激素性骨坏死动物模型的研制
黄立新 董天华
摘 要 目的：成功制作激素性骨坏死的动物模型。方法：采用34只健康成年中国大耳白兔，随机分成单纯激素组(A组，5只)、单纯马血清组(B组，10只)、联合使用马血清和激素组(C组，14只)、正常对照组(D组，5只)4组。各组于激素注射后4周处死，取心、肝、肺、肾及骨标本，作光镜及透射电镜观察组织病理学改变，根据有无骨坏死表现计算各组骨坏死发生率。结果：C组骨坏死发生率较高(71.43%)；组织病理学观察发现多个部位均有骨坏死表现；坏死的股骨头软骨下可见髓腔内脂肪细胞明显增大，造血细胞减少，骨小梁内骨陷窝空虚，部分骨标本在软骨下骨的骨小管中可见血栓形成；透射电镜下可见骨细胞内脂滴存在，骨内血管内皮细胞空泡样变性。结论：联合使用马血清和地塞米松可成功制作激素性骨坏死动物模型,所需成本低,重复性好。
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关键词：激素；骨坏死；动物模型
非创伤性骨坏死以激素引起者居首位[1]，并有相当多的患者导致病残[2]。激素性骨坏死早期无症状，临床难以获得早期病理标本，而在以前的实验研究中单纯用激素不能诱导出典型的骨坏死动物模型[3]。考虑到临床上并发本病的患者常存在需要使用激素治疗的基础疾病，90年代日本学者Matsui等[4]及Yamamoto等[5]采用马血清或内毒素联合甲基强的松龙制作了较为接近人类骨坏死的动物模型。因其发病机制不明，故缺乏有效的预防及早期治疗方法[3]。我们借鉴Matsui等[4]的方法，改用地塞米松注射，成功地制作了家兔骨坏死模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及造模方法 选用健康成年中国大耳白兔34只[由苏州大学实验动物中心(原苏州医学院实验动物中心)提供]，体重2.5～3.3kg，平均2.7kg，雌雄不分，随机分为4组。A组:单纯激素组，5只，连续3天腹腔内注射地塞米松，每日10mg/kg。B组:单纯马血清组，10只，间隔3周耳缘静脉注射马血清(购自上海华美公司)2次，每次10ml/kg。C组:马血清加激素组，14只，同B组方法注射马血清，第2次注射2周后， 连续3天腹腔内注射地塞米松，每日10mg/kg。D组:正常对照组，5只，用于实验对照。4组动物均分笼饲养， 标准自由饮食。
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1.2 观察指标及观察方法
1.2.1 一般情况 观察注射马血清及激素后实验动物的表现及体重变化。
1.2.2 大体观察 动物于用药后4周处死，取心、肝、肾、肺，观察表面及剖面形态。取左侧股骨近、远端及肱骨近端骨标本沿冠状面剖开，观察剖面情况。
1.2.3 HE染色光镜组织病理学观察 取心、肝、肾、肺，经福尔马林固定，石蜡包埋，制成厚4μm切片，HE染色，光镜下观察心、肝、肾、肺组织、脂肪细胞的变化及有无组织坏死。
取股骨近、远端及肱骨近端，福尔马林固定，脱钙，石蜡包埋，制成厚4μm切片，HE染色，光镜下观察股骨近、远端及肱骨近端的骨及骨髓组织变化。主要观察有无骨髓或骨的坏死表现，参照Matsui[4]方法对骨标本的组织病理改变分级。0级：骨小梁及骨髓完整，无病理改变;1级：单纯骨髓坏死，不伴有骨小梁坏死，表现为骨髓细胞溶解，细胞核碎裂、溶解，脂肪细胞的核消失及边界不清或融合；2级：同时有骨髓坏死和骨小梁坏死，除了有1级的病理改变外，还有骨细胞陷窝空虚并伴有贴敷性新骨形成。
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根据光镜观察结果，计算骨坏死发生率，按照0级为无坏死，1～2级为骨坏死，骨坏死发生率=各组存在骨坏死的动物数/本组总动物数×100%。
1.2.4 透射电镜观察 每组取1～2只家兔，用药4周后，静脉麻醉下，股骨头软骨下0.2～0.3cm处取1mm×1mm×1mm大小骨块，戊二醛前固定，脱钙，锇酸后固定，常规包埋，制成超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝双染色，透射电子显微镜观察。
1.3 统计学处理 对各组处理前后体重采用两样本均数比较的t检验；骨坏死发生率采用两样本发生率比较的x2检验。
2 结果
2.1 一般情况 B、C组动物于第2次注射马血清后，立即出现呼吸急促，大多数于注射后1～2h内精神较差，6h后恢复正常。A、D组动物无此现象。A、C组动物大多数于4周后有体重减轻， B组动物4周后体重都有不同程度的增加。各组处理前后体重变化见表1。
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表1 各组处理前后体重变化(kg)
组别
处理前
处理后4W
A
2.47±0.27
2.10±0.20*
B
2.48±0.31
2.87±0.28*
C
2.74±0.30
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2.51±0.23*
D
2.44±0.16
* 与处理前比较，P<0.05
2.2 大体观察
2.2.1 心、肝、肾、肺大体观察 使用激素的A、C组动物肝脏剖面大多为褐黄色，并有油腻感，心、肺、肾无明显异常。
2.2.2 骨标本大体观察 骨标本冠状剖面上，存在骨坏死的部分区域呈现灰色，骨小梁结构不清，排列紊乱，但坏死区与正常区之间界限不明显，形状不规则。C组动物中此种现象较为多见。A、C组动物骨标本较易凿削。D组动物的股骨头下骨质较为坚硬，冠状剖面上骨小梁排列规则。
2.3 光镜组织病理学观察
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2.3.1 内脏病理变化 心、肾组织均未见明显异常。C组中有2只见肺内小灶出血。A组5只动物中3只有肝细胞脂肪变性伴肝细胞肿胀; B组10只动物中4只存在肝细胞肿胀;C组14只动物中12只有肝细胞脂肪变性，其中3只见肝细胞灶性坏死。D组均未发现有明显异常。
2.3.2 股骨近、远端及肱骨近端的骨及骨髓组织病理改变 见表2。其中C组部分死骨中央骨小管内可见血栓形成。
表2 各组股骨近、远端及肱骨近端骨标本
各级病理改变情况[n(%)]
组别
n
病理分级
0级
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1级
2级
A
24
17(70.83)
6(25)
1(4.17)
B
48
42(87.50)
6(12.50)
0(0)
C
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72
16(22.22)
32(44.44)
24(33.33)
D
24
24
0(0)
0(0)
2.3.3 骨坏死发生率 C组骨坏死发生率(71.43%，10/14)高于A(40%，2/5)、B(30%，3/10)及D组(0%，0/5)。C组与B组及D组比较均有显著差别(分别P<0.05和P<0.01)。
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2.4 透射电镜观察 A、C组骨细胞胞浆中有脂滴，细胞核膜完整，骨髓内细胞发生核固缩，并有自溶现象。C组骨内血管可见内皮与中层膜之间有裂隙，内皮细胞有空泡样变性。死骨附近可见不成熟的前成骨细胞，胞浆内存在丰富的内质网。
3 讨论
3.1 激素与脂质代谢紊乱 许多学者发现人和动物对皮质类固醇激素的反应是一致的，大剂量激素在体内可促使脂肪分解，形成机体内脂质代谢紊乱，高脂血症。Jones等[6]在激素导致的股骨头坏死(ONFH)病例中发现，患者均有全身性的脂肪栓塞，同时有明显的高脂血症和囊性脂肪肝，认为ONFH可能是由于骨内血管脂肪栓塞所致，并通过实验在坏死的股骨头软骨下发现了大量的脂滴，提出了ONFH“脂肪栓塞学说”。栓塞性脂质可由于脂肪肝、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的失稳和融合所引起，而脂质骨髓或其他含脂肪组织的裂解是脂肪栓子的另一个来源，这些脂肪栓子可引起骨内微循环的栓塞，骨细胞缺氧，最后导致骨细胞碎裂、坏死。本研究发现单纯应用激素及联合应用马血清和激素的实验动物，肝细胞脂肪变性，骨髓腔内脂肪组织增多，同时普遍出现体重下降，也说明大剂量激素可促进体内脂肪分解和脂肪迁移，导致脂质代谢紊乱。
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3.2 大剂量激素对骨髓细胞及骨细胞的影响 骨髓基质中含有多能干细胞，Cui等[3，7]和Oreffo等[8]在体外研究中发现，地塞米松能诱导动物和人的骨髓基质细胞分化成脂肪细胞，而成骨能力下降，同时地塞米松还能抑制骨髓基质干细胞的增殖。推测在激素性股骨头缺血性坏死时，股骨头骨髓内脂肪增多的原因可能与激素诱导的骨髓基质细胞大量分化成脂肪细胞有关。
激素引起的高脂血症，使骨细胞生活的骨液中脂质成分升高，其流动及交换减慢，给脂质在骨细胞内沉积带来了机会。Kawai等认为大量的脂质进入细胞内，骨细胞的正常脂质代谢过程被破坏，必然会引起细胞内脂肪沉积，最后导致骨细胞变性、坏死。本组动物使用激素后出现骨髓内脂肪细胞肥大及脂肪组织增多，电镜下观察到骨细胞内有脂滴存在，推测与骨髓基质细胞向脂肪细胞分化增多及骨细胞内脂肪沉积有关。
3.3 激素、血管内凝血与骨坏死的关系 1992年，Jones[9]提出了“血管内凝血(IC)学说”，认为IC是非创伤性骨坏死的最后共同通路，并首次在3例典型骨坏死患者的股骨头软骨下区的微循环中发现了脂肪栓子和纤维蛋白血栓，找到了直接的病理组织学证据证实IC学说。
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激素应用后，由于脂肪代谢紊乱，机体内脂肪超量，沉积在股骨头血管内的脂肪球联合体在脂肪酶的作用下分解，游离脂肪酸增多，加上局部炎性介质，损伤血管内皮细胞，以股骨头软骨下微循环的窦状隙内皮最易受损。而由于髓内脂肪细胞肥大和脂肪栓子栓塞，导致髓内静脉回流受阻，又可引起髓内血流的瘀滞，可触发IC，形成远端静脉的纤维蛋白血小板凝聚栓塞，并逆行蔓延而累及终动脉，特别是当有血管缩窄和继发性纤维蛋白溶解功能降低的时候，出现股骨头的缺血，骨细胞缺氧而最终坏死。在本研究中，实验动物的软骨下骨的骨小管内，也见到了血栓形成。
3.4 抗原-抗体变态反应在实验性骨坏死中的作用
尽管激素可导致脂质代谢紊乱、高脂血症、脂肪栓塞，而且能促进骨髓多能干细胞向脂肪细胞分化，抑制成骨细胞的形成，促使骨细胞内脂质沉积。但在动物实验中，单纯应用激素未能诱导出典型的骨坏死病变，考虑到临床上激素性ONFH都存在需要用激素治疗的以血管炎为特征的基础疾病[10]，Matsui等[4]采用二次注射马血清诱发家兔发生抗原-抗体变态反应，再联合使用激素，成功地制作了非创伤性骨坏死的动物模型。他们重点观察了股骨近端骨内小血管的病变，发现实验动物骨内小动脉中层膜退变，平滑肌细胞消失，血管内膜弹力层破坏。Nakata等[11]利用该模型在骨坏死部位的骨髓内观察到了免疫复合物的沉积，骨坏死可能是由于免疫复合物沉积所致的血管炎引起局部髓内小动脉病变，出现小动脉微血栓而致骨缺血，他们认为，骨内小血管是抗原-抗体复合物及激素的靶血管，其作用使血管内皮受损，微血栓形成，提出“小血管病变学说”可能就是ONFH的发病机制。我们在透射电镜观察中也发现了股骨头内的血管内皮受损现象。
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3.5 激素性骨坏死可发生于全身多个部位 事实上，激素性骨坏死的病变并不局限于股骨头[1]，激素性骨坏死可能是一个全身性的疾病。Yamamoto等[12]报道50%的ONFH患者存在1处以上的骨坏死。最近有文献报道了101例多发性骨坏死(3处或3处以上)，激素性者为92例(91%)[13]。所有患者均存在股骨头骨坏死表现，其他部位还包括膝关节(96%)、肩关节(80%)、踝关节(44%)，而且双侧性者较常见。在本实验中，联合应用马血清和激素的动物中，常可见到多部位的骨坏死，包括股骨头软骨下、干骺端及肱骨头或股骨远端。该模型较接近于人类激素性骨坏死为多发性这一特点，而由于股骨头及肱骨头在解剖上的特殊性，其发病率相对较高，而股骨髁部的骨坏死在本实验中发病率较低，估计与膝关节周围血供较丰富有关。
本实验联合使用马血清和地塞米松的动物模型骨坏死率较高，重复性较好，简便易行，而且地塞米松价格远低于甲基强的松龙，所需成本低，病理变化也较为接近人类ONFH的临床特点，可为今后研究激素性骨坏死的发病机制、分析高危因素、探索早期预防和治疗提供较为理想的动物模型。
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黄立新(苏州大学附属第一医院骨科,苏州,215006)
董天华(苏州大学附属第一医院骨科,苏州,215006)
参考文献
1，Laporte DM, Mont MA, Mohan V, et al. Multifocal osteonecrosis. J Rheumatol, 1998, 25(10)∶1968～1974
2，Lavernia CJ, Sierra RJ, Grieco FR. Osteonecrosis of the femoral head. J Am Acad Orthop Surg, 1999,7(4)∶250～261
3，Cui Q, Wang GJ, Su CC, et al. Lovastatin prevents steroid induced adipogenesis and osteonecrosis. Clin Orthop. 1997, 344∶8～19
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4，Matsui M, Saito S, Ohzono K, et al. Experimental steroid-induced osteonecrosis in adult rabbits with hypersensitivity vasculitis.Clin Orthop 1992, 277∶61～72
5，Yamamoto T, Hirano K, Tsutsui H, et al. Corticosteroid enhances the experimental induction of osteonecrosis in rabbits with shwartzman reaction. Clin Orthop. 1995, 316∶235～243
6，Jones JP,Sakovich L.Fat embolism of bone. A roentgeno-
graphic and histological investigation with use of intraarterial Lipiodol in rabbits. J Bone Joint Surg. 1966, 48A∶149
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7，Cui R, wang GJ, Balian G.Steroid-induced adipogenesis in a pluripotential cekk line from bone marrow. J Bone Joint Surg,1997,79(A)∶1054～1063
8，Oreffo RO,Virdi AS,Triffitt JT. Modulation of osteogenesis and adipogenesis by human serum in human bone marrow cultures. Eur J Cell Biol, 1997,74∶251～261
9，Jones JP. Intravascular coagulation and osteonecrosis. Clin Orthop. 1992, 277∶41～53
10，Mont MA, Glueck CJ, Pacheco IH, et al. Risk factor for osteonecrosis in systemic lupus erythematosus.J Rheumatol, 1997,24∶654～662
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11，Nakata K,Masuhara K, Nakamura N, et al. Inducible osteonecrosis in a rabbit serum sickness model: Desposition of immune complexes in bone marrow.Bone 1996,18∶609～615
12，Yamamoto T, Dicarlo EF, Bullugh PG. The prevalence and clinicoathological appearance of extension of osteonecrosis in the femoral head . J Bone Joint Surg,1999,81(Br)(2)∶328～332
13，Collaborative Osteonecrosis Group. Symptomatic multifocal osteonecrosis: A multicenter study . Clin Orthop. 1999,369∶312～326, 百拇医药
摘 要 目的：成功制作激素性骨坏死的动物模型。方法：采用34只健康成年中国大耳白兔，随机分成单纯激素组(A组，5只)、单纯马血清组(B组，10只)、联合使用马血清和激素组(C组，14只)、正常对照组(D组，5只)4组。各组于激素注射后4周处死，取心、肝、肺、肾及骨标本，作光镜及透射电镜观察组织病理学改变，根据有无骨坏死表现计算各组骨坏死发生率。结果：C组骨坏死发生率较高(71.43%)；组织病理学观察发现多个部位均有骨坏死表现；坏死的股骨头软骨下可见髓腔内脂肪细胞明显增大，造血细胞减少，骨小梁内骨陷窝空虚，部分骨标本在软骨下骨的骨小管中可见血栓形成；透射电镜下可见骨细胞内脂滴存在，骨内血管内皮细胞空泡样变性。结论：联合使用马血清和地塞米松可成功制作激素性骨坏死动物模型,所需成本低,重复性好。
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关键词：激素；骨坏死；动物模型
非创伤性骨坏死以激素引起者居首位[1]，并有相当多的患者导致病残[2]。激素性骨坏死早期无症状，临床难以获得早期病理标本，而在以前的实验研究中单纯用激素不能诱导出典型的骨坏死动物模型[3]。考虑到临床上并发本病的患者常存在需要使用激素治疗的基础疾病，90年代日本学者Matsui等[4]及Yamamoto等[5]采用马血清或内毒素联合甲基强的松龙制作了较为接近人类骨坏死的动物模型。因其发病机制不明，故缺乏有效的预防及早期治疗方法[3]。我们借鉴Matsui等[4]的方法，改用地塞米松注射，成功地制作了家兔骨坏死模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及造模方法 选用健康成年中国大耳白兔34只[由苏州大学实验动物中心(原苏州医学院实验动物中心)提供]，体重2.5～3.3kg，平均2.7kg，雌雄不分，随机分为4组。A组:单纯激素组，5只，连续3天腹腔内注射地塞米松，每日10mg/kg。B组:单纯马血清组，10只，间隔3周耳缘静脉注射马血清(购自上海华美公司)2次，每次10ml/kg。C组:马血清加激素组，14只，同B组方法注射马血清，第2次注射2周后， 连续3天腹腔内注射地塞米松，每日10mg/kg。D组:正常对照组，5只，用于实验对照。4组动物均分笼饲养， 标准自由饮食。
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1.2 观察指标及观察方法
1.2.1 一般情况 观察注射马血清及激素后实验动物的表现及体重变化。
1.2.2 大体观察 动物于用药后4周处死，取心、肝、肾、肺，观察表面及剖面形态。取左侧股骨近、远端及肱骨近端骨标本沿冠状面剖开，观察剖面情况。
1.2.3 HE染色光镜组织病理学观察 取心、肝、肾、肺，经福尔马林固定，石蜡包埋，制成厚4μm切片，HE染色，光镜下观察心、肝、肾、肺组织、脂肪细胞的变化及有无组织坏死。
取股骨近、远端及肱骨近端，福尔马林固定，脱钙，石蜡包埋，制成厚4μm切片，HE染色，光镜下观察股骨近、远端及肱骨近端的骨及骨髓组织变化。主要观察有无骨髓或骨的坏死表现，参照Matsui[4]方法对骨标本的组织病理改变分级。0级：骨小梁及骨髓完整，无病理改变;1级：单纯骨髓坏死，不伴有骨小梁坏死，表现为骨髓细胞溶解，细胞核碎裂、溶解，脂肪细胞的核消失及边界不清或融合；2级：同时有骨髓坏死和骨小梁坏死，除了有1级的病理改变外，还有骨细胞陷窝空虚并伴有贴敷性新骨形成。
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根据光镜观察结果，计算骨坏死发生率，按照0级为无坏死，1～2级为骨坏死，骨坏死发生率=各组存在骨坏死的动物数/本组总动物数×100%。
1.2.4 透射电镜观察 每组取1～2只家兔，用药4周后，静脉麻醉下，股骨头软骨下0.2～0.3cm处取1mm×1mm×1mm大小骨块，戊二醛前固定，脱钙，锇酸后固定，常规包埋，制成超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝双染色，透射电子显微镜观察。
1.3 统计学处理 对各组处理前后体重采用两样本均数比较的t检验；骨坏死发生率采用两样本发生率比较的x2检验。
2 结果
2.1 一般情况 B、C组动物于第2次注射马血清后，立即出现呼吸急促，大多数于注射后1～2h内精神较差，6h后恢复正常。A、D组动物无此现象。A、C组动物大多数于4周后有体重减轻， B组动物4周后体重都有不同程度的增加。各组处理前后体重变化见表1。
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表1 各组处理前后体重变化(kg)
组别
处理前
处理后4W
A
2.47±0.27
2.10±0.20*
B
2.48±0.31
2.87±0.28*
C
2.74±0.30
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2.51±0.23*
D
2.44±0.16
* 与处理前比较，P<0.05
2.2 大体观察
2.2.1 心、肝、肾、肺大体观察 使用激素的A、C组动物肝脏剖面大多为褐黄色，并有油腻感，心、肺、肾无明显异常。
2.2.2 骨标本大体观察 骨标本冠状剖面上，存在骨坏死的部分区域呈现灰色，骨小梁结构不清，排列紊乱，但坏死区与正常区之间界限不明显，形状不规则。C组动物中此种现象较为多见。A、C组动物骨标本较易凿削。D组动物的股骨头下骨质较为坚硬，冠状剖面上骨小梁排列规则。
2.3 光镜组织病理学观察
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2.3.1 内脏病理变化 心、肾组织均未见明显异常。C组中有2只见肺内小灶出血。A组5只动物中3只有肝细胞脂肪变性伴肝细胞肿胀; B组10只动物中4只存在肝细胞肿胀;C组14只动物中12只有肝细胞脂肪变性，其中3只见肝细胞灶性坏死。D组均未发现有明显异常。
2.3.2 股骨近、远端及肱骨近端的骨及骨髓组织病理改变 见表2。其中C组部分死骨中央骨小管内可见血栓形成。
表2 各组股骨近、远端及肱骨近端骨标本
各级病理改变情况[n(%)]
组别
n
病理分级
0级
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1级
2级
A
24
17(70.83)
6(25)
1(4.17)
B
48
42(87.50)
6(12.50)
0(0)
C
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72
16(22.22)
32(44.44)
24(33.33)
D
24
24
0(0)
0(0)
2.3.3 骨坏死发生率 C组骨坏死发生率(71.43%，10/14)高于A(40%，2/5)、B(30%，3/10)及D组(0%，0/5)。C组与B组及D组比较均有显著差别(分别P<0.05和P<0.01)。
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2.4 透射电镜观察 A、C组骨细胞胞浆中有脂滴，细胞核膜完整，骨髓内细胞发生核固缩，并有自溶现象。C组骨内血管可见内皮与中层膜之间有裂隙，内皮细胞有空泡样变性。死骨附近可见不成熟的前成骨细胞，胞浆内存在丰富的内质网。
3 讨论
3.1 激素与脂质代谢紊乱 许多学者发现人和动物对皮质类固醇激素的反应是一致的，大剂量激素在体内可促使脂肪分解，形成机体内脂质代谢紊乱，高脂血症。Jones等[6]在激素导致的股骨头坏死(ONFH)病例中发现，患者均有全身性的脂肪栓塞，同时有明显的高脂血症和囊性脂肪肝，认为ONFH可能是由于骨内血管脂肪栓塞所致，并通过实验在坏死的股骨头软骨下发现了大量的脂滴，提出了ONFH“脂肪栓塞学说”。栓塞性脂质可由于脂肪肝、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的失稳和融合所引起，而脂质骨髓或其他含脂肪组织的裂解是脂肪栓子的另一个来源，这些脂肪栓子可引起骨内微循环的栓塞，骨细胞缺氧，最后导致骨细胞碎裂、坏死。本研究发现单纯应用激素及联合应用马血清和激素的实验动物，肝细胞脂肪变性，骨髓腔内脂肪组织增多，同时普遍出现体重下降，也说明大剂量激素可促进体内脂肪分解和脂肪迁移，导致脂质代谢紊乱。
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3.2 大剂量激素对骨髓细胞及骨细胞的影响 骨髓基质中含有多能干细胞，Cui等[3，7]和Oreffo等[8]在体外研究中发现，地塞米松能诱导动物和人的骨髓基质细胞分化成脂肪细胞，而成骨能力下降，同时地塞米松还能抑制骨髓基质干细胞的增殖。推测在激素性股骨头缺血性坏死时，股骨头骨髓内脂肪增多的原因可能与激素诱导的骨髓基质细胞大量分化成脂肪细胞有关。
激素引起的高脂血症，使骨细胞生活的骨液中脂质成分升高，其流动及交换减慢，给脂质在骨细胞内沉积带来了机会。Kawai等认为大量的脂质进入细胞内，骨细胞的正常脂质代谢过程被破坏，必然会引起细胞内脂肪沉积，最后导致骨细胞变性、坏死。本组动物使用激素后出现骨髓内脂肪细胞肥大及脂肪组织增多，电镜下观察到骨细胞内有脂滴存在，推测与骨髓基质细胞向脂肪细胞分化增多及骨细胞内脂肪沉积有关。
3.3 激素、血管内凝血与骨坏死的关系 1992年，Jones[9]提出了“血管内凝血(IC)学说”，认为IC是非创伤性骨坏死的最后共同通路，并首次在3例典型骨坏死患者的股骨头软骨下区的微循环中发现了脂肪栓子和纤维蛋白血栓，找到了直接的病理组织学证据证实IC学说。
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激素应用后，由于脂肪代谢紊乱，机体内脂肪超量，沉积在股骨头血管内的脂肪球联合体在脂肪酶的作用下分解，游离脂肪酸增多，加上局部炎性介质，损伤血管内皮细胞，以股骨头软骨下微循环的窦状隙内皮最易受损。而由于髓内脂肪细胞肥大和脂肪栓子栓塞，导致髓内静脉回流受阻，又可引起髓内血流的瘀滞，可触发IC，形成远端静脉的纤维蛋白血小板凝聚栓塞，并逆行蔓延而累及终动脉，特别是当有血管缩窄和继发性纤维蛋白溶解功能降低的时候，出现股骨头的缺血，骨细胞缺氧而最终坏死。在本研究中，实验动物的软骨下骨的骨小管内，也见到了血栓形成。
3.4 抗原-抗体变态反应在实验性骨坏死中的作用
尽管激素可导致脂质代谢紊乱、高脂血症、脂肪栓塞，而且能促进骨髓多能干细胞向脂肪细胞分化，抑制成骨细胞的形成，促使骨细胞内脂质沉积。但在动物实验中，单纯应用激素未能诱导出典型的骨坏死病变，考虑到临床上激素性ONFH都存在需要用激素治疗的以血管炎为特征的基础疾病[10]，Matsui等[4]采用二次注射马血清诱发家兔发生抗原-抗体变态反应，再联合使用激素，成功地制作了非创伤性骨坏死的动物模型。他们重点观察了股骨近端骨内小血管的病变，发现实验动物骨内小动脉中层膜退变，平滑肌细胞消失，血管内膜弹力层破坏。Nakata等[11]利用该模型在骨坏死部位的骨髓内观察到了免疫复合物的沉积，骨坏死可能是由于免疫复合物沉积所致的血管炎引起局部髓内小动脉病变，出现小动脉微血栓而致骨缺血，他们认为，骨内小血管是抗原-抗体复合物及激素的靶血管，其作用使血管内皮受损，微血栓形成，提出“小血管病变学说”可能就是ONFH的发病机制。我们在透射电镜观察中也发现了股骨头内的血管内皮受损现象。
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3.5 激素性骨坏死可发生于全身多个部位 事实上，激素性骨坏死的病变并不局限于股骨头[1]，激素性骨坏死可能是一个全身性的疾病。Yamamoto等[12]报道50%的ONFH患者存在1处以上的骨坏死。最近有文献报道了101例多发性骨坏死(3处或3处以上)，激素性者为92例(91%)[13]。所有患者均存在股骨头骨坏死表现，其他部位还包括膝关节(96%)、肩关节(80%)、踝关节(44%)，而且双侧性者较常见。在本实验中，联合应用马血清和激素的动物中，常可见到多部位的骨坏死，包括股骨头软骨下、干骺端及肱骨头或股骨远端。该模型较接近于人类激素性骨坏死为多发性这一特点，而由于股骨头及肱骨头在解剖上的特殊性，其发病率相对较高，而股骨髁部的骨坏死在本实验中发病率较低，估计与膝关节周围血供较丰富有关。
本实验联合使用马血清和地塞米松的动物模型骨坏死率较高，重复性较好，简便易行，而且地塞米松价格远低于甲基强的松龙，所需成本低，病理变化也较为接近人类ONFH的临床特点，可为今后研究激素性骨坏死的发病机制、分析高危因素、探索早期预防和治疗提供较为理想的动物模型。
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黄立新(苏州大学附属第一医院骨科,苏州,215006)
董天华(苏州大学附属第一医院骨科,苏州,215006)
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