蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究
蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究
毛孙忠 严哲 陈石根
摘 要 目的:建立一种高效的蚯蚓纤溶酶 (EFE) 的分离纯化技术，并研究其特性。 方法:蚯蚓经组织匀浆、缓冲液抽提与选择性热变性，再经抑制剂1，6-己二胺(HD)偶联的Sepharose 4B亲和层析，DEAE-Sepharose离子交换层析。 结果及结论:分离纯化得到具有强烈纤溶活性的酶组分(EFE-F1、2，EFE-F3)。其中EFE-F3对合成底物S-2288和Chromozym P的Km分别是0.01mmol/L和0.02mmol/L，HD的Ki为1mmol/L；该酶热稳定性强，能抗4mol/L脲。
关键词：蚯蚓纤溶酶；酶抑制剂；分离纯化
蚯蚓种类繁多，具有广泛的药用价值。在蚯蚓组织抽提液中存在高活性的纤溶酶成分， 在临床上有重要意义。目前该酶的分离纯化方法虽多，但繁复且效率不高。我们在胰蛋白酶抑制剂的研究中，发现1，6-己二胺(1，6-hexamethylendiamine，HD)对蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzymes，EFE)具有抑制作用，在此基础上用HD-Sepharose 4B亲和层析法对该酶进行了较为理想的分离纯化，同时对其动力学性质进行了研究，现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 蚯蚓：正蚯科(Lumbricidae)双胸蚓科(Bimastos)。
1.1.2 主要试剂：Sepharose 4B，DEAE-Sepharose系Pharmacia产品，HD、S-2288及Chromozym P系上海东风试剂公司产品，其他试剂均为化学纯或分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 EFE的分离纯化：将人工养殖蚯蚓收集洗净，绞碎后 置于4℃预冷的抽提液(40mmol/L，pH8.0 Tris-HCl ，含0.5mol/L NaCl)中，组织匀浆器处理后经10000×g离心10min，收集上清液迅速升温至55℃，进行选择性热变性处理1h，冷至室温后离心收集上清液，再经聚乙二醇6000浓缩成约含10%蛋白后作为上柱样品( 蛋白质浓度测定参照 Bradford法[1])。亲和层析柱制备参照张龙翔等[2]方法：将HD与溴化氰活化的Sepharose 4B混匀，轻摇4℃过夜，使其偶联整合，装入1.5cm×15cm柱中，用50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)缓冲液平衡，流速48ml/h。取样品上柱，双蒸水洗脱，流速为30ml/h。洗脱活力峰浓缩，再经DEAE-Sepharose 柱进一步纯化，以0～0.5mol/L NaCl梯度洗脱。
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1.2.2 纤溶酶(酰胺)水解活力测定：参照邵承斌等[3]方法，采用合成底物S-2288(HD-ile-Pro-Arg-PNA)和Chromozym P(cb2-Gly-Pro-Arg-PNA)，反应体系为：50μl适当稀释的样品，2.2ml 50mmol/L， pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，250μl S-2288或Chromozym P贮备液(0.2mg/ml)。25℃条件下用1cm光径比色皿，在λ405nm下记录PNA的释放速率，其摩尔消光系数Δε以1×104(mol/L×cm)-1计算；1个酰胺水解活力单位(U)定义为酶作用下每分钟水解产生的PNA数为1nmol。
1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照文献[4]进行。
2 结果
2.1 EFE分离纯化结果 HD-Sepharose 4B亲和层析图谱见图1，DEAE-Sepharose 进一步纯化图谱见图2；其中峰Ⅲ具有水解合成底物S-2288和Chromozym P的活性。可用Arg-Sepharose 4B将峰Ⅲ分为二部分，先洗脱部分含两种蛋白(合称F1、2)，后分离部分含一种蛋白(F3)。后者量虽少但活性高(见图3)，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实F3是一种成分均一的蛋白组分。
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图1 HD-Sepharose 4B亲和层析
图2 EFE的DEAE-Sepharos层析
图3 EFE的精氨酸Sepharose 4B
2.2 EFE的热稳定性 55℃选择性热变性1小时，其比活力从24.60KU/mg下降至23.47KU/mg，仅损失4.6%，可见其热稳定性强。
2.3 合成底物S-2288和Chromozym P对EFE 的敏感性 参照邵承斌等[3]方法，改变底物浓度，测定EFE-F3 的酰胺水解速率的变化，通过双倒数作图，计算两合成底物的Km，Km值分别是0.01mmol/L 和0.02mmol/L(见图4)。
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2.4 HD对EFE-F3催化活性的抑制作用 通过HD对EFE-F3作用于合成底物双倒数作图影响的分析，发现HD对这两种底物均表现为竞争性抑制，其Ki都为1mmol/L(见图5)。
图4 EFE-F3对酰胺水解活性的双倒数图
图5 HD-对EFE-F3的抑制效应
2.5 EFE对脲的抗性 EFE-F3 经4mol/L脲处理1小时，再测其酰胺水解活性，发现其比活性从35.70KU/mg下降到33.60KU/mg，活性仅损失 5.8%，可见该酶能抗蛋白变性剂脲的处理。
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3 讨论
3.1 HD对两种底物的Ki均为1mmol/L，其抑制效率不仅远高于精氨酸[3]，且仅仅针对纤溶酶中具有水解S-2288和Chromoym P的活性成分进行亲和层析，表明HD-Sepharose对纤溶酶具有很强的生物特性。这一特性将为EFE的纯化提供一种相当理想的方法。
3.2 EFE具有酰胺水解活性的组分在蛋白质含量上相对较低，但敏感性研究表明其Km值在10-2mmol/L数量级水平。这不仅在酶学理论上，在实际应用上也具有很重要的意义，有望发展成为一种崭新的溶栓药物[5]。
3.3 EFE的稳定性实验中，提示EFE对热稳定性强，能抗蛋白变性剂脲的处理，而金属离子对其的影响有待进一步探讨。
基金项目：温州医学院科技发展基金资助项目(XN980022)
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作者简介：毛孙忠(1970-)，男，浙江玉环人，讲师。
毛孙忠(温州医学院 生化教研室，浙江 温州 325027)
严哲(温州医学院 生化教研室，浙江 温州 325027)
陈石根(复旦大学 生化系，上海 200437)
参考文献
[1] 张龙翔，张庭芳，李念媛.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，1981.206-209.
[2] Bradford MM. A rapid and sensetitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.
[3] 邵承斌，杨继虞，徐敏华,等.一种测定蚯蚓纤溶酶活力的简易方法[J]. 中国生化药物杂志，1997，18 (6)：301-304.
[4] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970，227：680-683.
[5] 赵晓喻，静天玉.蚯蚓纤溶酶的成分分析[J].中国生物化学与分子生物学报，1998，14 (4)：407-411., 百拇医药
毛孙忠 严哲 陈石根
摘 要 目的:建立一种高效的蚯蚓纤溶酶 (EFE) 的分离纯化技术，并研究其特性。 方法:蚯蚓经组织匀浆、缓冲液抽提与选择性热变性，再经抑制剂1，6-己二胺(HD)偶联的Sepharose 4B亲和层析，DEAE-Sepharose离子交换层析。 结果及结论:分离纯化得到具有强烈纤溶活性的酶组分(EFE-F1、2，EFE-F3)。其中EFE-F3对合成底物S-2288和Chromozym P的Km分别是0.01mmol/L和0.02mmol/L，HD的Ki为1mmol/L；该酶热稳定性强，能抗4mol/L脲。
关键词：蚯蚓纤溶酶；酶抑制剂；分离纯化
蚯蚓种类繁多，具有广泛的药用价值。在蚯蚓组织抽提液中存在高活性的纤溶酶成分， 在临床上有重要意义。目前该酶的分离纯化方法虽多，但繁复且效率不高。我们在胰蛋白酶抑制剂的研究中，发现1，6-己二胺(1，6-hexamethylendiamine，HD)对蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzymes，EFE)具有抑制作用，在此基础上用HD-Sepharose 4B亲和层析法对该酶进行了较为理想的分离纯化，同时对其动力学性质进行了研究，现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 蚯蚓：正蚯科(Lumbricidae)双胸蚓科(Bimastos)。
1.1.2 主要试剂：Sepharose 4B，DEAE-Sepharose系Pharmacia产品，HD、S-2288及Chromozym P系上海东风试剂公司产品，其他试剂均为化学纯或分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 EFE的分离纯化：将人工养殖蚯蚓收集洗净，绞碎后 置于4℃预冷的抽提液(40mmol/L，pH8.0 Tris-HCl ，含0.5mol/L NaCl)中，组织匀浆器处理后经10000×g离心10min，收集上清液迅速升温至55℃，进行选择性热变性处理1h，冷至室温后离心收集上清液，再经聚乙二醇6000浓缩成约含10%蛋白后作为上柱样品( 蛋白质浓度测定参照 Bradford法[1])。亲和层析柱制备参照张龙翔等[2]方法：将HD与溴化氰活化的Sepharose 4B混匀，轻摇4℃过夜，使其偶联整合，装入1.5cm×15cm柱中，用50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)缓冲液平衡，流速48ml/h。取样品上柱，双蒸水洗脱，流速为30ml/h。洗脱活力峰浓缩，再经DEAE-Sepharose 柱进一步纯化，以0～0.5mol/L NaCl梯度洗脱。
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1.2.2 纤溶酶(酰胺)水解活力测定：参照邵承斌等[3]方法，采用合成底物S-2288(HD-ile-Pro-Arg-PNA)和Chromozym P(cb2-Gly-Pro-Arg-PNA)，反应体系为：50μl适当稀释的样品，2.2ml 50mmol/L， pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，250μl S-2288或Chromozym P贮备液(0.2mg/ml)。25℃条件下用1cm光径比色皿，在λ405nm下记录PNA的释放速率，其摩尔消光系数Δε以1×104(mol/L×cm)-1计算；1个酰胺水解活力单位(U)定义为酶作用下每分钟水解产生的PNA数为1nmol。
1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照文献[4]进行。
2 结果
2.1 EFE分离纯化结果 HD-Sepharose 4B亲和层析图谱见图1，DEAE-Sepharose 进一步纯化图谱见图2；其中峰Ⅲ具有水解合成底物S-2288和Chromozym P的活性。可用Arg-Sepharose 4B将峰Ⅲ分为二部分，先洗脱部分含两种蛋白(合称F1、2)，后分离部分含一种蛋白(F3)。后者量虽少但活性高(见图3)，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实F3是一种成分均一的蛋白组分。
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图1 HD-Sepharose 4B亲和层析
图2 EFE的DEAE-Sepharos层析
图3 EFE的精氨酸Sepharose 4B
2.2 EFE的热稳定性 55℃选择性热变性1小时，其比活力从24.60KU/mg下降至23.47KU/mg，仅损失4.6%，可见其热稳定性强。
2.3 合成底物S-2288和Chromozym P对EFE 的敏感性 参照邵承斌等[3]方法，改变底物浓度，测定EFE-F3 的酰胺水解速率的变化，通过双倒数作图，计算两合成底物的Km，Km值分别是0.01mmol/L 和0.02mmol/L(见图4)。
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2.4 HD对EFE-F3催化活性的抑制作用 通过HD对EFE-F3作用于合成底物双倒数作图影响的分析，发现HD对这两种底物均表现为竞争性抑制，其Ki都为1mmol/L(见图5)。
图4 EFE-F3对酰胺水解活性的双倒数图
图5 HD-对EFE-F3的抑制效应
2.5 EFE对脲的抗性 EFE-F3 经4mol/L脲处理1小时，再测其酰胺水解活性，发现其比活性从35.70KU/mg下降到33.60KU/mg，活性仅损失 5.8%，可见该酶能抗蛋白变性剂脲的处理。
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3 讨论
3.1 HD对两种底物的Ki均为1mmol/L，其抑制效率不仅远高于精氨酸[3]，且仅仅针对纤溶酶中具有水解S-2288和Chromoym P的活性成分进行亲和层析，表明HD-Sepharose对纤溶酶具有很强的生物特性。这一特性将为EFE的纯化提供一种相当理想的方法。
3.2 EFE具有酰胺水解活性的组分在蛋白质含量上相对较低，但敏感性研究表明其Km值在10-2mmol/L数量级水平。这不仅在酶学理论上，在实际应用上也具有很重要的意义，有望发展成为一种崭新的溶栓药物[5]。
3.3 EFE的稳定性实验中，提示EFE对热稳定性强，能抗蛋白变性剂脲的处理，而金属离子对其的影响有待进一步探讨。
基金项目：温州医学院科技发展基金资助项目(XN980022)
, 百拇医药
作者简介：毛孙忠(1970-)，男，浙江玉环人，讲师。
毛孙忠(温州医学院 生化教研室，浙江 温州 325027)
严哲(温州医学院 生化教研室，浙江 温州 325027)
陈石根(复旦大学 生化系，上海 200437)
参考文献
[1] 张龙翔，张庭芳，李念媛.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，1981.206-209.
[2] Bradford MM. A rapid and sensetitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.
[3] 邵承斌，杨继虞，徐敏华,等.一种测定蚯蚓纤溶酶活力的简易方法[J]. 中国生化药物杂志，1997，18 (6)：301-304.
[4] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970，227：680-683.
[5] 赵晓喻，静天玉.蚯蚓纤溶酶的成分分析[J].中国生物化学与分子生物学报，1998，14 (4)：407-411., 百拇医药