神痛宁胶囊质量标准研究
丁青龙1,黄银涛2,刘桂永1
(1解放军第102医院 常州 213003, 2南京中医药大学 南京 210029)
[摘要] 目的：对神痛宁胶囊进行质量标准研究。方法：采用生物碱沉淀反应鉴别生物碱，采用TLC法鉴别主药独活及青风藤中的青藤碱，用酸碱中和滴定法测定药物中总生物碱含量，用反相-HPLC对毒性成分(以中乌头碱为代表)进行限量检查。结果：TLC鉴别斑点分离度好，斑点清楚，总生物碱含量为0.8~0.9mg/粒，用同一批号重复测5次，RSD为2.40%，毒性成分(以中乌头碱为代表)最高含量为9.54µg/粒，平均回收率95.40%~97.25%，RSD为2.03%~2.47%。结论：此方法简便，重现性好，结果可靠，可有效地控制制剂质量。
[关键词] 神痛宁胶囊; 乌头碱; HPLC; 质量控制
[中图分类号] R289.5 [文献标识号]B [文章编号]1003-3734(2001)-200466
, 百拇医药
Study of the criteria of Shentongning Capsules
DING Qing-long1, HUANG Yin-tao2, LIU Gui-yong1
(1 The 102 Hospital of PLA, Changzhou 213003,China; 2 Nanjing Traditional Medical University,Nanjing 210029,china)
[Abstract] Objective: To establish criteria for Shentongning capsules. METHODS: The alkaliods were detecteded by gravimetric precipitation reaction; the kukoline in Orientvine and radix angelicae tuhuo were detected by TLC method,and the total alkoloids in the product was determined by RP-HPLC.RESULTS: The alkaliods were clearly separated by TLC method. The total alkaloids content per capsule obtained was 0.8-0.9mg with a RSD of 2.40%, and the maximum content of toxic components per capsule was 9.54ug with a mean recovery 95.40%~97.25% and a RSD of 2.03%~2.47%. CONCLU-SIONS: A simple, reproducible and reliable method for quality control of shengtongning capsule is established.
, 百拇医药
[key words] shentongning capsule; kukoline; HPLC; quality control
[参考文献]
[1] 彭波. 反相离子对高效液相色谱法分离测定川乌和附片中乌头类生物碱的方法研究[J].药物分析杂志，1995，15(6):13-16.
[2] 沈映君.《中药药理学》[M].上海:上海科学技术出版社，1998.
>：对神痛宁胶囊进行质量标准研究。方法：采用生物碱沉淀反应鉴别生物碱，采用TLC法鉴别主药独活及青风藤中的青藤碱，用酸碱中和滴定法测定药物中总生物碱含量，用反相-HPLC对毒性成分(以中乌头碱为代表)进行限量检查。结果：TLC鉴别斑点分离度好，斑点清楚，总生物碱含量为0.8~0.9mg/粒，用同一批号重复测5次，RSD为2.40%，毒性成分(以中乌头碱为代表)最高含量为9.54µg/粒，平均回收率95.40%~97.25%，RSD为2.03%~2.47%。结论：此方法简便，重现性好，结果可靠，可有效地控制制剂质量。
, 百拇医药
[关键词] 神痛宁胶囊; 乌头碱; HPLC; 质量控制
[中图分类号] R289.5 [文献标识号]B [文章编号]1003-3734(2001)-200466
Study of the criteria of Shentongning Capsules
DING Qing-long1, HUANG Yin-tao2, LIU Gui-yong1
(1 The 102 Hospital of PLA, Changzhou 213003,China; 2 Nanjing Traditional Medical University,Nanjing 210029,china)
[Abstract] Objective: To establish criteria for Shentongning capsules. METHODS: The alkaliods were detecteded by gravimetric precipitation reaction; the kukoline in Orientvine and radix angelicae tuhuo were detected by TLC method,and the total alkoloids in the product was determined by RP-HPLC.RESULTS: The alkaliods were clearly separated by TLC method. The total alkaloids content per capsule obtained was 0.8-0.9mg with a RSD of 2.40%, and the maximum content of toxic components per capsule was 9.54ug with a mean recovery 95.40%~97.25% and a RSD of 2.03%~2.47%. CONCLU-SIONS: A simple, reproducible and reliable method for quality control of shengtongning capsule is established.
, 百拇医药
[key words] shentongning capsule; kukoline; HPLC; quality control
神痛宁胶囊是由制川乌、制草乌、青风藤、独活、木瓜、红花、当归、党参8味中药组成，有散寒除湿、祛风止痛、活血通络的功效。为控制该制剂质量，用生物碱沉淀反应对生物碱及TLC法对该处方中独活、青风藤中青藤碱进行鉴别，用酸碱滴定法测定有效成分总生物碱含量以及反相-HPLC法对毒性成分双酯型生物碱(以中乌头碱为代表)进行限量检查，结果满意。
1仪器与试药
分析天平(上海天平仪器厂)，PHS-3D型pH计(上海三信电讯厂)，939薄层制板器(重庆市南岸贝尔德仪器技术厂)，METTLER-AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，SB5200超声提取器(上海必能信超声有限公司)，高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)。乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、青藤碱对照品(中国药品生物制品检定所)，独活对照药材(南京中医药大学王春根教授鉴定)，神痛宁胶囊(批号981220，20000125，20000428，解放军第102医院制剂中心提供)，硅胶G(青岛海洋化工厂)，甲醇(色谱纯)，其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 定性鉴别
2.1 性状鉴别 本品为胶囊剂，内容物棕色至棕褐色颗粒，气微，微苦。
2.2 层析板制备 称取硅胶G 16g，加0.5%CMC-Na(内含0.5%NaOH)48mL(1:3)研磨15min，于939薄层制板器上铺成厚度为0.3mm的薄层层析板，待干后置电热恒温箱中105℃活化1h，取出置干燥器中备用。
2.3 青藤碱鉴别 取胶囊内容物3.5g，加无水乙醇30mL，水浴加热回流30min，过滤，滤液蒸干，残渣加盐酸(1→50)15mL溶解，过滤，滤液加氨试液调pH至9，转入分液漏斗，加氯仿萃取2次(10mL.次-1)，分取氯仿层，蒸干，残渣加无水乙醇1mL溶解作为供试品溶液，另取青藤碱对照品，加无水乙醇制成1mg.mL-1对照品溶液。吸取上述两种溶液各5µL，分别点于同一块已制好的薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-水(2:4:2:1)为展开剂(饱和15min)展开，取出晾干，喷碘化铋钾试液，在与对照品相应位置上显相同颜色(橙红)的斑点，见图1。
, 百拇医药
2.4 独活鉴别：取胶囊内容物3.5g，加无水乙醇20mL水浴加热回流15min过滤，滤液蒸干，残渣加氯仿2mL作为供试品溶液。另取独活对照品药材2g，同法制成对照品溶液。吸取供试品溶液5µL，对照品溶液2µL，分别点于同一已制好的薄层板上，以正己烷-苯-醋酸乙酯(2:1:1)为展开剂(饱和15min)展开取出晾干，置紫外灯(365nm)下检视，供试液色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同的颜色斑点。见图2。
图1 薄层色谱图 图2 薄层色谱图
1-青藤碱标准品 1-独活标准对照药材
2-供试品 2-供试品
2.5 生物碱沉淀反应 取2.3项下点样后剩余供试品液，蒸干残渣加盐酸(1→50)5mL溶解，于一试管中滴加碘化铋钾试液2滴即生成橙红色沉淀，一管中加碘化汞钾2滴即生成淡黄色沉淀，另一管中加硅钨酸试液2滴，即生成灰白色沉淀。
, 百拇医药
3 含量测定
3.1 总生物碱含量测定 精密称取胶囊内容物6g加无水乙醇50mL加热回流30min，过滤，药渣再加无水乙醇50mL回流20min，过滤，药渣用无水乙醇洗4次(15mL.次-1)，过滤，洗液滤液合并，蒸至快干，残渣用0.05mol.L-1硫酸10mL溶解，过滤，容器用0.05mol.L-1硫酸洗3次(5mL.次-1)，过滤，洗液和滤液合并，用氨试液调pH至9，转入分液漏斗，用氯仿萃取4次(20mL.次-1)，合并氯仿液，蒸干，残渣加无水乙醇20mL溶解，精密加入硫酸滴定液(0.01mol.L-1)15mL，水20mL，甲基红指示液若干滴，用氢氧化钠滴定液(0.02mol.L-1)反滴至黄色，每消耗1mL硫酸滴定液(以乌头碱计)相当于12.9mg乌头碱(C34H47NO11)，经反复测试，此方法生物碱提取完全，结果见表1。结果表明总生物碱含量为0.8~0.9mg.粒-1，此外取其中一批号(20000428)重复测5次，RSD为2.40%。
, 百拇医药 表1 神痛宁胶囊中总生物碱测定结果(n=3)
批 号
称取量
/g
消耗硫酸量/mL
生物碱含量/mg.粒-1
平均含量
/mg.粒-1
981220
5.9998
1.80
0.777
, 百拇医药
5.9975
1.90
0.821
0.820
6.0020
2.00
0.863
20000125
5.9985
2.00
0.864
5.9995
2.10
, http://www.100md.com
0.907
0.892
6.0040
2.10
0.906
20000428
5.9983
1.85
0.800
6.0011
1.90
0.820
0.813
, 百拇医药
6.0014
1.90
0.820
3.2 双酯型生物碱限量检查[1]
3.2.1 色谱条件 色谱柱：YWGC18，，150mm×10µm，流动相：
图3 神痛宁胶囊的高效液相色谱图
a-供试品溶液 b-混合对照品稀释液
1. 中乌头碱 2. 乌头碱 3. 次乌头碱
甲醇-水-四甲基乙二胺(60:40:0.24)，检测波长240nm，流速0.8mL.min-1，柱温40℃，在选定色谱条件下混合对照品稀释液、样品色谱图见图3。
, 百拇医药
3.2.2 标准曲线制备及线性范围 精密称取乌头碱1.70mg，中乌头碱4.54mg，次乌头碱2.70mg，用二氯甲烷配成混合溶液并定容至10mL，为原液，分别吸取原液25，50，100，200，250µL各定容至10mL，即配成混合对照品稀释液，分别标上1至5号，分别吸取上述5种稀释液20µL进样，测定3种生物碱的峰面积，重复进样3次，以平均峰面积对生物碱量(ng)经统计处理，得线性方程：A中乌头碱=535.1C+3043.9 r=0.9996，A乌头碱=1271.3C+2540.3 r=0.9995，A次乌头碱=417.9C+13014.5 r=0.9996。结果表明，中乌头碱在22.7~227ng，乌头碱在8.5~85ng，次乌头碱在13.5~135ng范围内线性关系良好。
3.2.3 重现性试验 取混合对照品稀释液3和4号，分别进样20µL，且于同日每号重复进样5次，测定3种生物碱的峰面积，计算求得日内精密度(RSD)中乌头碱2.35%~3.13%，乌头碱3.36%~4.12%，次乌头碱1.00%~1.22%，于不同日期取3、4号稀释液分别进样20µL，每次分别重复进样3次，依法测得日间精密度(RSD)中乌头碱3.46%~4.37%，乌头碱3.71%~4.85%，次乌头碱1.21%~1.43%。
, 百拇医药
3.2.4 样品的测定 精密称取胶囊内容物1g，加氨试液2mL润湿，30min后加入乙醚20mL，超声提取20min，静置1h，过滤，残渣乙醚振摇洗3次，每次15mL，合并滤液和洗液，50℃水浴挥干，残渣用0.05mol.L-1硫酸溶解过滤，并用0.05mol.L-1硫酸洗容器3次，每次2mL，过滤，洗液与滤液合并，调pH至9~10，移入分液漏斗，用氯仿(15,15,10,10mL)萃取4次，合并氯仿液，水浴挥干，用二氯甲烷将残渣溶解并定容至10mL，作为供试品溶液。取供试品溶液20µl进样，重复3次，测得峰面积取平均值，用外标法计算含量。结果见表2。
表2 神痛宁胶囊内容物双酯型生物碱含量/µg.粒-1
批号 中乌头碱 乌头碱 次乌头碱
981220 6.77 1.23 —
, http://www.100md.com
20000125 9.54 1.37 —
20000428 8.37 1.68 —
3.2.5 加样回收率试验 分别吸取原液200、150µL置两锥形瓶中，挥去二氯甲烷，各自精密加入同一批号(20000125)胶囊内容物1g，按照3.2.4项下供试液制备方法制备成加样供试液，在选定色谱条件下分别取20000125批号胶囊制备的供试液与上述两加样供试液20µL轮流进样，重复5次，测得峰面积以外标法计算含量，并求得平均加样回收率，结果见表3。
表3 加样回收率试验结果(n=5)
供试品 加入量/mg 测得量/mg 平均回收率/% RSD/%
, 百拇医药
中乌头碱 0.0908 0.0883 97.25 2.47
0.0681 0.0650 95.40 2.03
乌头碱 0.0340 0.0336 98.82 1.32
0.0255 0.0258 101.20 0.83
次乌头碱 0.0540 0.0546 101.10 0.93
0.0405 0.0404 99.75 2.28
以中乌头碱为代表，平均加样回收率95.40%~97.25%，RSD为2.03%~2.47%。
, 百拇医药
3.3 其它 符合中华人民共和国药典2000版一部附录胶囊剂项下有关规定。
4 讨论
定性鉴别独活时，起先由于样品总样量少(2µL)，荧光斑点不明显，因此加大点样量至5µL，结果荧光斑点明显。
测定双酯型生物碱含量时，由于测得含量很低，如中乌头碱最高9.54µg/粒，但文献报导具抗炎镇痛作用的双酯型生物碱中乌头碱、乌头碱、次乌头碱口服0.2mg可致中毒[2]，因此为了保证临床用药安全有效，质量标准中应做毒性成分限量检测。
图2中2-供试品为样品提取物，所以有独活标准对照药材所没有的成分斑点,但可能由于药品生产导致某些成分损失或减少,以致供试品中缺少一个应有的与独活标准对照药材相对应的成分斑点。表2中次乌头碱由于含量极低，本实验制定的测定方法无法测到。
[作者简介] 丁青龙(1953-),男,副主任药师,主要研究方向:中药制剂的研制与开发。联系电话：(0519)8103919-2059。
[参考文献]
[1] 彭波. 反相离子对高效液相色谱法分离测定川乌和附片中乌头类生物碱的方法研究[J].药物分析杂志，1995，15(6):13-16.
[2] 沈映君.《中药药理学》[M].上海:上海科学技术出版社，1998.99., http://www.100md.com
(1解放军第102医院 常州 213003, 2南京中医药大学 南京 210029)
[摘要] 目的：对神痛宁胶囊进行质量标准研究。方法：采用生物碱沉淀反应鉴别生物碱，采用TLC法鉴别主药独活及青风藤中的青藤碱，用酸碱中和滴定法测定药物中总生物碱含量，用反相-HPLC对毒性成分(以中乌头碱为代表)进行限量检查。结果：TLC鉴别斑点分离度好，斑点清楚，总生物碱含量为0.8~0.9mg/粒，用同一批号重复测5次，RSD为2.40%，毒性成分(以中乌头碱为代表)最高含量为9.54µg/粒，平均回收率95.40%~97.25%，RSD为2.03%~2.47%。结论：此方法简便，重现性好，结果可靠，可有效地控制制剂质量。
[关键词] 神痛宁胶囊; 乌头碱; HPLC; 质量控制
[中图分类号] R289.5 [文献标识号]B [文章编号]1003-3734(2001)-200466
, 百拇医药
Study of the criteria of Shentongning Capsules
DING Qing-long1, HUANG Yin-tao2, LIU Gui-yong1
(1 The 102 Hospital of PLA, Changzhou 213003,China; 2 Nanjing Traditional Medical University,Nanjing 210029,china)
[Abstract] Objective: To establish criteria for Shentongning capsules. METHODS: The alkaliods were detecteded by gravimetric precipitation reaction; the kukoline in Orientvine and radix angelicae tuhuo were detected by TLC method,and the total alkoloids in the product was determined by RP-HPLC.RESULTS: The alkaliods were clearly separated by TLC method. The total alkaloids content per capsule obtained was 0.8-0.9mg with a RSD of 2.40%, and the maximum content of toxic components per capsule was 9.54ug with a mean recovery 95.40%~97.25% and a RSD of 2.03%~2.47%. CONCLU-SIONS: A simple, reproducible and reliable method for quality control of shengtongning capsule is established.
, 百拇医药
[key words] shentongning capsule; kukoline; HPLC; quality control
[参考文献]
[1] 彭波. 反相离子对高效液相色谱法分离测定川乌和附片中乌头类生物碱的方法研究[J].药物分析杂志，1995，15(6):13-16.
[2] 沈映君.《中药药理学》[M].上海:上海科学技术出版社，1998.
>：对神痛宁胶囊进行质量标准研究。方法：采用生物碱沉淀反应鉴别生物碱，采用TLC法鉴别主药独活及青风藤中的青藤碱，用酸碱中和滴定法测定药物中总生物碱含量，用反相-HPLC对毒性成分(以中乌头碱为代表)进行限量检查。结果：TLC鉴别斑点分离度好，斑点清楚，总生物碱含量为0.8~0.9mg/粒，用同一批号重复测5次，RSD为2.40%，毒性成分(以中乌头碱为代表)最高含量为9.54µg/粒，平均回收率95.40%~97.25%，RSD为2.03%~2.47%。结论：此方法简便，重现性好，结果可靠，可有效地控制制剂质量。
, 百拇医药
[关键词] 神痛宁胶囊; 乌头碱; HPLC; 质量控制
[中图分类号] R289.5 [文献标识号]B [文章编号]1003-3734(2001)-200466
Study of the criteria of Shentongning Capsules
DING Qing-long1, HUANG Yin-tao2, LIU Gui-yong1
(1 The 102 Hospital of PLA, Changzhou 213003,China; 2 Nanjing Traditional Medical University,Nanjing 210029,china)
[Abstract] Objective: To establish criteria for Shentongning capsules. METHODS: The alkaliods were detecteded by gravimetric precipitation reaction; the kukoline in Orientvine and radix angelicae tuhuo were detected by TLC method,and the total alkoloids in the product was determined by RP-HPLC.RESULTS: The alkaliods were clearly separated by TLC method. The total alkaloids content per capsule obtained was 0.8-0.9mg with a RSD of 2.40%, and the maximum content of toxic components per capsule was 9.54ug with a mean recovery 95.40%~97.25% and a RSD of 2.03%~2.47%. CONCLU-SIONS: A simple, reproducible and reliable method for quality control of shengtongning capsule is established.
, 百拇医药
[key words] shentongning capsule; kukoline; HPLC; quality control
神痛宁胶囊是由制川乌、制草乌、青风藤、独活、木瓜、红花、当归、党参8味中药组成，有散寒除湿、祛风止痛、活血通络的功效。为控制该制剂质量，用生物碱沉淀反应对生物碱及TLC法对该处方中独活、青风藤中青藤碱进行鉴别，用酸碱滴定法测定有效成分总生物碱含量以及反相-HPLC法对毒性成分双酯型生物碱(以中乌头碱为代表)进行限量检查，结果满意。
1仪器与试药
分析天平(上海天平仪器厂)，PHS-3D型pH计(上海三信电讯厂)，939薄层制板器(重庆市南岸贝尔德仪器技术厂)，METTLER-AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，SB5200超声提取器(上海必能信超声有限公司)，高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)。乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、青藤碱对照品(中国药品生物制品检定所)，独活对照药材(南京中医药大学王春根教授鉴定)，神痛宁胶囊(批号981220，20000125，20000428，解放军第102医院制剂中心提供)，硅胶G(青岛海洋化工厂)，甲醇(色谱纯)，其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 定性鉴别
2.1 性状鉴别 本品为胶囊剂，内容物棕色至棕褐色颗粒，气微，微苦。
2.2 层析板制备 称取硅胶G 16g，加0.5%CMC-Na(内含0.5%NaOH)48mL(1:3)研磨15min，于939薄层制板器上铺成厚度为0.3mm的薄层层析板，待干后置电热恒温箱中105℃活化1h，取出置干燥器中备用。
2.3 青藤碱鉴别 取胶囊内容物3.5g，加无水乙醇30mL，水浴加热回流30min，过滤，滤液蒸干，残渣加盐酸(1→50)15mL溶解，过滤，滤液加氨试液调pH至9，转入分液漏斗，加氯仿萃取2次(10mL.次-1)，分取氯仿层，蒸干，残渣加无水乙醇1mL溶解作为供试品溶液，另取青藤碱对照品，加无水乙醇制成1mg.mL-1对照品溶液。吸取上述两种溶液各5µL，分别点于同一块已制好的薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-水(2:4:2:1)为展开剂(饱和15min)展开，取出晾干，喷碘化铋钾试液，在与对照品相应位置上显相同颜色(橙红)的斑点，见图1。
, 百拇医药
2.4 独活鉴别：取胶囊内容物3.5g，加无水乙醇20mL水浴加热回流15min过滤，滤液蒸干，残渣加氯仿2mL作为供试品溶液。另取独活对照品药材2g，同法制成对照品溶液。吸取供试品溶液5µL，对照品溶液2µL，分别点于同一已制好的薄层板上，以正己烷-苯-醋酸乙酯(2:1:1)为展开剂(饱和15min)展开取出晾干，置紫外灯(365nm)下检视，供试液色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同的颜色斑点。见图2。
图1 薄层色谱图 图2 薄层色谱图
1-青藤碱标准品 1-独活标准对照药材
2-供试品 2-供试品
2.5 生物碱沉淀反应 取2.3项下点样后剩余供试品液，蒸干残渣加盐酸(1→50)5mL溶解，于一试管中滴加碘化铋钾试液2滴即生成橙红色沉淀，一管中加碘化汞钾2滴即生成淡黄色沉淀，另一管中加硅钨酸试液2滴，即生成灰白色沉淀。
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3 含量测定
3.1 总生物碱含量测定 精密称取胶囊内容物6g加无水乙醇50mL加热回流30min，过滤，药渣再加无水乙醇50mL回流20min，过滤，药渣用无水乙醇洗4次(15mL.次-1)，过滤，洗液滤液合并，蒸至快干，残渣用0.05mol.L-1硫酸10mL溶解，过滤，容器用0.05mol.L-1硫酸洗3次(5mL.次-1)，过滤，洗液和滤液合并，用氨试液调pH至9，转入分液漏斗，用氯仿萃取4次(20mL.次-1)，合并氯仿液，蒸干，残渣加无水乙醇20mL溶解，精密加入硫酸滴定液(0.01mol.L-1)15mL，水20mL，甲基红指示液若干滴，用氢氧化钠滴定液(0.02mol.L-1)反滴至黄色，每消耗1mL硫酸滴定液(以乌头碱计)相当于12.9mg乌头碱(C34H47NO11)，经反复测试，此方法生物碱提取完全，结果见表1。结果表明总生物碱含量为0.8~0.9mg.粒-1，此外取其中一批号(20000428)重复测5次，RSD为2.40%。
, 百拇医药 表1 神痛宁胶囊中总生物碱测定结果(n=3)
批 号
称取量
/g
消耗硫酸量/mL
生物碱含量/mg.粒-1
平均含量
/mg.粒-1
981220
5.9998
1.80
0.777
, 百拇医药
5.9975
1.90
0.821
0.820
6.0020
2.00
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20000125
5.9985
2.00
0.864
5.9995
2.10
, http://www.100md.com
0.907
0.892
6.0040
2.10
0.906
20000428
5.9983
1.85
0.800
6.0011
1.90
0.820
0.813
, 百拇医药
6.0014
1.90
0.820
3.2 双酯型生物碱限量检查[1]
3.2.1 色谱条件 色谱柱：YWGC18，，150mm×10µm，流动相：
图3 神痛宁胶囊的高效液相色谱图
a-供试品溶液 b-混合对照品稀释液
1. 中乌头碱 2. 乌头碱 3. 次乌头碱
甲醇-水-四甲基乙二胺(60:40:0.24)，检测波长240nm，流速0.8mL.min-1，柱温40℃，在选定色谱条件下混合对照品稀释液、样品色谱图见图3。
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3.2.2 标准曲线制备及线性范围 精密称取乌头碱1.70mg，中乌头碱4.54mg，次乌头碱2.70mg，用二氯甲烷配成混合溶液并定容至10mL，为原液，分别吸取原液25，50，100，200，250µL各定容至10mL，即配成混合对照品稀释液，分别标上1至5号，分别吸取上述5种稀释液20µL进样，测定3种生物碱的峰面积，重复进样3次，以平均峰面积对生物碱量(ng)经统计处理，得线性方程：A中乌头碱=535.1C+3043.9 r=0.9996，A乌头碱=1271.3C+2540.3 r=0.9995，A次乌头碱=417.9C+13014.5 r=0.9996。结果表明，中乌头碱在22.7~227ng，乌头碱在8.5~85ng，次乌头碱在13.5~135ng范围内线性关系良好。
3.2.3 重现性试验 取混合对照品稀释液3和4号，分别进样20µL，且于同日每号重复进样5次，测定3种生物碱的峰面积，计算求得日内精密度(RSD)中乌头碱2.35%~3.13%，乌头碱3.36%~4.12%，次乌头碱1.00%~1.22%，于不同日期取3、4号稀释液分别进样20µL，每次分别重复进样3次，依法测得日间精密度(RSD)中乌头碱3.46%~4.37%，乌头碱3.71%~4.85%，次乌头碱1.21%~1.43%。
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3.2.4 样品的测定 精密称取胶囊内容物1g，加氨试液2mL润湿，30min后加入乙醚20mL，超声提取20min，静置1h，过滤，残渣乙醚振摇洗3次，每次15mL，合并滤液和洗液，50℃水浴挥干，残渣用0.05mol.L-1硫酸溶解过滤，并用0.05mol.L-1硫酸洗容器3次，每次2mL，过滤，洗液与滤液合并，调pH至9~10，移入分液漏斗，用氯仿(15,15,10,10mL)萃取4次，合并氯仿液，水浴挥干，用二氯甲烷将残渣溶解并定容至10mL，作为供试品溶液。取供试品溶液20µl进样，重复3次，测得峰面积取平均值，用外标法计算含量。结果见表2。
表2 神痛宁胶囊内容物双酯型生物碱含量/µg.粒-1
批号 中乌头碱 乌头碱 次乌头碱
981220 6.77 1.23 —
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20000125 9.54 1.37 —
20000428 8.37 1.68 —
3.2.5 加样回收率试验 分别吸取原液200、150µL置两锥形瓶中，挥去二氯甲烷，各自精密加入同一批号(20000125)胶囊内容物1g，按照3.2.4项下供试液制备方法制备成加样供试液，在选定色谱条件下分别取20000125批号胶囊制备的供试液与上述两加样供试液20µL轮流进样，重复5次，测得峰面积以外标法计算含量，并求得平均加样回收率，结果见表3。
表3 加样回收率试验结果(n=5)
供试品 加入量/mg 测得量/mg 平均回收率/% RSD/%
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中乌头碱 0.0908 0.0883 97.25 2.47
0.0681 0.0650 95.40 2.03
乌头碱 0.0340 0.0336 98.82 1.32
0.0255 0.0258 101.20 0.83
次乌头碱 0.0540 0.0546 101.10 0.93
0.0405 0.0404 99.75 2.28
以中乌头碱为代表，平均加样回收率95.40%~97.25%，RSD为2.03%~2.47%。
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3.3 其它 符合中华人民共和国药典2000版一部附录胶囊剂项下有关规定。
4 讨论
定性鉴别独活时，起先由于样品总样量少(2µL)，荧光斑点不明显，因此加大点样量至5µL，结果荧光斑点明显。
测定双酯型生物碱含量时，由于测得含量很低，如中乌头碱最高9.54µg/粒，但文献报导具抗炎镇痛作用的双酯型生物碱中乌头碱、乌头碱、次乌头碱口服0.2mg可致中毒[2]，因此为了保证临床用药安全有效，质量标准中应做毒性成分限量检测。
图2中2-供试品为样品提取物，所以有独活标准对照药材所没有的成分斑点,但可能由于药品生产导致某些成分损失或减少,以致供试品中缺少一个应有的与独活标准对照药材相对应的成分斑点。表2中次乌头碱由于含量极低，本实验制定的测定方法无法测到。
[作者简介] 丁青龙(1953-),男,副主任药师,主要研究方向:中药制剂的研制与开发。联系电话：(0519)8103919-2059。
[参考文献]
[1] 彭波. 反相离子对高效液相色谱法分离测定川乌和附片中乌头类生物碱的方法研究[J].药物分析杂志，1995，15(6):13-16.
[2] 沈映君.《中药药理学》[M].上海:上海科学技术出版社，1998.99., http://www.100md.com