Prl蛋白酶Cdna片段分离和克隆
蛋白酶在虫生真菌入侵虫体体壁过程中有重要作用，其中以Prl(subtlisin-likeprotease)为主的一组胞外蛋白酶已成为研究的重点。卡地腐霉(Pythiumcarolinianum)是一株灭蚊真菌，具有Prl的编码基因。分离和克隆这一基因，对于研究其灭蚊机制以及利用基因工程对卡地腐霉进行遗传学改良有着十分重要的意义。贵阳医学院生物学教研室的研究者通过实验分离和克隆了卡地腐霉Prl蛋白酶的cDNA片段。
方法：用1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝30小时，抽提菌丝的总RNA；逆转录合成cDNA第一链；根据Prl的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物，以cDNA第一链为模板，用MOPAC方法扩增cDNA；将扩增产物纯化、连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α用于测序。结果：所获片段中，1个530bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性，尤其与真菌Aphanomycesastaci(卵菌纲、水霉目)的Prl在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性，分别为59%和49%。此序列在Genbank数据库的检索号：AF499006。P.car鄄olinianum与A.astaciPrl部分cDNA序列的比对在Genbank数据库的检索号：AY094976，AY094977。
结论：这一DNA片段可能是卡地腐霉Prl蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段，并加以证实。, 百拇医药
方法：用1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝30小时，抽提菌丝的总RNA；逆转录合成cDNA第一链；根据Prl的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物，以cDNA第一链为模板，用MOPAC方法扩增cDNA；将扩增产物纯化、连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α用于测序。结果：所获片段中，1个530bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性，尤其与真菌Aphanomycesastaci(卵菌纲、水霉目)的Prl在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性，分别为59%和49%。此序列在Genbank数据库的检索号：AF499006。P.car鄄olinianum与A.astaciPrl部分cDNA序列的比对在Genbank数据库的检索号：AY094976，AY094977。
结论：这一DNA片段可能是卡地腐霉Prl蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段，并加以证实。, 百拇医药