肝纤维化
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【概述】
肝纤维化是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果。纤维增生是机体对于损伤的一种修复反应，各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化，从许多慢性肝病，特别是慢性病毒性肝炎的临床及病理演变来看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，二者难以截然分开。
【治疗措施】
抗纤维化的治疗旨在减轻纤维化的程度、延缓其发展，乃至逆转其病理进程。为此抗纤维化的治疗应包括：①针对致病因子，治疗原发病。如抗肝炎病毒，治疗血吸虫病，防治酒精中毒等；②对抗肝纤维化发生发展的治疗；③如已发展至肝硬化，则需对其合并症进行防治；④对症及恢复肝功能的治疗。
肝纤维化是多种病因发展为肝硬化的共同病理基础，近年来，随着对肝纤维化机制的深入了解，特别是ECM的合成与降解的分子生物学的深入了解，许多研究工作设想在ECM代谢，尤其胶原合成与降解各环节上采取治疗措施，现将其中主要的分述于下。
一、抑制胶原合成
1.干扰素
γ-干扰素能抑制贮脂细胞的激活、增殖、降低α-Actin，Ⅰ、Ⅳ型胶原及纤维连结蛋白的mRNA稳态水平，国外有临床报道小剂量应用副作用轻微，治疗肝纤维化可能有效。α-干扰素有抗病毒作用，且能使慢性丙肝患者组织中Ⅰ型胶原mRNA及TGF-βmRNA降低，肝纤维化减轻，但在另一方面，γ-干扰素又能启动巨噬细胞生成IL-1、TNF-α，后两者能刺激贮脂细胞的DNA合成与增殖。它可能不利于肝纤维化。这两方面作用的净效应如何，尚需进一步观察。
2.肾上腺皮质激素
实验上见到，它在细胞培养及整体动物中抑制Ⅰ型胶原mRNA的表达，使肝细胞及成纤维细胞内Ⅰ型胶原mRNA水平降低，从而抑制胶原的合成。但因长期应用全身副作用较多，很少用于抗肝纤维化治疗。治疗自身免疫性慢性肝炎，虽可致临床缓解，但并不能阻止纤维化的形成。
3.前列腺素类似物
前列腺素有广泛的生物活性。已知在胆碱缺乏性大鼠，16，16-Dimethy1 Prostanglandin E2(DEMG)能减少纤维化及脂肪沉积，机制可能是抑制肝内Ⅰ型胶原mRNA的表达。又有工作说明它可增加细胞内cAMPR从而增加细胞内降解。同时能增加肝血流、改变膜流动性，改变血中胰岛素及胰高血糖素的水平。抑制巨噬细胞释放炎性因子。但目前尚未用于人的肝纤维化。
4.类视黄醇类物质(Retinoids)
此类药物反式维甲酸(Trans-retinoic Acid)和顺序式维甲酸(B-cis-retinoic Acid)，减少Ⅰ型胶原及其mRNA的合成，减少单核细胞分泌胶原酶，但因它又是Ito细胞内含物，故有增加Ⅰ型或Ⅲ型胶原的可能，不见得宜于治疗肝纤维化。
5.前胶原肽
已知前胶原两端肽(非球形伸展部)可由特殊的肽酶所切断，切下来的肽，如氨基础肽(即PⅢP)可反馈地抑制前胶原合成。在正式应用之前，尚需进行详尽的分子生物学研究，目前无有关用它治疗的报道。
二、作用于前胶原mRNA转译后的环节
1.秋水仙碱(Colchicine)
此药曾在国内外试用于临床。实验研究提示：秋水仙碱是抗微管药物，抑制微管蛋白聚合，从而干扰细胞的胶原分泌。它还能刺激胶原酶的活性，增强降解，又能作用于巨噬细胞，抑制单核细胞因子，抑制生长因子的释放，减少白细胞介素Ⅰ的分泌。Kershenobich和Rojkind等对秋水仙碱治疗肝硬化做了多年的观察。他们采取了随机、双盲、安慰剂对照的方法。在14年中随访观察了100例肝硬化患者(54例为酒精性，41例为肝炎性，14例为其他原因所致)。观察结果表明，中位存活时间治疗组为11年，安慰剂组为3.5年(P=0.0006)。10年累积生存率分别为56%和20%(P=0.0006)。治疗组30例，曾作连续肝活检，其中9例有组织学的好转，而安慰剂组14例做了连续肝活检，无1例好转(P=0.002)，此一研究提示秋水仙碱对延长存活率有一定作用。但其他一些临床研究不能证实这一结果，如曾有人(1987，1988)用秋水仙碱治疗原发性胆汁性逐步形成硬化，见其未能阻止肝纤维化的进展。Wang Y.C.(1994)曾用双盲随机对照的方法治疗乙型肝炎肝硬化100例，与对照组相比较，无论肝组织学改变、血清纤维化指标、病情发展以及病死率等方面，秋水仙碱组均未见疗效。看来本品在抗纤维化治疗上希望不大。
2.脯氨酸-4-羟化酶抑制物
实验证明它能抑制脯氨酸的羟化，减少羟脯氨酸的形成，因而减少前胶原三股螺旋α肽链的稳定性。曾有两个吡啶化合营企业物，Pyridine 2，4-dicarboxylate(2，4-PDCA)和Pyridine2，5-dicarboxylate，于动物实验有抗肝纤维化的效果，但因副作用已中止临床试验。
3.金属离子络合剂
双吡啶(αα'-dipyridy1)能络合铁离子而抑制脯氨酸羟化酶的活性，使新合成的胶原α-肽链因羟化受抑不能形成三股螺旋而在细胞内被释放；最近又发现它能降低Ⅰ型胶原mRNA的稳定性从而使胶原合成减少。其抗纤维化作用尚待进一步研究证实。D-青化酶胺是铜离子络合剂，而铜离子是赖胺酰氧化酶的重要辅助因子，故本药能抑制该酶的活性，使新分泌出来的胶原不能相互交联；它对肝豆状核变性有较好的疗效，但对其他原因所致的人类及动物肝纤维化无明显疗效，且长期应用副作用较大。
4.脯氨酸类似物(Proline Analogs)
此类化合物有吖丁啶(Azetidine Carboxylicacid)，顺-4-羟基脯氨酸等，它可取代脯氨酸而结合到前胶原中，形成非螺旋胶原。这种胶原易为蛋白酶水解，以致细胞外基质的形成减少。目前仅在大鼠体内作过实验见到减少胶原的效果。其毒性较大，也尚未试用于人。
5.前胶原向胶原转化的抑制物
其基本作用为阻止切断前胶原分子两端的肽，以致不能形成胶原分子，且使胶原稳定性受损，首先试用的是精氨酸及其类似物(Convanine)，尚未用于动物实验及人体治疗。
6.山黧豆素(Lathyrogen)
其中含β-氨基丙腈及氨基乙腈，能抑制赖氨酰氧化酶的活性，阻止胶原纤维的架桥连结，对肝纤维化目前仅限于实验研究，尚未用于人的肝纤维化。
三、促进胶原降解的治疗
目前对促进胶原酶活性药物的研究仅处于起步阶段。但本类药物的临床意义重大，因为促进过度沉积之胶原的降解就有可能逆转已经形成的肝纤维化。Lieber C.S等报道不饱和卵磷脂(PUL)能减轻狒狒的酒精性肝硬化，进一步经体外细胞培养研究发现它对Ⅰ型前胶原mRNA的表达无影响，但能使贮脂细胞的胶原酶活性升高一倍。这提示促进降解活性可能是PUL治疗狒狒酒精性肝纤维化的作用机制。目前正在进行多中心的临床实验。
四、基因治疗
Wu CH等报道，用反义寡核苷酸(ASO)DNA，以乏涎粘蛋白多赖氨酸(AsORPL)为载体，导向作用于3-T-AsGR细胞，见到ASOE及ASOC能分别抑制Ⅰ型前胶原mRNA的73%及67%。这一工作为基因治疗抗肝纤维休开阔了前景。
从上述看来，尽管在胶原代谢各项环节均有治疗的实验性研究，但确立一个有效而副作用少的治疗药物尚须长期努力。
五、中医中药的治疗
新中国建立以来，应用祖国医学治疗慢性肝病有了很大发展，其中与抗纤维化或治疗肝硬化有关的实验与临床研究有：强肝软坚汤(韩经寰，1979)，葫芦素B、齐墩果酸(韩德五，1979、1981)、甘草甜素与甘草次酸(赵敏琦等，1983)、丹参等药(王桢苓等，1982)、虫草菌丝、丹参(马学惠等，1988)、桃仁及冬虫夏草(王玉润、刘平、刘成、1985，1991)、田三七(肖家诚，1988)、复方丹参合剂(王宝恩等，1990)、血腑逐瘀汤(宋家武，李绍白，1991)、复肝康冲剂(杨正云等，1990)、补肾益精、益气养阴、清热解毒诸方(范宗滂等，1991)、虫草菌丝(张立煌等，1992)、软肝冲剂(李延福，1992)等。近年研究表明：病理证实的轻度慢性肝炎中62.6%有肝纤维化，中度、重度慢性肝炎及肝硬化则100%有肝纤维化，因而中医中药治疗肝纤维化，当从慢性肝炎及肝硬化的整体辨证入手，以病机为基础，制定理、法、方、药。
在祖国医学文献中本无慢性肝炎及肝硬化之病名，而是包括在“黄疸”、“胁痛”、“淤血”、“症积”和“臌胀”诸病证之中。近代中医的研究认为慢性肝炎及早期肝硬化系因湿热之邪未清，缠绵日久，伤及脏腑、气血。因邪伏血分正气亏损而肝气郁结，血淤血滞。正气不行，痰浊胶结加之气虚血淤则促成症积。肝病既久，乘脾犯胃，升降失司，气机衰微，又加重血虚气虚。进而病久及肾，导致肝肾阴虚或脾肾阳虚。以致肝、脾、肾俱损，气、血、水搏结。有的中医专家指出：总结病机之中心环节：气虚血滞为肝硬化之本，湿毒热邪稽留血分为标，肝无血养而失柔，肾无清填而失润。治则要以活血益气、养血柔肝为基础，兼及滋补肝肾或温补脾肾，如余邪未清，佐以祛邪。
基于上述，近年对慢性肝炎及早期肝硬化之中医治疗多以活血化淤的法则为主，兼以益气补虚、养血柔肝或滋补肝肾。
马学惠、韩德五等经系列实验研究表明丹参对动物实验性急性肝损伤有减轻肝细胞变性、坏死，降低谷丙转氨酶，降脂及增加肝糖原的作用。对肝部分切除动物可促进肝细胞再生。对实验性肝纤维化能防止肝硬化发生并有促进肝内胶原重吸收的作用，又见对实验性急性肝衰竭有防治作用。其机制可能是减轻内源性内毒素血症，增强Kupffer细胞的功能；防止自由基的产生，减轻脂质过氧化；稳定肝细胞膜及细胞器膜；增加肝脏药酶及防止Ca++内流等。在实验性肝纤维化、肝硬化观察到丹参能降低血清透明质酸水平，减少动物肝内胶原蛋白含量及Fn、Ln的产生。
王玉润、刘平、刘成等用桃仁提取物合并虫草菌丝治疗血吸虫病肝纤维化，以PⅢP、血、尿羟脯氨酸、肝组织胶原酶等作为观察指标，结果表明在病原(即血吸虫)得到治疗后，本治疗对肝纤维化患者肝内胶原分解代谢有一定促进作用。
本章作用王宝恩等以丹参为主的活血化淤中药复方对实验性肝纤维化进行观察治疗。见活血化瘀中药对CCL4中毒性损伤以及白蛋白免疫损伤性肝纤维化均有防治效果，应用此药可不同程度地减轻肝纤维化的发展，也可使已形成肝硬化者纤维化明显逆转。病理组织学观察表明活血化淤复方能抑制纤维结缔组织中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原的增生和沉积，阻止其沿小叶间及向小叶内延伸。与此同时，实验室研究还观察到，此活血化淤复方不论预防性用药或治疗性用药均有明显提高肝纤维化大鼠肝组织及血清胶原酶活性的作用，并可提高肝组织中活性胶原酶与潜在胶原酶的活性的比值。说明降解活性的增高为活血化淤中药抗纤维化机制的又一重要方面。至于此中药复方的作用部位，经分子生物学研究，因其能抑制肝组织Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，在体外能抑制培养的贮脂细胞Ⅳ型胶原mRNA的表达。说明中药作用部位在于胶原基因的转录水平。于慢性肝炎及肝硬化患者临床应用，也有较好效果。表现在治疗后症状消失或减轻、脾脏缩小，门脉直径增宽减轻。转氨酶升高者73%恢复正常。血清PⅢP、Ln含量由增高回降到正常。提示本方是一抗纤维化的有效方剂。
除活血化淤法则以外，也有其他法则治疗有效的实验研究，如用补肾益精、益气养阴及清热解毒等法则的中药对大鼠肝纤维化均有程度不等的治疗作用。
从国内大量工作看来，中医中药治疗肝纤维化有很大潜力，应予以重视。
【病因学】
肝纤维化的发生机制
肝脏贮脂细胞是产生各种细胞外基质的主要来源。在肝脏纤维化的发生和发展过程中贮脂细胞激活转化为肌成纤维细胞样细胞(Myofibrblast-like cells)和成纤维细胞(Fibroblast)，因而贮脂细胞的激活过程已成为肝纤维化发生机制研究的焦点之一。调节贮脂细胞的因子可分为不溶性和可溶性两类，前者为各种细胞外基质，后者包括各种生长因子、细胞因子。
正常肝脏血窦内皮下的功能性基底膜(Ⅳ型胶原和层连蛋白)对于维持贮脂细胞的静止状态(贮存Vit. A，分泌Ⅳ型胶原)起重要作用，一旦基底膜遭到破坏，贮脂细胞的表型即可发生改变。
调节贮脂细胞的细胞因子和生长因子很多。能够促进其增殖的有PDGF，EGF，IGF-1,FGF-2，TGF-α；能抑制其增殖的有视黄醇和维甲酸及内皮素；TGF-β本身对贮脂细胞的生长有抑制作用，但通过刺激PDGF和FGF-2的表达又可促进其生长。在这些细胞因子中以TGF-β1和PDGF研究得较为深入。在肝脏中TGF-β1主要由贮脂细胞、Kupffer细胞、内皮细胞、血小板及肝细胞产生，通过旁分泌对其他细胞发生调节作用。TGF-β1可促进贮脂细胞表达和分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、细胞粘合素、软骨连接蛋白、血栓粘合素、Biglycan及Decrin。而且还可通过自分泌作用促进TGF-β1自身的表达，它对金属基质蛋白酶(胶原酶、基质分解素)和纤溶酶原激活物的表达有抑制作用，而且可促进内皮细胞和贮脂细胞表达纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)。因此，TGF-β1是目前发现的最重要的致纤维化细胞因子。PDGF可由多种细胞产生。是一种很强的致有丝分裂原，通过α和β型受体对贮脂细胞的增殖有促进作用，而且TGF-β1可加强这一作用；它本身对细胞外基质的表达无明显影响。TNF-γ是由淋巴细胞产生的，它对贮脂细胞的激活、生长和胶原分泌有抑制作用。在肝脏ET-1主要由血窦内皮细胞和激活的贮脂细胞产生。贮脂细胞表达高水平的ET-1受体，通过旁分泌和自分泌作用引起激活的贮脂细胞和胶原纤维束的收缩，从而导致血窦的血流改变和肝小叶结构扭曲。贮脂细胞激活的三阶段假学。
一、炎症前阶段(Preinflammatory Phase)
当肝实质受损伤时，细胞膜通透性增加，释放出“损伤激素”(Wound Hormone)，通过旁分泌作用激活贮脂细胞。体外实验表明，大鼠肝细胞可释放促进贮脂细胞增殖的细胞因子-肝细胞性Ito细胞启动因子(Hepitoin，Hepatocellular Ito Cell Initiator)。同时肝脏间质的损伤如果破坏了血窦内皮下的功能基底膜，亦可促进贮脂细胞的表型改变而使其激活。
二、炎症阶段(Inflammatory Phase)
由于肝实质损伤，Kupffer细胞和单核巨噬细胞、淋巴细胞、血小板被激活而释放出各种的炎症性介质和细胞因子，如急性期蛋白(IL-1，IL-6，TNF-α)和TGF-1，EGF，PDGF，TGF-α，TGF-β等。这些因子也是通过旁分泌途径促进贮脂细胞的增殖及纤维增生。此阶段贮脂细胞受Kupffer细胞分泌的某种细胞因子诱导而表达出PDGF受体，对PDGF发生反应而增殖活化为肌成纤维细胞样细胞。TGF-β不仅能增加PDGF对贮脂细胞的增殖作用，而且能促进其表达和分泌各种细胞外基质并抑制其降解。
三、炎症后阶段(Postinflammatory Phase)
在上述两个阶段经旁分泌途径激活的贮脂细胞表达大量的TGF-α，TGF-β，FGF及其受体，通过自分泌作用不断刺激自身的分裂增殖并大量合成和分泌胶原等各种细胞外基质。同时还可通过旁分泌作用激活其他尚处于“静止”状态的贮脂细胞。这一机制可解释即使原发的刺激因素解除，肝纤维化过程仍能继续发展的现象。
在上述各个阶段中基质降解酶的作用可归纳为：贮脂细胞分泌的Ⅳ型胶原酶破坏正常的血窦内皮下功能性基底膜，促进其增殖和活化；TGF-β抑制间质性胶原酶的活性，刺激TIMP的活性，因而促进细胞外基质的沉积。
【病理改变】
肝纤维化(Fibrosis)是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生(Fibrogenesis，即细胞外基质合成增加)和纤维分解(Fibrolysis，即细胞外基质降解)不平衡的结果。纤维增生是机体对于损伤的一种修复反应，一旦有害因素去除、细胞外基质成分得到恢复则纤维增生停止。所以急性或一过性肝脏疾患即使很严重也不会导致肝纤维化。但各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化，向前发展发生肝小叶结构的破坏及结节形成即成为肝硬化。从肝硬化的病理学的定义来看，仅有弥漫性肝纤维化而无结节形成(如先天性肝纤维化，心力衰竭所致的肝腺泡第三区纤维化)不能称为肝硬化；仅有结节形成而无弥漫性肝纤维化(如局灶性结节性肝细胞增生，结节性肝细胞再生性增生)也不是肝硬化。但是从许多慢性肝病，特别是慢性病毒性肝炎的临床及病理演变来看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，二者难以截然分开。近年来随着细胞生物学和分子生物学的迅速发展，人们对肝脏细胞外基质的组成、代谢及其生物学功能的认识不断深入，因而对肝纤维化的发生机理、诊断和治疗的研究也有了较大的进展。
一.细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的组成及其代谢和生物学功能
细胞外基质一般包括胶原、非胶原糖蛋白、蛋白多糖及弹性硬蛋白。按照最新的观点，ECM还应包括间质金属蛋白酶(MMP)，金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)，基质粘附分子(即细胞外基质受体)，以及与间质成分大分子结合的各种生长因子和细胞因子。现在认为ECM不是杂乱无章、仅起支架作用的静态物质，而是组织有序、代谢活跃，且对细胞、组织和器官的形态、生长、分化和代谢等结构和功能有重要影响的生命分子。
(一)胶原(Collagen)
胶原是细胞外基质的最重要成分，目前已发现至少19型基因序列不同的胶原。在肝脏总含量较高的有5型，分别为Ⅰ型33%，Ⅲ型33%，Ⅳ型1%，Ⅴ型1%～10%，Ⅵ型0.1%～1%。正常人肝脏的胶原含量约为5.5mg/g肝湿重，Ⅰ/Ⅲ型胶原的比为1:1；肝纤维化和肝硬化时肝脏胶原含量可增加数倍，且Ⅰ/Ⅲ型的比值增加，到后期此比例可增至2.38。根据胶原的形态和结构特点及分布部位，可分为两大类：①纤维性胶原：包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型，Ⅴ型胶原：去除C端肽后分布于血窦周围和门脉区，作为核心使Ⅰ、Ⅲ型胶原形成粗大的纤维。Ⅵ型胶原呈串珠样结构分布于Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型胶原形成的纤维束之间起粘附作用。②基底膜性胶原：即Ⅳ型胶原，它的端肽不去除而是借此相连形成三维网格状结构，主要分布于肝血窦内皮下，为肝细胞和内皮细胞功能基底膜的主要成份。胶原的合成步骤包括基因转录、翻译、翻译后修饰(羟基化和糖基化)形成α肽链，三条α链形成三螺旋即胶原的基本单位-前胶原(Precollagen)，经微管排泌到细胞外切去N端和C端肽后相互交联形成胶原纤维或网格状结构。
(二)非胶原糖蛋白(Noncollagenous Glycoproteins)
是细胞外基质的另一重要组分，其分子中的多个功能区可与其他细胞外基质及多种细胞膜的跨膜蛋白受体结合，从而影响细胞的生长、分化、代谢等各种生物学行为。其种类很多，现择要列举如下：
1.纤维连结蛋白质(Fibrnectin)
可分为血浆性(可溶性)和细胞性(不溶性)，前者主要由肝细胞产生，后者主要由贮脂细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞产生。在肝纤维化早期其含量增多，作为以后胶原沉积的支架。
2.层连蛋白(Laminin)
是由三个亚单位(一条α链和两链β链)组成的“十”字型结构，其分子内部有可与细胞表面受体和肝素结合的功能区。它和Ⅳ型胶原一起构成基底膜的主要成份，分布于血管、胆管基底膜上，肝血窦内皮下亦有少量分布，这对于维持细胞的分化状态有重要意义。
3.细胞粘合素(Tenascins,Cytotactin,Bronionectin,Hexabronchions)
是由6个相同的亚单位组成的六聚体，由贮脂细胞产生。肝纤维化是沉积于细胞损伤严重的区域，如中央静脉周围和细的纤维间隔中，可能在早期ECM的沉积中起作用。
4.粗纤维调节素(Undulin)
由3个亚基组成，其单体和层连蛋白相似，但少一个短臂，主要分别于紧密排列的Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维中，它对维持胶原的超分子结构起重要作用，其细胞来源尚不明了。
5.血栓粘合素(Thrombospondin)
由3个相同亚基的末端在中央形成一个小球体，能结合肝素、Ⅴ型胶原、纤维连结蛋白、血浆纤溶酶原和纤维蛋白原。其功能是防止细胞扩散。
6.副纤维连接蛋白(Vitronection,VN)
由肝细胞产生，其分布与纤维连接蛋白相似，具有结合胶原的功能。肝硬化时分布于胶原纤维沉积的部位。血浆VN水平和肝纤维化程度有一定的相关性。
7.副层连蛋白(Entactin,Nidogen)
呈不对称哑铃形，它可与层连接蛋白中心部位特异性以共价键结合，从而调节后者与其受体的结合。其分布和层连蛋白的单位相似，主要分布于基底膜。
(三)蛋白多糖(Proteoglycan)
蛋白多糖是一类由蛋白质作核心骨架，在N或O位上连有糖胺多糖(
Glycosaminoglycan,GAG)侧链的大分子物质，它们与胶原一起分布于细胞外基质和基底膜上，同时也分布于细胞膜上。其糖胺多糖可分为硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate)、硫酸皮肤素(Dermatan Sulfate)、硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate)及硫酸角质素(Keratan Sulfate)。正常肝脏中硫酸乙酰肝素含量最多，占肝脏总GAG的60%；肝纤维化时其含量下降，而硫酸皮肤素和硫酸软骨素的含量增加。透明质酸(Hyaluronic Acid)是一特殊的多糖，未经硫化亦不含蛋白骨架。近年已将许多蛋白多糖核心蛋白的cDNA克隆出来，对其生物学功能的了解也日趋深入。根据其分布不同大体可将蛋白多糖分为两类：
1.与细胞膜相关的蛋白多糖
其核心蛋白多有跨膜功能区，有的也可经其GAG侧链与细胞膜相连。它们含有大量的硫酸乙酰肝素和少量的硫酸软素，可与细胞外基质、生长因子、细胞粘附分子(CAM)及蛋白酶抑制物结合，使这些物质的活性增强或减弱。
Syndecan产生于肝组织和培养中的肝细胞(Hepatocyte)，是一些细胞间质的受体，可通过其GAG侧链与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原，纤维连结蛋白及细胞粘合素相结合。同时还是bFGF的辅助受体(Coreceptor)。其主要功能是信号传递。
Thrombomodulin由血管内皮细胞产生，其GAG侧链为硫酸软骨素。可与凝血酶结合，抑制纤维蛋白原和因子Ⅴ的激活，从而调节血液凝固过程。
Betaglycan其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。是细胞膜受体，对TGF-β有高亲和力，是它的Ⅲ型受体。
2.与细胞外基质相关的蛋白多糖
它们主要分布于细胞外基质中。
Fibromodulin其GAG侧链为硫酸角质素，可以调节胶原微纤维的形成。在肝脏中尚未发现。
Perlecan由非实质细胞产生，分布于基底膜和胆管、血管。可与内皮细胞和肝细胞结合。
Decorin其 GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸皮肤素。可与Ⅰ、Ⅳ胶原、纤维连结蛋白结合，延缓胶原微纤维的形成。TGF-β可使Decorin的表达增加，而Decorin可使TGF-β灭活。在富含维甲酸的贮脂细胞中Decorin表达较高，因而可抑制TGF-β的活性；而在失去维甲酸的贮脂细胞中，Decorin的表达减少，因而对TGF-β的抑制减弱。
Biglycan其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸皮肤素，由贮脂细胞和肌成纤维细胞产生。通过其核心蛋白与TGF-β结合，通过其GAG与bGFG结合。TGF-β可使其表达增高，而维甲酸可使其表达减低。
Versican其侧链为硫酸软骨素，PDGF和TGF-β可使其表达增加。可与透明质酸结合。尚未确定肝脏细胞是否可产生Versican。
(四)细胞-间质粘附分子(Cell-Matrix Adhension Molecules)
细胞和细胞外基质成份之间的分子相互作用是通过特定的质膜蛋白即各种粘附分子来实现的。一些在其他上皮细胞和内皮细胞上经常表达的粘附分子，在正常肝细胞和血窦内皮细胞中不表达，但在纤维化的发生过程中这些粘附分子的表达呈上调(Upregulation)改变。细胞一间质粘附分子主要包括Integrin家庭和CD44蛋白家庭。
1.Integrin
是由α和β链非共价格结合组成的二聚体，现已知有17种α链和8种β链共组成21种有功能的二聚体。作为受体Integrin可以结合多种配体，而一种细胞外基质成分可由多种Integrin通过不同的识别位点结合。最重要的识别位点是细胞外基质分子中的R-G-D(精-甘-天)序列，大多数Integrin受体皆可识别之。各种Integrin有其特定的组织分布，一种细胞可以存在多种Integrin，其配体识别位点亦可有重叠。在非极性细胞上，Integrin分布于各个面，在极性细胞只分布于其底面和侧面。它们不仅起粘附作用，而且因其细胞内功能区与细胞骨架相连，故可以传递信号，促进细胞的增殖、分化和移行。根据β链可将Integrin分为3个亚族：
β1(10种)、β3(2种)、β4(1种)其主要功能是介导细胞与间质的粘附，分布于大多数体细胞。可与胶原和非胶原糖蛋白结合，尚未发现它们与蛋白多糖结合。
β2(3种)、β7(2种)主要表达与白细胞介导免疫系统内细胞与细胞之间的相互作用。
β6(1种)、β7(1种)、β8(1种)其分布范围局限，功能尚不清楚。
2.CD44蛋白家族
是一类大量糖基化的跨膜蛋白，广泛分布于体细胞，可以介导细胞-细胞，细胞-间质的相互作用。本家族的成员亦很多，在正常状态下，肝细胞内检测不到CD44蛋白的表达，但在血窦内皮细胞中可有表达。
粘附分子在肝纤维化过程中最显著的改变是肝细胞和血窦内皮细胞诱导表达Integrin家族中的层连蛋白受体，而且其表达上调改变早于肝硬化的形成。致纤维化的细胞因子如TGF-β和促进炎症的细胞因子如TGF-α、IL-1β、IFN-γ均可促进Integrin受体和CD44蛋白的高表达。不管其基础疾病如何，Integrin受体的诱导表达情形相似，提示这是一种对细胞相邻细胞外基质成分改变的非特异性反应。Integrin受体的激活可以直接和间接地触发一系列的细胞内事件，如细胞的形态、生化、代谢、分泌、胞浆底物的酪氨酸磷酸化等，提示细胞外基质对于调节肝细胞和血窦内皮细胞的结构和功能起重要作用。在肝纤维化的早期，Integrin受体的表达可能促进细胞外基质在局部的沉积和组织，因而这种细胞-间质粘附分子的表达上调作用不仅是对细胞微环境改变的适应性反应，而且很可能在启动纤维化本身的过程中起主动的作用。
(五)基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMP)
细胞外基质主要被MMP所降解，到目前为止已发现了9种MMP，按其作用底物的不同可分为胶原酶、明胶酶、基质分解素3大组，其底物特异性和细胞来源见表。
表 基质金属蛋白酶的底物特异性和细胞来源
命名
肝脏中细胞来源
作用底物特异性
胶原酶
Ⅲ>Ⅰ，Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ
间质性胶原酶
贮脂细胞
Ⅰ>Ⅲ
中性粒细胞胶原酶
—
明胶酶/Ⅳ性胶原酶
明胶酶A/Ⅳ性胶原酶(72KD)
贮脂细胞
Ⅳ，？Ⅴ，Ⅸ，明胶
明胶酶B/Ⅳ性胶原酶(92KD)
Kuppfer细胞
Ⅳ，Ⅴ，明胶，？Ⅲ
基质分解素
基质分解素-1
贮脂细胞
Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅸ，LN，蛋白多糖，LN，酪蛋白同上
基质分解素-2
—
同上
基质分解素-3
—
尚不清楚
基质分解素(Matrilysin)
—
Ⅳ，蛋白多糖，FN，明胶，弹性硬蛋白
其他
金属弹性酶(Metalloelastase)
—
弹性硬蛋白，Fn
这些基质金属蛋白酶都属于一个基因家族，它们的结构中有数个氨基酸序列高度保守的共同功能区，例如它们都有对于维持酶原潜伏性的前肽功能区(含PRCGVPDV序列)，120个氨基酸的N端功能区以及催化位点的锌结合功能区(含HELGH序列)，基质金属蛋白酶的调节可发生在基因转录调控、无活性酶原的激活及组织抑制物对已被激活酶的抑制三个水平上。
一些生长因子、细胞因子和维甲酸共同调控多种基质金属蛋白酶的表达，有些则特异地对某种基质金属蛋白酶的表达有调控作用。
基质金属蛋白酶是以无活性的酶原形式分泌出来的，必须在细胞外间隙中经过水解激活才能降解细胞外基质。尿激酶纤溶酶原激活物(Urokinase-plasminogen Activator,UPA)或组织纤溶酶原激活物(Tissue-plasminogen Activator,TPA)将纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶再激活基质分解素，部分激活胶原酶前体，而被激活的基质分解素又进一步激活胶原酶。这一激活的瀑布系统受到纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)的调节。合成基质金属蛋白酶的细胞往往同时也合成纤溶酶原激活物抑制因子，以防止基质的过度降解。
(六)金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMP)
已经激活的基质金属蛋白酶在细胞外间隙又受到特异性金属蛋白酶组织抑制因子的调节。现已发现三种TIMP，每种TIMP都可与催化部位直接结合而抑制所有基质金属蛋白酶的活性，但TIMP-1主要抑制间质性胶原酶、基质分解素和明胶酶B(92KD Ⅳ型胶原酶)，TIMP-2主要抑制明胶酶A(72KD Ⅳ型胶原酶)。最近又发现TIMP还能和某些金属蛋白酶原的羧基末端结合而防止其被激活。
(七)细胞因子(Cytokines)和生长因子(Growth Factors)
细胞外基质可作为贮存细胞因子和生长因子的场所，当其他细胞外基质成分发生改变时并通过各种细胞外基质粘附分子对细胞因子的活性起调节作用，细胞因子又可促进其他细胞外基质的合成或降解。
二. 细胞外基质的细胞来源
肝脏细胞(Liver Cells)可分为：①肝实质细胞即肝细胞(Hepatocyte)；②非实质细胞，包括贮脂细胞(Ito细胞)、血窦内皮细胞、Kupffer细胞和陷窝细胞(Pit Cell)。经过体外细胞培养、免疫组织化学及分子原位杂交研究，对细胞外基质的来源有了较多的了解。以前曾认为胶原主要由肝细胞合成，后来发现主要由贮脂细胞产生；而且其他细胞外基质亦主要由贮脂细胞产生。现将细胞外基质的细胞来源归纳于表。
表 细胞外基质的细胞来源
细胞类型
所产生的细胞外基质
肝细胞
Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型胶原，纤维连接蛋白，VN，蛋白多糖
贮脂细胞
Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型胶原，层连蛋白，细胞粘合素，副层连蛋白，蛋白多糖
血窦内皮细胞
Ⅳ型胶原，纤维连接蛋白，血栓粘合素
Kupffer
明胶酶，TIMP
【辅助检查】
一、临床及影像学诊断
任何慢性肝病尤其是慢性病毒性肝炎患者都有发生肝纤维化和肝硬化的可能性，因此对每一个此类患者都要仔细询问病史和进行全面的体格检查，以及早发现早期肝硬化的诊断线索。现代影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像(MRI)等可以发现肝包膜增厚、肝表面轮廓不规则或呈结节状、肝实质的回声不均匀增强或CT值增高、各叶比例改变、脾脏厚度增加及门静脉和脾静脉直径增宽等。采色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。
二、组织病理学检查
到目前为止，经肝穿刺或经腹腔镜肝活检，进行组织病理学检查仍是诊断肝纤维化和肝硬化的“金标准”，1994年国际慢性肝炎新的分级、分期标准建议将肝脏纤维增生作为病情分期的依据，与分级(主要是炎症、坏死的程度)分别评分。国内也提出了相应的分级、分期建议。常规HE染色和各种细胞外基质的组织化学、免疫组织化学甚至分子孙原位杂交技术使我们从肝组织标本中得到期更多的有关肝脏纤维化方面的信息；计算机图像分析等各种技术更能提供定量的资料以便于观察抗纤维化治疗的效果。但是肝活检技术也有其局限性，因为慢性肝炎等病变虽然是弥漫性的，但很难保证一次取材能反映整个肝脏的全貌，尤其是肝纤维化和肝硬化时细针负压肝穿刺难以获得足够的标本给诊断带来一定的困难。为了药物评价，应做到动态系列进行肝活检组织病理学检查。
三、肝纤维化的血清学诊断
鉴于肝脏穿刺组织病理检查的局限性，人们一直致力于寻找血清学指标来监测肝纤维化的发展过程和判断抗纤维化的疗效。理想的肝纤维化血清学指标应具备一些条件：①肝脏特异性高；②能没定肝脏纤维增生或降解的过程，反映肝脏纤维化的程度及肝脏实质和间质结构的紊乱；③不被血窦内皮摄取，不经胆道和肾脏排泄；④测定方法简便易行，敏感性高。实际上现有的测定血清中细胞外基质成分的试验都不完全符合这些条件，但是经过动物实验和临床病理研究发现了不少对判断肝纤维增生有一定价值的指标。总的来说，在动物实验中这些指标和肝脏中相应的细胞外基质成分及其mRNA水平有较好的相关性；在临床研究中这些指标和肝组织病理学纤维化程度也有一定的关联，慢性活动性肝病(所谓慢性活动性肝炎和活动性肝硬化)时高于非活动性肝病(慢性迁延性肝炎和非活动性肝硬化)。但是各组之间有较多的重叠，难以凭一次结果作出肯定的诊断；联合应用多项指标和动态测定可能更有助于判断纤维增生和纤维降解的相对强度。下面仅介绍研究较多的几种肝纤维化血清学指标。
1.血清Ⅰ型胶原(CI)及Ⅰ型前胶原羧基端肽(PICR)
肝脏中Ⅰ型胶原含量较多，在肝纤维化和肝硬化晚期升高明显，血清中含量和肝纤维化程度有较高的相关性，有人建立RIA方法并测定了正常人血清CI的含量的上限为197μg/L(M±2SD)，在急性肝炎不升高，在各种慢性活动性肝病中升高，且与肝脏纤维化积分的相关系数为0.67(P<0.0001)，而与肝脏炎症指数无相关性。在慢性肝炎和酒精性肝病中若血清CI高于300μg/L，则诊断肝硬化的特异性很高。在酒精性肝病患者血清CI升高且停止饮酒后其血清PICP水平降低，而此时血清CI水平无明显变化，提示PICP能反映肝脏纤维增生情况，而CI反映的是肝脏原纤维的沉积。但是，CI和CPCP受骨代谢的影响较大，因而肝脏特异性较差，故限制了其临床应用。
2.血清Ⅲ型胶原(CⅢ)及Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)
国外有人用RIA其所长测定了正常人的血清CⅢ的上40μg/L(M±2SD)，在慢性活动性肝病时升高，其升高可能是新分泌的过量的Ⅲ型胶布原从血窦内皮细胞的间隙漏到血循环。血清中CⅢ水平和肝组织纤维化有相关性(r=0.35,P<0.01)，且和炎症活动也有一定的相关性。国内报道血清CⅢ(PCⅢ)水平和肝组织纤维化程度密切相关(r=0.984,P<0.01)，并有人证明在慢性肝炎和肝硬化患者中血清PCⅢ和PⅢP有相关性(r=0.510)。
这是研究得最多的肝纤维化血清学指标。它是Ⅲ型前胶原分泌到细胞外后被肽酶切下的N端肽，端肽(N，C)切下后才形成胶原分子，相互交联成微纤维。故PⅢNP升高反映的是肝脏纤维增生情况。动物实验表明血清PⅢNP水平升高和肝脏组织中胶原mRNA及TGF-βmRNA水平的升高密切相关；临床研究也发现血清PⅢNP水平和肝脏组织纤维化程度有良好的相关性，是反映肝脏纤维增生的指标。也有人认为它和肝脏炎症活动指数关系更密切，因而在急性肝炎时亦升高；另外它的排泄需要肝血窦内皮细胞的摄取，故在肝功能衰竭时血清中PⅢNP亦升高。临床上应根据具体情况解释测定结果。我们应用德国公司生产的PⅢP RIA药盒(现由日本公司生产)测定了67例各种慢性肝闰伴Ⅰ至Ⅳ级肝纤维化患者的血清PⅢNP水平分别为12.3±3.3ng/ml、17.9±5.5ng/ml、21.5±11.8ng/ml及32.9±12.7ng/ml，表明PⅢP与肝纤维化程度呈正相关。值得注意的是不论是原发性肝癌或是转移性肝癌患者的血清PⅢP水平均明显高于其他慢性肝病患者，故对于慢性肝炎患者如血清PⅢP持续异常升高，应警惕肝癌的可能性。
3.血清Ⅳ型胶原(CⅣ)及Ⅳ胶原羧基端肽(CⅣCP，NCI)和Ⅳ胶原氨基端肽(CⅣ NP，7S)
Ⅳ型胶原在合成代谢过程中不需去除端肽而沉积于细胞外基质，故血中Ⅳ型胶原的含量升高可能反映了肝血窦基底膜的更新率(Turnover)加快。基础和临床研究均发现血清Ⅳ型胶原水平和肝纤维化及门脉高压程度密切相关，与肝脏炎症活动关系较小。
血清CⅣCP(NC1)和CⅣNP(7S)亦与肝纤维化程度相关。因为Ⅳ型胶原在肝血窦、增生的胆管和界板周围基底膜沉积，故血中CⅣCP(NC1)和CⅣNP(7S)的升高反映了基底膜的持续重建(Remodeling)过程中的降解。在肝脏纤维化晚期纤维性胶原(Ⅰ、Ⅲ型胶原)增生不活跃时这些指标仍可增高。
4.血清Ⅳ型胶原(CⅣ)
Ⅳ型胶原分布于大的胶原纤维之间，现已有测定CⅣ的RIA和ELISA方法。分子层析实验证明血清中的检测到的抗原为CⅣ的降解产物，因而它是一项反映间质胶原降解指标，若和反映间质胶原合成的指标PⅢP联合应用能更好地了解纤维增生和纤维分解的平衡情况。本指标的另一特点是不受人体生长的影响，故也适用于儿童患者。但是肾纤维化和全身结缔组织疾病时血清CⅣ升高也很显著，临床上应注意鉴别。
5.血清层连蛋白P1(Lam)
Lam也是基底膜的主要成分，血清Lam水平与肝纤维化程度及门脉-肝静脉压力的Laminin P1 RIA药盒(现由日本公司生产)测定了71例急、慢性肝炎患者的血清Lam，发现慢性活动性肝炎和肝硬化组(3.42±1.13μ/ml，6.58±1.05μ/ml)明显高于慢性迁延性肝炎组(1.23±0.2μ/ml)，且在18例慢性肝病患者中有门脉高压者(8.07±3.95μ/ml)高于无门脉高压者(3.63±1.34μ/ml)，还发现急性肝炎和原发性肝癌血清LamP1也明显升高。这些结果和国外学者的报道基本一致。有人认为商品化药盒所采用的抗原至少有7种成分，而肝脏中只有其中的一、二种，故血清中LamP1水平升高幅度较小而在诊断肝纤维化方面不够敏感。现已有采用单克隆双抗体夹心法的新测定方法，其特异性和敏感性更高。
6.血清透明质酸(HA)
肝纤维化时血清HA水平升高一方面是由于贮脂细胞对其合成增加，别一方面可能是由于肝血窦毛细血管化(内皮细胞失去HA受体)、肝血窦内皮细胞受损伤(失去代谢HA的能力)导致肝脏对血清中的HA摄取和降解减少所致。国外学者发现慢性丙型肝炎患者血清HA水平与肝脏纤维化分级呈正相关(r=0.47,P<0.01)且不受年龄的影响，与肝脏炎症活动指数关系不大；若以90μg/L为界值(Cutt-off)，则诊断出2～3级肝纤维化的特异性为92%，敏感性为55%，而且血清HA随肝纤维化加重或治疗好转而相应升高或降低。国内张鲁榕等首先建立HA的RIA测定方法，在254例肝病患者中发现有慢性活动性肝病者HA升高明显，若以350ng/ml为界值，则诊断肝硬化的敏感性为87.5%。在晚期肝硬化时，由于肝血窦内皮细胞功能更低下，故血清HA值可能更高，此与血清PⅢP等反映活动性肝脏纤维增生的指标不同。
7.血清纤维连续蛋白受体(Fn-R)
Fn-R是Integrin家族的一个成员，肝纤维化时可在肝窦周细胞浆膜和纤维增生区过度表达。日本学者观察到在慢性肝炎、肝硬化、酒精性肝病和肝细胞癌时血清Fn-R明显升高并与组织学纤维化程度一致，认为是较好的肝纤维化血清学指标。
8.粗纤维调节素(Undulin)
粗纤维调节素存在于胶原致密纤维的表面，当胶原结构破坏时，它游离出来而进入血中，故和Ⅳ型胶原一样属于反映胶原降解的指标。
9.细胞粘合素(Tenascin)
细胞粘合素主要分布于肝血窦周间隙，于肝纤维化早期在中央静脉周围、细纤维间隔内及细胞外基质和肝细胞的交界处沉积。可能是一种反映活动性肝纤维增生的指标。
10.金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)
现已有测定血清TIMP-1的ELISA药盒，有人测定了慢性酒精性肝病患者血清TIMP-1，发现其水平和肝纤维化程度有较高的相关性，且在各组慢性肝病之间重叠较少，是一项反映肝脏细胞外基质降解活性低下的指标。
11.其他指标
因为细胞外基质特别是胶原的代谢涉及到许多酶类，故从理论上来说可以通过测定合成和降解胶原的酶类来判断肝脏纤维增生和纤维降解的平衡情况。但是酶活性的测定方法繁琐、影响因素多，且无商品化、标准化的药盒上市，所以尚未在临床得到广泛应用。已经报道过的有赖氨酰氧化酶(Lysy1Oxidase)、血清免疫反应性脯氨酸羟化酶(S-IR-β-PH)、血浆脯氨酸肽酶(Prolidase)及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acety-β-glucosaminidase，NAG)等，在肝纤维化和肝硬化的诊断方面均有一定的意义。至于以前认为是肝硬化指标的单胺氧化酶(MAO)诊断早期肝纤维化的敏感性和特异性均不高，现已不常应用。
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