高压氧对外伤性脑水肿家兔线粒体ATP酶活性的影响
高压氧对外伤性脑水肿家兔线粒体ATP酶活性的影响
朱松君 辛克清 魏本俊 单向兰 石银菊
摘 要 目的 研究外伤性脑水肿后脑细胞线粒体ATP酶活性、丙二醛(MDA)含量在继发性脑损伤中的作用，以及高压氧治疗的机理。方法 应用家兔脑损伤模型，观察高压氧作用后不同时间脑含水量、线粒体ATP酶活性、MDA含量变化。结果 线粒体ATP酶活性在伤后4 h即开始下降，至48 h降到最低点，MDA含量伤后显著增加，随时间延长增加更加明显，MDA与脑含水量间呈正相关，ATP酶活性与脑含水量之间呈负相关，高压氧组与外伤组比较，上述指标变化均较轻。结论 脑外伤后脑细胞线粒体自由基反应增强，ATP酶活性受抑，促进脑水肿发生、发展，高压氧通过减少自由基、增强ATP酶活性减轻脑水肿。
, 百拇医药
关键词：高压氧；兔；脑损伤；脑水肿；腺苷三磷酸
本实验通过观察家兔脑损伤后脑细胞线粒体丙二醛(MDA)含量、ATP酶活性变化及高压氧(HBO)对两者的影响，探讨自由基、ATP酶在颅脑损伤、脑水肿发生发展过程中的作用及HBO治疗的机制。
材料和方法
健康家兔60只，体重1.7～3.6 kg，随机分为正常对照组6只，假手术对照组6只，单纯外伤组24只，外伤后高压氧治疗组24只。后两组用自由落体装置制成颅脑损伤模型[1]。假手术组暴露到硬膜后关颅，不致伤。HBO组动物术后观察0.5～1.0 h，置自制木箱中，将木箱置于高压氧舱内，在0.2 MPa下作用90 min，加压20 min，减压20 min,稳压50 min。脑细胞线粒体制备[2]：脑组织在匀浆介质IM1(0.25 mmol/L蔗糖、1 mmol/L EDTANa2、50 mmol/L Tris-HCI、pH7.5)中匀浆，将匀浆液以1 000 g离心10 min，取上清液在低温高速离心机上以15 000 g离心15 min，沉淀即为线粒体，移入IM2(0.25 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCI、pH7.5)中低温保存。脑含水量测定：取伤区脑组织，分析天平称重，置110℃恒温干燥器24 h至恒重，按Elliott公式计算，脑含水量＝(湿重-干重)/湿重×100%。线粒体MDA含量、ATP酶活性，分别应用南京建成生物工程研究所提供的MDA试剂盒和ATP酶试剂盒进行测定，单位分别为：纳摩尔每毫克蛋白(nmol/mg pr);微摩尔磷每毫克蛋白每小时(μmol Pi/mg pr.h-1)。蛋白含量用双缩脲法测定。超微结构观察：每组取相应部位脑组织3块，3%戊二醛、1%锇酸固定，EPON 812包埋，半薄切片定位，超薄切片，电镜观察。统计学处理：各组数据均用X±s表示，组间差异用t检验，部分数据采用直线相关分析。
, 百拇医药
结 果
脑外伤后4 h脑含水量与MDA含量明显升高，至伤后48 h仍高于正常，且随时间延长呈上升趋势(与假手术组比较P<0.01)。高压氧组脑含水量与MDA含量在各时间点均比外伤组低(P<0.01)。脑细胞线粒体Na+、K+-ATP酶、Ca2+、Mg2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性伤后4 h明显降低，与假手术组相比，分别降低了17.97%、28.40%和24.84%，以后继续降低，至伤后48 h分别降低了64.19%、72.17%和72.94%(P<0.01)。高压氧组与外伤组比较，三种酶活性均明显提高(P<0.05，表1)。直线相关分析：MDA含量与Na+、K+-ATP酶、Ca2+、Mg2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性之间均呈负相关(r分别为-0.946，-0.885，-0.883，P<0.01)；MDA与脑含水量之间呈正相关(r＝0.617，P<0.01)；Na+、K+-ATP酶、Ca2+、Mg2+-ATP酶活性与脑含水量之间呈负相关(r分别为-0.646，-0.689，P<0.01)。电镜所见：外伤组神经元胞浆水肿，线粒体高度肿胀，基质中出现许多空泡，嵴减少或断裂，可见破裂的线粒体。HBO组上述损害减轻，仅见少数神经元胞浆水肿，个别线粒体肿胀(图1～4)。
, http://www.100md.com
表1 各组家兔脑含水量、MDA、ATP酶活性(μmol Pi/mg pr.h-1,X±s，n=6)
组 别
脑含水量(%)
MDA含量(nmol/mg pr)
Na+、K+-ATP酶
Ca2+、Mg2+-ATP酶
Mg2+-ATP酶
正常对照组
78.08±0.38
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9.45±0.27
42.55±1.53
34.28±1.50
26.12±1.70
假手术组
78.30±0.68
9.53±0.22
42.06±1.24
33.06±0.60
26.09±1.99
外伤组 4 h
80.50±1.67
, 百拇医药
13.38±0.30
34.50±1.30
23.64±1.61
19.61±1.63
8 h
80.83±0.26
15.40±0.44
27.40±1.23
17.92±1.64
12.86±1.77
24 h
82.17±0.93
, http://www.100md.com
23.93±0.57
21.29±1.34
12.19±1.52
9.98±1.45
48 h
83.17±1.97
34.55±0.77
15.06±1.36
9.20±1.52
7.06±0.75
HBO组 4 h
79.42±0.67
, http://www.100md.com
11.15±0.33
39.25±1.79
28.52±2.20
23.43±1.36
8 h
79.25±0.27
12.59±0.43
33.74±1.70
22.35±2.36
17.13±1.26
24 h
79.17±0.68
, http://www.100md.com
20.48±0.55
24.41±1.32
17.90±1.55
12.19±1.60
48 h
79.92±1.46
31.22±0.86
17.43±0.94
12.50±1.13
8.16±0.91
, 百拇医药
图1 外伤组神经元肿胀，核周间隙增宽 ×8 000
图2 外伤组神经元线粒体高度肿胀，基质中出现空泡，嵴减少或断裂，个别线粒体破溃 ×2 000
图3 HBO组仅见少数神经元水肿 ×10 000
, http://www.100md.com 图4 HBO组神经元内仅见个别线粒体肿胀 ×15 000
讨 论
氧自由基半衰期短，体外检测困难，本组测定自由基引起膜脂质过氧化的终产物MDA含量间接反映自由基水平。本实验发现，脑外伤后脑细胞线粒体MDA含量显著增加，与脑含水量平行，说明其与脑水肿发生发展有关。线粒体是细胞氧化的主要场所，电子通过呼吸链传递给氧，然而由于存在1%的电子漏出，有部分电子直接与氧结合转变为氧自由基[3]，正常时产生的少量自由基很快被抗氧化酶灭活，不致产生病理效应，脑外伤时常伴有脑缺血缺氧，导致呼吸链功能失调，加快自由基的生成和释放，伴发的脑实质出血、蛛网膜下腔出血致Fe3+、Cu2+溢至血管外，金属络合物可高效催化脂过氧化物分解，引起自由基链式反应，进一步损伤呼吸链，能量产生减少，电子漏出增加，如此正反馈，产生大量自由基。自由基攻击亚细胞结构，产生病理效应。
, 百拇医药
ATP酶要进行逆化学梯度离子转运，维持膜内外离子浓度相对稳定，必须水解ATP释放能量。脑外伤后，ATP产生不足，可影响ATP酶活性；另外，脑外伤后神经细胞内Ca2+超载，同时线粒体摄Ca2+增多。过多的Ca2+积聚在线粒体，干扰线粒体氧化磷酸化，ATP生成更趋减少，使原已存在的能量匮乏更加严重，导致ATP酶活性进一步下降。
实验发现，脑外伤早期线粒体钠泵活性明显降低，导致线粒体内Na+、H2O积聚。钠泵对维持线粒体内外Na+、H2O平衡起重要作用，该酶活性降低，导致线粒体肿胀。同时，线粒体Ca2+、Mg2+-ATP酶活性亦降低，加重线粒体内Ca2+超载，Ca2+超载则触发一系列病理反应(包括自由基反应)，导致线粒体功能障碍，促进脑外伤后继发性脑水肿的发展。Mg2+-ATP酶对维持线粒体内Mg2+浓度具有重要作用。Mg+是Ca2+内流的天然拮抗剂，可抑制线粒体对Ca2+的摄取，防止Ca2+超载所致的线粒体损伤。该酶活性降低致线粒体内大量Ca2+聚集，与其他因素一起致线粒体肿胀，亚细胞结构损害是组织不可逆损伤的重要因素。
, 百拇医药
应用直线相关分析发现，线粒体MDA含量与ATP酶活性之间呈显著负相关，提示自由基抑制ATP酶活性。脑外伤后线粒体产生自由基增多，攻击线粒体膜，导致膜磷质降解和不饱和脂肪酸的过氧化，引起界面脂和膜流动性的改变；自由基还可直接破坏ATP酶的结构、氧化ATP酶上的氨基酸，从而影响酶的活性。
实验发现，HBO组MDA含量、ATP酶活性以及电镜下神经细胞和线粒体的变化均比外伤组轻。这是由于脑细胞对氧有特殊的敏感性和依赖性，一旦脑损伤后，可逆性损伤细胞的恢复必须有赖于氧，而HBO可增加氧的弥散力，增加组织对氧的利用，纠正脑组织缺氧状态，阻断缺氧所致的恶性循环，使线粒体的功能和结构逐渐恢复，氧化磷酸化、三羧酸循环功能得以正常进行，通过有氧氧化及时产生大量ATP，使膜上的ATP酶活性恢复，将线粒体内大量的Na+、Ca+泵出，从而减轻线粒体肿胀和损伤[4]。HBO还可激活抗氧化系统，提高抗氧化能力[5]，从而清除多余的自由基，随着自由基的清除，ATP酶活性进一步提高。
, http://www.100md.com
实验证明，脑外伤后脑细胞线粒体产生自由基增加，抑制线粒体ATP酶活性，致线粒体功能障碍，促进脑水肿发生发展，HBO可降低自由基含量，提高ATP酶活性，减轻脑水肿。
朱松君(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
辛克清(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
魏本俊(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
单向兰(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
石银菊(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
参考文献
1，李静，万积成，吴建中，等.高压氧对实验性颅脑损伤和脑水肿的影响.中华神经外科杂志，1994，10：266-269.
, 百拇医药
2，卞留贯，张天锡，赵卫国.脑缺血后脑细胞线粒体LPO、SOD的变化.中国神经精神疾病杂志，1994，20：28-30.
3，Yukio I,Donlin ML.The molecular basis of brain injury and brain edema:The role of oxygen free radicals.Neurosurgery,1990,27:1-11.
4，Takahashi M,Iwatsuki N,Ono K,et al.Hyperbaric oxygen therapy accelerates neurologic recovery after 15-minute complete global cerebral ischemia in dogs.Crit Care Med,1992,20:1588-1594.
5，Richard BM,Andrew JD.Hyperbaric oxygen after global cerebral ischemia in rabbits reduces brain vascular permeability and blood flow.Stroke,1995,26:2307-2312., 百拇医药
朱松君 辛克清 魏本俊 单向兰 石银菊
摘 要 目的 研究外伤性脑水肿后脑细胞线粒体ATP酶活性、丙二醛(MDA)含量在继发性脑损伤中的作用，以及高压氧治疗的机理。方法 应用家兔脑损伤模型，观察高压氧作用后不同时间脑含水量、线粒体ATP酶活性、MDA含量变化。结果 线粒体ATP酶活性在伤后4 h即开始下降，至48 h降到最低点，MDA含量伤后显著增加，随时间延长增加更加明显，MDA与脑含水量间呈正相关，ATP酶活性与脑含水量之间呈负相关，高压氧组与外伤组比较，上述指标变化均较轻。结论 脑外伤后脑细胞线粒体自由基反应增强，ATP酶活性受抑，促进脑水肿发生、发展，高压氧通过减少自由基、增强ATP酶活性减轻脑水肿。
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关键词：高压氧；兔；脑损伤；脑水肿；腺苷三磷酸
本实验通过观察家兔脑损伤后脑细胞线粒体丙二醛(MDA)含量、ATP酶活性变化及高压氧(HBO)对两者的影响，探讨自由基、ATP酶在颅脑损伤、脑水肿发生发展过程中的作用及HBO治疗的机制。
材料和方法
健康家兔60只，体重1.7～3.6 kg，随机分为正常对照组6只，假手术对照组6只，单纯外伤组24只，外伤后高压氧治疗组24只。后两组用自由落体装置制成颅脑损伤模型[1]。假手术组暴露到硬膜后关颅，不致伤。HBO组动物术后观察0.5～1.0 h，置自制木箱中，将木箱置于高压氧舱内，在0.2 MPa下作用90 min，加压20 min，减压20 min,稳压50 min。脑细胞线粒体制备[2]：脑组织在匀浆介质IM1(0.25 mmol/L蔗糖、1 mmol/L EDTANa2、50 mmol/L Tris-HCI、pH7.5)中匀浆，将匀浆液以1 000 g离心10 min，取上清液在低温高速离心机上以15 000 g离心15 min，沉淀即为线粒体，移入IM2(0.25 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCI、pH7.5)中低温保存。脑含水量测定：取伤区脑组织，分析天平称重，置110℃恒温干燥器24 h至恒重，按Elliott公式计算，脑含水量＝(湿重-干重)/湿重×100%。线粒体MDA含量、ATP酶活性，分别应用南京建成生物工程研究所提供的MDA试剂盒和ATP酶试剂盒进行测定，单位分别为：纳摩尔每毫克蛋白(nmol/mg pr);微摩尔磷每毫克蛋白每小时(μmol Pi/mg pr.h-1)。蛋白含量用双缩脲法测定。超微结构观察：每组取相应部位脑组织3块，3%戊二醛、1%锇酸固定，EPON 812包埋，半薄切片定位，超薄切片，电镜观察。统计学处理：各组数据均用X±s表示，组间差异用t检验，部分数据采用直线相关分析。
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结 果
脑外伤后4 h脑含水量与MDA含量明显升高，至伤后48 h仍高于正常，且随时间延长呈上升趋势(与假手术组比较P<0.01)。高压氧组脑含水量与MDA含量在各时间点均比外伤组低(P<0.01)。脑细胞线粒体Na+、K+-ATP酶、Ca2+、Mg2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性伤后4 h明显降低，与假手术组相比，分别降低了17.97%、28.40%和24.84%，以后继续降低，至伤后48 h分别降低了64.19%、72.17%和72.94%(P<0.01)。高压氧组与外伤组比较，三种酶活性均明显提高(P<0.05，表1)。直线相关分析：MDA含量与Na+、K+-ATP酶、Ca2+、Mg2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性之间均呈负相关(r分别为-0.946，-0.885，-0.883，P<0.01)；MDA与脑含水量之间呈正相关(r＝0.617，P<0.01)；Na+、K+-ATP酶、Ca2+、Mg2+-ATP酶活性与脑含水量之间呈负相关(r分别为-0.646，-0.689，P<0.01)。电镜所见：外伤组神经元胞浆水肿，线粒体高度肿胀，基质中出现许多空泡，嵴减少或断裂，可见破裂的线粒体。HBO组上述损害减轻，仅见少数神经元胞浆水肿，个别线粒体肿胀(图1～4)。
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表1 各组家兔脑含水量、MDA、ATP酶活性(μmol Pi/mg pr.h-1,X±s，n=6)
组 别
脑含水量(%)
MDA含量(nmol/mg pr)
Na+、K+-ATP酶
Ca2+、Mg2+-ATP酶
Mg2+-ATP酶
正常对照组
78.08±0.38
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9.45±0.27
42.55±1.53
34.28±1.50
26.12±1.70
假手术组
78.30±0.68
9.53±0.22
42.06±1.24
33.06±0.60
26.09±1.99
外伤组 4 h
80.50±1.67
, 百拇医药
13.38±0.30
34.50±1.30
23.64±1.61
19.61±1.63
8 h
80.83±0.26
15.40±0.44
27.40±1.23
17.92±1.64
12.86±1.77
24 h
82.17±0.93
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23.93±0.57
21.29±1.34
12.19±1.52
9.98±1.45
48 h
83.17±1.97
34.55±0.77
15.06±1.36
9.20±1.52
7.06±0.75
HBO组 4 h
79.42±0.67
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11.15±0.33
39.25±1.79
28.52±2.20
23.43±1.36
8 h
79.25±0.27
12.59±0.43
33.74±1.70
22.35±2.36
17.13±1.26
24 h
79.17±0.68
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20.48±0.55
24.41±1.32
17.90±1.55
12.19±1.60
48 h
79.92±1.46
31.22±0.86
17.43±0.94
12.50±1.13
8.16±0.91
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图1 外伤组神经元肿胀，核周间隙增宽 ×8 000
图2 外伤组神经元线粒体高度肿胀，基质中出现空泡，嵴减少或断裂，个别线粒体破溃 ×2 000
图3 HBO组仅见少数神经元水肿 ×10 000
, http://www.100md.com 图4 HBO组神经元内仅见个别线粒体肿胀 ×15 000
讨 论
氧自由基半衰期短，体外检测困难，本组测定自由基引起膜脂质过氧化的终产物MDA含量间接反映自由基水平。本实验发现，脑外伤后脑细胞线粒体MDA含量显著增加，与脑含水量平行，说明其与脑水肿发生发展有关。线粒体是细胞氧化的主要场所，电子通过呼吸链传递给氧，然而由于存在1%的电子漏出，有部分电子直接与氧结合转变为氧自由基[3]，正常时产生的少量自由基很快被抗氧化酶灭活，不致产生病理效应，脑外伤时常伴有脑缺血缺氧，导致呼吸链功能失调，加快自由基的生成和释放，伴发的脑实质出血、蛛网膜下腔出血致Fe3+、Cu2+溢至血管外，金属络合物可高效催化脂过氧化物分解，引起自由基链式反应，进一步损伤呼吸链，能量产生减少，电子漏出增加，如此正反馈，产生大量自由基。自由基攻击亚细胞结构，产生病理效应。
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ATP酶要进行逆化学梯度离子转运，维持膜内外离子浓度相对稳定，必须水解ATP释放能量。脑外伤后，ATP产生不足，可影响ATP酶活性；另外，脑外伤后神经细胞内Ca2+超载，同时线粒体摄Ca2+增多。过多的Ca2+积聚在线粒体，干扰线粒体氧化磷酸化，ATP生成更趋减少，使原已存在的能量匮乏更加严重，导致ATP酶活性进一步下降。
实验发现，脑外伤早期线粒体钠泵活性明显降低，导致线粒体内Na+、H2O积聚。钠泵对维持线粒体内外Na+、H2O平衡起重要作用，该酶活性降低，导致线粒体肿胀。同时，线粒体Ca2+、Mg2+-ATP酶活性亦降低，加重线粒体内Ca2+超载，Ca2+超载则触发一系列病理反应(包括自由基反应)，导致线粒体功能障碍，促进脑外伤后继发性脑水肿的发展。Mg2+-ATP酶对维持线粒体内Mg2+浓度具有重要作用。Mg+是Ca2+内流的天然拮抗剂，可抑制线粒体对Ca2+的摄取，防止Ca2+超载所致的线粒体损伤。该酶活性降低致线粒体内大量Ca2+聚集，与其他因素一起致线粒体肿胀，亚细胞结构损害是组织不可逆损伤的重要因素。
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应用直线相关分析发现，线粒体MDA含量与ATP酶活性之间呈显著负相关，提示自由基抑制ATP酶活性。脑外伤后线粒体产生自由基增多，攻击线粒体膜，导致膜磷质降解和不饱和脂肪酸的过氧化，引起界面脂和膜流动性的改变；自由基还可直接破坏ATP酶的结构、氧化ATP酶上的氨基酸，从而影响酶的活性。
实验发现，HBO组MDA含量、ATP酶活性以及电镜下神经细胞和线粒体的变化均比外伤组轻。这是由于脑细胞对氧有特殊的敏感性和依赖性，一旦脑损伤后，可逆性损伤细胞的恢复必须有赖于氧，而HBO可增加氧的弥散力，增加组织对氧的利用，纠正脑组织缺氧状态，阻断缺氧所致的恶性循环，使线粒体的功能和结构逐渐恢复，氧化磷酸化、三羧酸循环功能得以正常进行，通过有氧氧化及时产生大量ATP，使膜上的ATP酶活性恢复，将线粒体内大量的Na+、Ca+泵出，从而减轻线粒体肿胀和损伤[4]。HBO还可激活抗氧化系统，提高抗氧化能力[5]，从而清除多余的自由基，随着自由基的清除，ATP酶活性进一步提高。
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实验证明，脑外伤后脑细胞线粒体产生自由基增加，抑制线粒体ATP酶活性，致线粒体功能障碍，促进脑水肿发生发展，HBO可降低自由基含量，提高ATP酶活性，减轻脑水肿。
朱松君(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
辛克清(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
魏本俊(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
单向兰(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
石银菊(266041 青岛市第三人民医院神经外科)
参考文献
1，李静，万积成，吴建中，等.高压氧对实验性颅脑损伤和脑水肿的影响.中华神经外科杂志，1994，10：266-269.
, 百拇医药
2，卞留贯，张天锡，赵卫国.脑缺血后脑细胞线粒体LPO、SOD的变化.中国神经精神疾病杂志，1994，20：28-30.
3，Yukio I,Donlin ML.The molecular basis of brain injury and brain edema:The role of oxygen free radicals.Neurosurgery,1990,27:1-11.
4，Takahashi M,Iwatsuki N,Ono K,et al.Hyperbaric oxygen therapy accelerates neurologic recovery after 15-minute complete global cerebral ischemia in dogs.Crit Care Med,1992,20:1588-1594.
5，Richard BM,Andrew JD.Hyperbaric oxygen after global cerebral ischemia in rabbits reduces brain vascular permeability and blood flow.Stroke,1995,26:2307-2312., 百拇医药