸酶底物显色，苏木素复染。细胞毒性的检测采用MTT法，参照文献[6]，选择最佳效靶比10∶1进行细胞毒性试验。端粒酶提取：取治疗前及治疗20 d后的TIL(1～5)×108加入400 μl冷洗液(10 mmol/L Hepes-KOH，pH 7.5,1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl ,1 mmol/L DTT)，混匀后，0℃放置5 min，2 000 r/min 4℃离心5 min，去尽上清液；加入预冷的裂解液200 μl (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,5 mmol/L二巯基乙醇，0.5% CHAPS ，10%甘油)，混匀后，放置0℃裂解30 min，13 500 r/min 4℃离心30 min吸取上清置一新预冷管中，采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)进行蛋白质含量测定，放-80℃冰箱保存。采用TRAP-PCR法检测端粒酶活性，反应体积25 μl。加端粒酶提取物6 μg，混匀后于30℃保温30 min，90℃ 90 s灭活端粒酶,加0.1 μg CX引物(5/-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3/)，混匀后在PCR仪上进行31个循环，循环参数为90℃40 s，50℃40 s，72℃50 s，最后于72℃延长10 min，加入6 μl电泳加样缓冲液，在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，凝胶与X射线胶片置-80℃放射自显影，12 h后显示结果。同时取PCR产物5 μl与20 μl变性液混匀，在室温下作用10 min，加杂交液225 μl混匀，并取其100 μl加到酶标板的反应孔中，室温下反应2 h，洗净后加入HRP结合物，并洗净，加TMB底物显色30 min，在酶标仪上读A 450值。
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疗效评价 治疗前及治疗后每1个月全面检查，TIL回输治疗3次以上者计入疗效统计评价，6个月临床疗效随访。完全缓解(CR)：病灶完全消失；部分缓解(PR)：肿块缩小50%以上；好转(MR)：病灶减小25%，但不到50%；无效(NR)：肿块未增大或缩小不足25%或进展。统计分析：均数±标准差，t、χ2检验。
结果
生物治疗6个月后，ILIB组缓解率53%，有效率79%，明显高于对照组缓解率28%(χ2=7.84，P<0.01)，有效率48%(χ2=12.17，P<0.001)，见表1。
表1 恶性肿瘤患者TIL生物治疗结果
组别
例数
, 百拇医药
CR
PR
MR
NR
百分比(%)
CR+PR
CR+PR+MR
ILIB组
57
8
22
15
12
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53
79
对照组
58
6
10
12
30
28
48
治疗中ILIB组有2例因TIL回输时出现发热副反应而停止，1例随访失败；对照组1例中途拒绝接受，1例因TIL回输时出现发热副反应而停止。
对照组TIL加入IL-2培养5～10 d时增殖较快，培养至15 d左右细胞数可达1×109左右，平均扩增(357±164)倍，ILIB组TIL加入IL-2培养4～8 d时增殖较快，培养至15 d左右细胞数可达3×109左右，平均扩增(391±213)倍，经统计学处理，差异无显著性。ILIB组治疗20 d后与治疗前相比，CD3、CD4、CD4/CD8明显增加(P<0.05),CD8无明显改变(P>0.05)；治疗20 d后ILIB组与对照组相比，CD3(t=6.13，P<0.01),CD4显著高于对照组(t=7.28，P<0.01),CD4/CD8显著高于对照组(t=4.56，P<0.01)，CD8差异无显著性(t=0.73，P>0.05),见表2。
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细胞毒性试验ILIB组治疗前(21.1±4.0)%，治疗后(41.0±6.2)%，经统计学处理，差异有非常显著性(t=8.64，P<0.01)；对照组治疗前为(22.3±4.0)%，治疗后为(25.1±3.1)%，经统计学处理，差异无显著性(t=1.41，P>0.05)。两组端粒酶阳性者为间隔6 bp的梯形图像，端粒酶活性定性及定量检测结果见表3。表2 恶性肿瘤患者治疗前后TIL细胞亚群变化(x±s)
检测项目
ILIB组
对照组
治疗前
治疗后
t值
P值
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治疗前
治疗后
t值
P值
CD3
47±20
61±10
5.33
<0.05
43±17
45±12
0.33
>0.05
, 百拇医药
CD4
38±13
51±12
7.26
<0.05
36±12
32±11
0.52
>0.05
CD8
22±15
19±11
0.85
, http://www.100md.com
>0.05
21±13
22±17
0.79
>0.05
CD4/CD8
1.72± 0.12
2.68± 0.11
4.50
<0.05
1.71± 0.26
1.45± 0.21
, http://www.100md.com
2.81
>0.05
表3 恶性肿瘤患者TIL端粒酶活性定性及定量检测结果
检测时间
阳性率(%)
端粒酶活性
ILIB组
对照组
t值
P值
ILIB组
对照组
, 百拇医药 t值
P值
治疗前
20.00
18.33
1.41
>0.05
0.028±0.009
0.026±0.006
1.219
>0.05
治疗后
36.67
, http://www.100md.com
21.67
8.47
<0.05
0.061±0.001
0.025±0.007
2.819
<0.05
讨 论 前苏联科学院肿瘤研究中心受紫外线照射自血回输疗法的启发，进行了低能量氦氖激光照射对离体人淋巴细胞作用的研究，发现低能量氦氖激光对人周围血液的免疫学、生物化学和形态学指标均有明显作用，可作为肿瘤患者增强机体免疫力，延缓肿瘤转移和复发的免疫治疗新方法[5]。之后一系列研究发现，ILIB对淋巴细胞有明显的免疫调节作用,它可使淋巴细胞亚群发生变化，淋巴细胞转化率提高，激活补体系统，但要取决于淋巴细胞的起始状态和吸收光量子的能量，该法对免疫指标表现出调节刺激作用，原来低水平的患者照射后形成玫瑰花环的淋巴细胞数量明显增加。肿瘤患者普遍存在着免疫功能的减退,免疫监视的减弱,已有研究资料表明，肿瘤患者和健康者的免疫状态经ILIB照射后得到改善，肿瘤患者被抑制的免疫力可恢复到正常的65%～70%[5]。
, 百拇医药
本研究中，输注体外扩增的TIL治疗恶性肿瘤总缓解率40%，与总有效率63%略高于文献报道[7]。ILIB组缓解率与有效率明显高于对照组。临床疗效分析表明，加用ILIB辅助肿瘤生物治疗，直接或间接介导肿瘤消退，是一种有效的抗肿瘤生物学方法，毒副作用少而轻微。治疗前后ILIB组与对照组相比，增殖活性无明显差别，其具体机理尚不明了，可能由于高能量氦氖激光才能引起细胞增殖活性的改变,低能量氦氖激光不能引起细胞增殖活性的明显变化[8]。观察证明，ILIB可引起辅助性T淋巴细胞数量增加，各种淋巴因子产生增加，说明ILIB对TIL细胞亚群有调节作用。ILIB并可引起TIL的细胞毒性增加。
TIL是一类新型有特异性的抗肿瘤效应细胞，并能在体外大量增殖，发挥杀伤肿瘤作用，但由于TIL的凋亡与部分肿瘤细胞的免疫耐受等原因阻碍着这一技术的临床作用[9]，最新的研究发现，端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关系。端粒酶活性是细胞增殖能力的重要指标[9]。除肿瘤细胞中端粒酶高活性表达外，在正常人类生殖细胞以及造血干细胞、外周血白细胞与淋巴细胞等具有再生能力的细胞中，均可检测到不同水平的端粒酶活性。外周血淋巴细胞中，端粒酶阳性检出率随细胞数的增多而增高，当细胞数为103时，未检测出端粒酶活性；当细胞数为105，端粒酶阳性率80.6%，端粒酶阳性淋巴细胞多处于高度增殖状态[10，11]。ILIB治疗后端粒酶活性阳性率增加，端粒酶活性水平明显高于对照组。说明低能量氦氖激光刺激端粒酶活性的表达，进一步证实了Taylor的研究[12]。
, 百拇医药
生物免疫治疗是临床恶性肿瘤治疗的一个重要方面，已在一定程度上提高了患者生存率。ILIB辅助生物治疗，增强免疫功能，有希望进一步提高恶性肿瘤患者的生存率，其作用机理还需进一步研究。
作者单位：李刚(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
李庆平(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
王淑英(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
刘先玲(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
邓天伟(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
姜剩勇(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
, 百拇医药
黄玮(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
曾庆(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
王获程(华西医科大学检验中心)
参考文献
1，Rosenberg SA,Spiess PS,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infiltrating lymphocytes.Science,1986,233:1318-1322.
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5，Бopиcoвa AM,Xopoшилoвa НВ,Булгaкавa ГИ.，Дeйcтвиe низкoинтeнcивнoгo лaзepнoгo излучeния，нa иммунную cиcтeму.Tерaп Aрхив,1992,64:111-113.
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12，马凌娣，文世宏.端粒酶活性与肿瘤.国外医学临床生物化学与检验学分册，1999，20:106-108., 百拇医药
李刚 王获程 李庆平 王淑英 刘先玲 邓天伟 姜剩勇 黄玮 曾庆
摘 要 目的 研究氦氖激光血管内照射(ILIB)对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)生物活性的影响。方法 ILIB组60例恶性肿瘤患者用ILIB加生物治疗,对照组60例恶性肿瘤患者用模拟照射加生物治疗，分别测定照射前后TIL细胞增殖活性、细胞亚群(APAAP法)、细胞毒性(MTT法)与端粒酶活性(TRAP-PCR法)。结果 ILIB组治疗20 d后TIL增殖活性与对照组及治疗前相比，差异无显著性(P>0.05)；CD3、CD4、CD4/CD8明显高于治疗前及对照组(P<0.05)，而CD8差异无显著性(P>0.05)，TIL细胞毒性治疗后(41.0±6.2)%明显高于治疗前(21.1±4.0)%及对照组(25.1±3.1)%(P<0.01);TIL端粒酶活性治疗后0.061±0.001明显高于治疗前0.028±0.009及对照组0.025±0.007(P<0.05)。ILIB组缓解率53%、有效率79%，明显高于对照组缓解率28%(χ2＝7.84，P<0.01)、有效率48%(χ2＝12.17，P<0.001)。结论 ILIB引起TIL CD3、CD4、CD4/CD8、细胞毒性与端粒酶活性增加，增加肿瘤患者的免疫功能，增强TIL抗肿瘤效应，ILIB辅助生物治疗有希望进一步提高恶性肿瘤患者生存率。
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关键词：激光，氦氖；肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润
肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)继淋巴因子激活性杀伤后，被认为具有更强抗肿瘤活性的免疫活性细胞[1]，应用TIL进行生物免疫治疗是治疗肿瘤的一种有效手段，努力提高免疫细胞的杀伤活性与增殖能力是肿瘤生物免疫治疗的一项重要策略[2]。氦氖激光血管内照射(ILIB)能显著改善肿瘤患者的免疫功能低下状态，其机理包括增强淋巴细胞的杀伤活性与增殖能力[3-5]，但ILIB对TIL是否具有同样的作用，目前研究甚少，我们对60例有远距离转移的恶性肿瘤患者进行ILIB治疗加生物治疗，与60例有远距离转移单用生物治疗的恶性肿瘤患者进行对照，观察TIL增殖活性、细胞亚群、细胞毒性与端粒酶活性的变化，并进行了疗效随访，为ILIB辅助肿瘤生物治疗提供科学依据。
资料和方法
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120例恶性肿瘤来源于1995年10月～1999年10月的住院患者，经临床、病理及影像学检查确诊有远距离转移。随机分为ILIB组与对照组，每组60例。ILIB组，男42例，女18例；年龄15～82岁，平均(54.0±11.0)岁；头颈部恶性肿瘤20例，肾癌18例，肺癌10例，黑色素瘤5笼，乳腺癌5例，纵膈肿瘤2例。对照组，男44例，女16例；年龄20～81岁，平均(59.0±10.6)岁；头颈部恶性肿瘤18例，肾癌16例，肺癌14例，黑色素瘤4例，乳腺癌6例，纵膈肿瘤2例。两组卡氏评分≥60分，预计生存时间大于6个月。治疗前分离患者TIL，对照组用支持治疗(葡萄糖、脂肪乳、人血白蛋白或氨基酸)加模拟照射，ILIB组在与对照组支持治疗相同的基础上加用ILIB治疗，采用鹭岛公司LD480-Ⅲ型氦氖激光治疗仪，经皮穿刺后将光导纤维经套管针插入肘正中静脉1～2 cm，激光波长632.8 μm，输出功率2～3 mW，每日照射1次，每次60 min，共20次。照射期间两组均避免手术、放疗、化疗、皮质激素、光感性、影响造血系统药物及紫外线等。治疗20 d后再次分离两组患者TIL。
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TIL的制备与回输：应用血液成分分离机抽取外周静脉血，离心分离血液细胞成分，同时回输红细胞和大部分血浆，留取富含白细胞的部分约200 ml，在实验室进一步应用淋巴细胞分层液分离，大约可分得(1～2)×109TIL，取治疗前及治疗20 d后的TIL行增殖活性、T细胞亚群、细胞毒性与端粒酶活性检测。取治疗20 d后的TIL以(1～2)×106/ml浓度接种各在含有IL-2 1×103U/ml，5%人“AB”血清的RPMI 1640培养液中，5%CO2，37℃孵育，3～5 d 传代1次，20 d后收集做无菌试验，洗涤后经0.5 Gy γ射线照射。于注射IL-2(10～20万U/d)第4～8 d开始回输体外扩增的TIL。
TIL细胞亚群的检测采用单克隆抗体碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP)测定CD3、CD4、CD8阳性细胞百分数(药盒由北京军事医学科学院生物制剂发展中心提供)，取分离好的单核细胞沉淀少许制成涂片，纯丙酮固定后，依次加入下列试剂：TIL亚群单抗、羊抗鼠二抗、APAAP复合物，每步反应30 min，然后加入碱性磷酸酶底物显色，苏木素复染。细胞毒性的检测采用MTT法，参照文献[6]，选择最佳效靶比10∶1进行细胞毒性试验。端粒酶提取：取治疗前及治疗20 d后的TIL(1～5)×108加入400 μl冷洗液(10 mmol/L Hepes-KOH，pH 7.5,1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl ,1 mmol/L DTT)，混匀后，0℃放置5 min，2 000 r/min 4℃离心5 min，去尽上清液；加入预冷的裂解液200 μl (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,5 mmol/L二巯基乙醇，0.5% CHAPS ，10%甘油)，混匀后，放置0℃裂解30 min，13 500 r/min 4℃离心30 min吸取上清置一新预冷管中，采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)进行蛋白质含量测定，放-80℃冰箱保存。采用TRAP-PCR法检测端粒酶活性，反应体积25 μl。加端粒酶提取物6 μg，混匀后于30℃保温30 min，90℃ 90 s灭活端粒酶,加0.1 μg CX引物(5/-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3/)，混匀后在PCR仪上进行31个循环，循环参数为90℃40 s，50℃40 s，72℃50 s，最后于72℃延长10 min，加入6 μl电泳加样缓冲液，在12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，凝胶与X射线胶片置-80℃放射自显影，12 h后显示结果。同时取PCR产物5 μl与20 μl变性液混匀，在室温下作用10 min，加杂交液225 μl混匀，并取其100 μl加到酶标板的反应孔中，室温下反应2 h，洗净后加入HRP结合物，并洗净，加TMB底物显色30 min，在酶标仪上读A 450值。
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疗效评价 治疗前及治疗后每1个月全面检查，TIL回输治疗3次以上者计入疗效统计评价，6个月临床疗效随访。完全缓解(CR)：病灶完全消失；部分缓解(PR)：肿块缩小50%以上；好转(MR)：病灶减小25%，但不到50%；无效(NR)：肿块未增大或缩小不足25%或进展。统计分析：均数±标准差，t、χ2检验。
结果
生物治疗6个月后，ILIB组缓解率53%，有效率79%，明显高于对照组缓解率28%(χ2=7.84，P<0.01)，有效率48%(χ2=12.17，P<0.001)，见表1。
表1 恶性肿瘤患者TIL生物治疗结果
组别
例数
, 百拇医药
CR
PR
MR
NR
百分比(%)
CR+PR
CR+PR+MR
ILIB组
57
8
22
15
12
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53
79
对照组
58
6
10
12
30
28
48
治疗中ILIB组有2例因TIL回输时出现发热副反应而停止，1例随访失败；对照组1例中途拒绝接受，1例因TIL回输时出现发热副反应而停止。
对照组TIL加入IL-2培养5～10 d时增殖较快，培养至15 d左右细胞数可达1×109左右，平均扩增(357±164)倍，ILIB组TIL加入IL-2培养4～8 d时增殖较快，培养至15 d左右细胞数可达3×109左右，平均扩增(391±213)倍，经统计学处理，差异无显著性。ILIB组治疗20 d后与治疗前相比，CD3、CD4、CD4/CD8明显增加(P<0.05),CD8无明显改变(P>0.05)；治疗20 d后ILIB组与对照组相比，CD3(t=6.13，P<0.01),CD4显著高于对照组(t=7.28，P<0.01),CD4/CD8显著高于对照组(t=4.56，P<0.01)，CD8差异无显著性(t=0.73，P>0.05),见表2。
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细胞毒性试验ILIB组治疗前(21.1±4.0)%，治疗后(41.0±6.2)%，经统计学处理，差异有非常显著性(t=8.64，P<0.01)；对照组治疗前为(22.3±4.0)%，治疗后为(25.1±3.1)%，经统计学处理，差异无显著性(t=1.41，P>0.05)。两组端粒酶阳性者为间隔6 bp的梯形图像，端粒酶活性定性及定量检测结果见表3。表2 恶性肿瘤患者治疗前后TIL细胞亚群变化(x±s)
检测项目
ILIB组
对照组
治疗前
治疗后
t值
P值
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治疗前
治疗后
t值
P值
CD3
47±20
61±10
5.33
<0.05
43±17
45±12
0.33
>0.05
, 百拇医药
CD4
38±13
51±12
7.26
<0.05
36±12
32±11
0.52
>0.05
CD8
22±15
19±11
0.85
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>0.05
21±13
22±17
0.79
>0.05
CD4/CD8
1.72± 0.12
2.68± 0.11
4.50
<0.05
1.71± 0.26
1.45± 0.21
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2.81
>0.05
表3 恶性肿瘤患者TIL端粒酶活性定性及定量检测结果
检测时间
阳性率(%)
端粒酶活性
ILIB组
对照组
t值
P值
ILIB组
对照组
, 百拇医药 t值
P值
治疗前
20.00
18.33
1.41
>0.05
0.028±0.009
0.026±0.006
1.219
>0.05
治疗后
36.67
, http://www.100md.com
21.67
8.47
<0.05
0.061±0.001
0.025±0.007
2.819
<0.05
讨 论 前苏联科学院肿瘤研究中心受紫外线照射自血回输疗法的启发，进行了低能量氦氖激光照射对离体人淋巴细胞作用的研究，发现低能量氦氖激光对人周围血液的免疫学、生物化学和形态学指标均有明显作用，可作为肿瘤患者增强机体免疫力，延缓肿瘤转移和复发的免疫治疗新方法[5]。之后一系列研究发现，ILIB对淋巴细胞有明显的免疫调节作用,它可使淋巴细胞亚群发生变化，淋巴细胞转化率提高，激活补体系统，但要取决于淋巴细胞的起始状态和吸收光量子的能量，该法对免疫指标表现出调节刺激作用，原来低水平的患者照射后形成玫瑰花环的淋巴细胞数量明显增加。肿瘤患者普遍存在着免疫功能的减退,免疫监视的减弱,已有研究资料表明，肿瘤患者和健康者的免疫状态经ILIB照射后得到改善，肿瘤患者被抑制的免疫力可恢复到正常的65%～70%[5]。
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本研究中，输注体外扩增的TIL治疗恶性肿瘤总缓解率40%，与总有效率63%略高于文献报道[7]。ILIB组缓解率与有效率明显高于对照组。临床疗效分析表明，加用ILIB辅助肿瘤生物治疗，直接或间接介导肿瘤消退，是一种有效的抗肿瘤生物学方法，毒副作用少而轻微。治疗前后ILIB组与对照组相比，增殖活性无明显差别，其具体机理尚不明了，可能由于高能量氦氖激光才能引起细胞增殖活性的改变,低能量氦氖激光不能引起细胞增殖活性的明显变化[8]。观察证明，ILIB可引起辅助性T淋巴细胞数量增加，各种淋巴因子产生增加，说明ILIB对TIL细胞亚群有调节作用。ILIB并可引起TIL的细胞毒性增加。
TIL是一类新型有特异性的抗肿瘤效应细胞，并能在体外大量增殖，发挥杀伤肿瘤作用，但由于TIL的凋亡与部分肿瘤细胞的免疫耐受等原因阻碍着这一技术的临床作用[9]，最新的研究发现，端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关系。端粒酶活性是细胞增殖能力的重要指标[9]。除肿瘤细胞中端粒酶高活性表达外，在正常人类生殖细胞以及造血干细胞、外周血白细胞与淋巴细胞等具有再生能力的细胞中，均可检测到不同水平的端粒酶活性。外周血淋巴细胞中，端粒酶阳性检出率随细胞数的增多而增高，当细胞数为103时，未检测出端粒酶活性；当细胞数为105，端粒酶阳性率80.6%，端粒酶阳性淋巴细胞多处于高度增殖状态[10，11]。ILIB治疗后端粒酶活性阳性率增加，端粒酶活性水平明显高于对照组。说明低能量氦氖激光刺激端粒酶活性的表达，进一步证实了Taylor的研究[12]。
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生物免疫治疗是临床恶性肿瘤治疗的一个重要方面，已在一定程度上提高了患者生存率。ILIB辅助生物治疗，增强免疫功能，有希望进一步提高恶性肿瘤患者的生存率，其作用机理还需进一步研究。
作者单位：李刚(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
李庆平(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
王淑英(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
刘先玲(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
邓天伟(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
姜剩勇(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
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黄玮(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
曾庆(404000 重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院)
王获程(华西医科大学检验中心)
参考文献
1，Rosenberg SA,Spiess PS,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infiltrating lymphocytes.Science,1986,233:1318-1322.
2，Sellins KS and Cohen JJ.Cytotoxic T lymphocyte induce different types of DNA damage in target cells of different origins.J Immunol,1991,147:795-799.
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3，Tpaпeзникoв H，H,Kyпин BИ,Ивaнoв AB,и дp.Дeйcтвиe излyчeния Хeлий-Нeoнового лaзepa нa лимфoциты чeлoвeкa in vitro.Becтн AMH CCCP,1984,5:40-42.
4，高美华，王海燕，邱世翠，等.氦氖激光照射对小鼠T细胞亚群的影响.中华理疗杂志,1993,16:82-83.
5，Бopиcoвa AM,Xopoшилoвa НВ,Булгaкавa ГИ.，Дeйcтвиe низкoинтeнcивнoгo лaзepнoгo излучeния，нa иммунную cиcтeму.Tерaп Aрхив,1992,64:111-113.
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7，Topalian SL,Solomon D,Avis FP,et al. Immunotherapy of patients with advanced cancer using tumor infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2:a pilot study.J Clin Oncol, 1988,6:839-842.
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9，Topalian SL,Kasid A and Rosenberg SA.Immunoselection of a human melanoma resistant to specific lysis by autologous tumor infiltrating lymphocytes:possible mechanisms immunotherapeutic failures.J Immunol,1990,144:4487-4490.
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10，Counter CM,Gupta J,Harley CB,et al.Telomerase activity in normal leukocytes and hematologic malignancies.Blood,1995,85:2315-2320.
11，Holt SE and Shay JW.Role of telomerase in cellular proliferation and cancer.J Cell Physiol,1999,180:10-13.
12，马凌娣，文世宏.端粒酶活性与肿瘤.国外医学临床生物化学与检验学分册，1999，20:106-108., 百拇医药